Padronização de Microrganismos e Micropartículas através da Montagem Sequencial assistida pela Capilaridade

Resumo

Apresentamos uma tecnologia que utiliza o conjunto assistido pela capilaridade em uma plataforma microfluida para padronizar objetos microdimensionados suspensos em um líquido, como bactérias e coloides, em matrizes prescritas em um substrato de polidimetilsiloxano.

Resumo

A padronização controlada de microrganismos em arranjos espaciais definidos oferece possibilidades únicas para uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo estudos de fisiologia microbiana e interações. No nível mais simples, a padronização espacial precisa dos microrganismos permitiria imagens confiáveis e de longo prazo de um grande número de células individuais e transformaria a capacidade de estudar quantitativamente interações micróbios dependentes da distância. Mais exclusivamente, acoplamento preciso da padronização espacial e controle total sobre as condições ambientais, como oferecido pela tecnologia microfluida, forneceria uma plataforma poderosa e versátil para estudos unicelulares em ecologia microbiana.

Este artigo apresenta uma plataforma microfluidica para produzir padrões versáteis e definidos pelo usuário de microrganismos dentro de um canal microfluido, permitindo acesso óptico completo para monitoramento de longo prazo e de alto rendimento. Esta nova tecnologia microfluida é baseada na montagem de partículas assistidas pela capilaridade e explora as forças capilares decorrentes do movimento controlado de uma suspensão evaporando dentro de um canal microfluido para depositar objetos microsized individuais em uma matriz de armadilhas microfabricadas em um substrato polidimetilsiloxano (PDMS). Deposições sequenciais geram o layout espacial desejado de objetos únicos ou múltiplos de micro-tamanho, ditados unicamente pela geometria das armadilhas e pela sequência de enchimento.

A plataforma foi calibrada usando partículas coloidais de diferentes dimensões e materiais: provou ser uma ferramenta poderosa para gerar diversos padrões coloidais e realizar a funcionalidade superficial de partículas presas. Além disso, a plataforma foi testada em células microbianas, utilizando células Escherichia coli como bactéria modelo. Milhares de células individuais foram padronizadas na superfície, e seu crescimento foi monitorado ao longo do tempo. Nesta plataforma, o acoplamento da deposição unicelular e da tecnologia microfluidica permite tanto a padronização geométrica de microrganismos quanto o controle preciso das condições ambientais. Assim, abre uma janela para a fisiologia de micróbios únicos e a ecologia das interações micróbios-micróbios, como mostrado por experimentos preliminares.

Introdução

A padronização espacial de microrganismos únicos, particularmente dentro de arenas experimentais que permitem o controle total sobre as condições ambientais, como dispositivos microfluidos, é altamente desejável em uma ampla gama de contextos. Por exemplo, organizar microrganismos em matrizes regulares permitiria a imagem precisa de um grande número de células individuais e o estudo de seu crescimento, fisiologia, expressão genética em resposta a estímulos ambientais e suscetibilidade de medicamentos. Também permitiria estudar interações célula-células de particular interesse em pesquisa em comunicação celular (por exemplo, sensoriamento de quórum), alimentação cruzada (por exemplo, simbiose alga-bacteriana) ou antagonismo (por exemplo, alopatia), com controle total sobre a localização espacial das células em relação umas às outras. Estudos de fisiologia e evolução ^celular1, estudos de interação ^{célula-célula2}, triagem de diferenciação fenotípica3, monitoramento ^ambiental4 e triagem de ^{medicamentos5} estão entre os campos que podem se beneficiar muito de uma tecnologia capaz de alcançar essa análise quantitativa unicelular.

Várias estratégias para isolar e manusear células únicas têm sido propostas nos últimos anos, desde armadilhas ópticas holográficas6 e métodos heterogêneos de funcionalização de superfície7,8,9,10 até quimiostats11 unicelulares e microfluidos de gotícula12. Esses métodos são tecnicamente muito exigentes ou afetam a fisiologia celular e não fornecem uma plataforma de alto rendimento para padronizar micróbios que podem ser estudados por longos períodos, garantindo resolução unicelular, acesso óptico completo e controle sobre as condições ambientais. O objetivo deste artigo é descrever uma plataforma para padronizar bactérias com precisão micrométrica em arranjos espaciais prescritos em uma superfície PDMS através de montagem assistida por capilaridade. Esta plataforma permite uma padronização espacial precisa e flexível dos micróbios e permite acesso óptico completo e controle sobre as condições ambientais, graças à sua natureza microfluidica.

A tecnologia por trás dessa plataforma é uma tecnologia de montagem desenvolvida nos últimos anos, chamada sCAPA13,14,15 (conjunto de partículas assistidas por capilaridade sequencial) que foi integrada em uma plataforma microfluida16. O menisco de uma gotícula líquida evaporando, enquanto recua sobre um substrato de polidimimetilsiloxano padronizado (PDMS) dentro de um canal microfluido, exerce forças capilares que prendem as partículas coloidais individuais suspensas no líquido em poços micrométricos microfrágidos no substrato (Figura 1A). As partículas suspensas são primeiro transportadas para a interface ar-líquido por correntes convectivas e, em seguida, colocadas nas armadilhas por capilaridade. Forças capilares exercidas pelo ato de menisco em movimento em maior escala em comparação com as forças envolvidas nas interações de partículas.

Assim, o mecanismo de montagem não é influenciado pelo material, dimensões e propriedades superficiais das partículas. Parâmetros como concentração de partículas, velocidade do menisco, temperatura e tensão superficial da suspensão são os únicos parâmetros que influenciam o rendimento do processo de padronização. O leitor pode encontrar uma descrição detalhada da influência dos parâmetros acima mencionados no processo de padronização em 13,14,15. Na tecnologia sCAPA original13,14,15, o processo de padronização coloidal foi realizado em um sistema aberto e exigiu um estágio piezoelétrico de alta precisão para conduzir a suspensão através do modelo. Esta plataforma explora uma estratégia diferente e permite que a padronização seja realizada com equipamentos padrão geralmente utilizados em microfluidos em ambiente controlado, minimizando assim os riscos de contaminar as amostras.

Esta plataforma microfluida foi primeiramente otimizada em partículas coloidais para criar matrizes regulares de partículas inertes e, em seguida, aplicada com sucesso em bactérias. Ambas as plataformas microfluídicas estão descritas neste artigo (Figura 1B,C). A maioria das etapas preparatórias e os equipamentos experimentais descritos no protocolo são comuns para as duas aplicações (Figura 2). Relatamos padronização coloidal para demonstrar que a técnica pode ser usada para realizar múltiplas deposições sequenciais na mesma superfície para criar padrões complexos e multimateriais. Em particular, uma única partícula foi depositada por armadilha para cada passo para formar matrizes coloidais com uma geometria e composição específicas, ditadas unicamente pela geometria e sequência de enchimento das armadilhas. Quanto à padronização bacteriana, são descritos depoimentos únicos, resultando em uma bactéria sendo depositada por armadilha. Uma vez que as células são padronizadas na superfície, o canal microfluido é lavado com meio para promover o crescimento bacteriano, a etapa preliminar de qualquer estudo unicelular.

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Protocolo

1. Preparação do mestre do silício

NOTA: Os modelos PDMS com as armadilhas microfráricas que formam o modelo de padronização coloidal e microbiana foram fabricados de acordo com o método introduzido por Geissler et al. ^{17 anos}. O mestre de silício foi preparado por litografia convencional em uma sala de limpeza. Veja as etapas a seguir para o procedimento e a Tabela de Materiais para o equipamento.

1. Projete os recursos usando o software CAD (Computer-Aided Design, design auxiliado por computador).
2. Prepare a máscara de vidro cromado com uma camada de fotoresist positivo expondo as características projetadas com um laser uv escritor.
   1. Desenvolva a máscara de vidro cromado com um desenvolvedor de spin usando um desenvolvedor em 1:4 fotoresist para relação água para 15 s.
   2. Mergulhe a máscara em etchant de cromo por 50 s.
   3. Estedo de plasma um wafer de silício de 10 cm por 3 min a 600 W.
   4. Deposite uma camada de hexametiletiladisilizane e asse a 110 °C para melhorar a adesão ao fotoresist.
   5. Deposite uma camada de fotoresist a 4.500 × g por 2 min.
   6. Exponha o recurso ao UV através da máscara de vidro cromado com um alinhador de máscara para 2 s e desenvolva-se com um desenvolvedor quanto à máscara.
3. Para completar a fabricação do mestre de silício, etch o wafer através de uma troca de íons reativas profundas, ajustando o tempo de gravação (<2 min) para alcançar a profundidade desejada (medido com um perfil.

2. Preparação do molde de microcanal

1. Projete o canal com software CAD e corte-o com um software fatiador para converter o modelo projetado em instruções para a impressora 3D, definindo a distância de corte em 0,05 mm.
2. Imprima o canal com uma impressora 3D por ~1 h.
3. Lave e poste o molde em uma máquina de cura e lavagem dedicada.
   1. Coloque o molde em um recipiente cheio de álcool isopropílico puro (IPA) e vórtice do líquido (lave por 20 minutos). Tire o recipiente cheio de IPA da máquina.
   2. Uma vez que o molde lavado seja removido do recipiente IPA, coloque-o de volta na máquina de lavar e curar e colocá-lo por 15 min a 35 °C.
      NOTA: A Tabela de Materiais informa a impressora 3D e a máquina de cura e lavagem utilizada no protocolo de preparação do molde. O modelo 3D foi fatiado com o software cortador proprietário da impressora 3D.
4. Coloque a impressão em forno UV por 12 h e coloque-a em forno a 80 °C por 12 h.
   NOTA: Esta etapa garante que todo o polímero esteja curado e que todo o polímero não curado seja removido da impressão, pois impediria a cura do PDMS.
5. Silanize o molde através da deposição de vapor de Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano.
   1. Coloque o molde 3D em um dessecador a vácuo junto com 20 μL de Trichloro 100% concentrado (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) tubulação de silano em uma folha de alumínio colocada perto do molde.
   2. Crie um vácuo no desiccator para gerar vapor e deixe por 40 minutos.
   3. Retire o molde do desiccador e enxágue-o com etanol puro antes de derramar PDMS sobre ele.

3. Fabricação do chip microfluido

1. Prepare uma mistura de PDMS misturando o elastômero com seu agente de crosslinking (Tabela de Materiais). Mexa a mistura vigorosamente para misturar os dois componentes uniformemente até que as bolhas de ar sejam formadas, e a mistura PDMS parece opaca.
   NOTA: A quantidade de cross-linker deve ser de 10% em peso da quantidade de elastômero.
2. Desgas a mistura de elastômero e agente de crosslinking em um dessecador de vácuo para remover as bolhas de ar presas. Transfira a mistura no desiccador para o recipiente utilizado para a mistura (etapa 3.1). Continue o processo de desgaseamento até que todas as bolhas tenham sido removidas e a mistura pareça transparente novamente.
   NOTA: O tempo normalmente necessário para a profecimento é de 30 minutos.
3. Despeje 3 g da mistura no mestre do silício para produzir o modelo, que servirá como o "piso" do chip microfluido.
   NOTA: A espessura da camada PDMS pode ser ajustada alterando a quantidade de mistura derramada no mestre do silício.
   1. Para obter um modelo de 400 μm de espessura, despeje 3 g de PDMS no mestre do silício, coloque o mestre de silício em um reveste de spin e gire em 21 × g para 5 s e 54 × g por 10 s, e depois degas novamente como descrito na etapa 3.2 para remover bolhas de ar presas.
4. Despeje 20 g da mistura PDMS no molde impresso em 3D para fazer o microcanal, que servirá como o "teto" do chip microfluido, e desgas-lo como descrito na etapa 3.2 por 30 min.
5. Asse tanto o wafer de silício quanto o molde impresso em 3D a 70 °C por pelo menos 2 h.
6. Retire a camada PDMS do molde impresso em 3D, corte o PDMS com uma lâmina ao redor dos microcanais e faça os orifícios que servirão de entrada e saída do canal microfluido.
7. Retire o PDMS do mestre do silício e corte a camada PDMS em pedaços menores com as mesmas dimensões dos canais microfluidos que serão ligados em cima dos modelos.
8. Esfregue suavemente os modelos e microcanais usando uma solução de detergente de 1% (veja a Tabela de Materiais) por 5 minutos e depois enxágue com água desionizada. Em seguida, enxágüe os modelos e microcanais com isopropanol e enxágue-os com água deionizada. Seque os modelos e microcanais à temperatura ambiente por 1 minuto com ar comprimido em 1 bar.
9. Coloque os modelos e os microcanais em um limpador de plasma com as superfícies a serem ligadas de frente para cima. Ligue o limpador de plasma, e o plasma trate os modelos e os microcanais por 40 s. Retire-os do limpador de plasma e ligue imediatamente os microcanais em cima dos modelos, colocando-os em contato uns com os outros.
10. Armazene os chips microfluidos em um forno a 70 °C durante cinco dias para garantir a recuperação hidrofóbica do PDMS e tenha um ângulo de contato recuando dentro da faixa ideal, entre 30 e 60°^10,11.

4. Padronização bacteriana

1. Um dia antes do experimento, cresce uma população de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular a cultura diretamente do estoque congelado e crescer durante a noite por 20 h em caldo de lysogeny (LB) médio em uma incubadora shaker a 37 °C. Adicione 50 μg/mL de kanamicina para que as células mantenham o plasmídeo prpsM-GFP.
2. No dia do experimento, coloque a incubadora da caixa (Figura 2A) a 37 °C várias horas antes do experimento para ter uma temperatura uniforme e estável antes de iniciar o experimento. Configure a bomba de seringa e a placa de vidro aquecida no estágio do microscópio (Figura 2B,C), definindo a temperatura na mesma temperatura da incubadora da caixa.
   NOTA: A incubadora da caixa em que todo o sistema, incluindo o microscópio (Figura 2E), é fechado garante que uma temperatura uniforme e constante seja mantida durante todo o experimento quando o canal estiver lavado com meio.
3. Noventa minutos antes do experimento, coloque o chip microfluido em um navio cheio de 100% de etanol (EtOH) e lave o canal com 100% de EtOH por pelo menos 10 minutos. Coloque o chip microfluido em um desiccador a vácuo e degas por pelo menos 30 minutos. Troque o EtOH com água destilada e trate o chip por pelo menos 30 minutos. Coloque o chip microfluido no forno a 70 °C por 10 minutos para remover quaisquer vestígios de líquido deixados no canal.
   NOTA: Esta etapa é necessária para evitar a formação de bolhas no canal quando lavada com meio de cultura. Este protocolo de prevenção de bolhas foi adaptado de Wang et ^al.18.
4. Pipeta 1 mL de 3-(N-morpholino)ácido propanesulfônico (MOPS) médio (1x) em um frasco de centrífuga e adicionar 10 μL de fosfato de potássio de 0,132 M (_K2HPO4). Tire a cultura da noite para o dia da incubadora de 37 °C e aliquot 100 μL no frasco de centrífugas e centrífuga a cultura a 2.300 × g por 2 min. Pipeta suavemente o supernatante dos frascos de centrífugas, e resuspenque a pelota em 1 mL de mops fresco médio com 0,015% v/v de Tween 20 e 0,01% v/v de fosfato de potássio.
   NOTA: A concentração típica da suspensão bacteriana está na faixa de 0,015-0,15 vol%, o que garante a formação de uma zona de acumulação estendida e móvel e impede o acúmulo de partículas no substrato. Substituir o meio noturno por meio fresco minimiza os riscos de lançar filmes de bactérias no modelo. A falta de fonte de carbono no meio fresco impede que as células cresçam na suspensão durante a padronização do modelo. É necessária uma concentração de 0,015% v/v de Tween 20 na suspensão para que o ângulo de contato do líquido recuado no modelo PDMS fique dentro da faixa ideal, entre 30 e 60°.
5. Carregue a suspensão bacteriana em uma seringa de 1 mL e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos.
   1. Para fixar a conexão entre a seringa e a tubulação, insira diretamente uma agulha com um diâmetro externo de 0,6 mm na tubulação. Para evitar dispersar qualquer suspensão remanescente nas proximidades do canal, lave o meio fresco através do orifício usado como saída durante o processo de padronização (Figura 3A-III), em vez do orifício usado como entrada.
   2. Monte a seringa na bomba de seringa e injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada na parte upstream do canal até que a suspensão cubra a região do modelo com armadilhas.
      NOTA: Durante o processo de injeção de líquido, o ar pode escapar através de uma tomada localizada na extremidade a jusante do canal.
   3. Defina a bomba de seringa para retirar a suspensão bacteriana (Figura 3A-I) a uma taxa de fluxo de 0,07-0,2 μL/min, que na geometria descrita corresponde a uma velocidade de recuo do menisco de 80-100 μm/min.
   4. Monitore o processo de padronização através de software de microscópio.
      NOTA: Aqui, uma ampliação de 10x foi usada para monitorar o menisco recuando no modelo, e uma ampliação de 20x foi usada para monitorar a deposição de bactérias individuais nas armadilhas microfrágidas.
6. Uma vez que o modelo tenha sido padronizado com células (Figura 3A-II), aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluido e lavá-lo com LB fresco que foi anteriormente desgassed por pelo menos 30 min e pré-equipado a 30 °C.
7. Coloque a bomba de seringa a uma vazão de 2 μL/min para lavar suavemente o canal. Uma vez preenchido o canal, aumente a taxa de fluxo (15 μL/min) de acordo com as necessidades experimentais específicas.
8. Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação desejada e intervalo de tempo.

5. Padronização coloidal

1. Pipeta 900 μL de uma solução aquosa v/v 20 de 0,015% v/v Tween 20 em um frasco de centrífugas e pipeta 100 μL da suspensão coloidal original nele. Centrifugar a suspensão a 13.500 × g por 1 min. Remova suavemente o supernatante e substitua-o pela solução aquosa Tween 20 (0,015% v/v). Repita este processo três vezes para garantir a substituição completa do solvente do fornecedor da suspensão do estoque.
2. Carregue a suspensão coloidal em uma seringa de 1 mL e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos. Injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada dentro da seção central, na parte upstream do canal, e empurre gradualmente a suspensão até que o modelo esteja coberto.
3. Retire a suspensão coloidal a uma taxa de fluxo de 0,07-0,2 μL/min, o que corresponde a uma velocidade de recuo do menisco de 1-2 μm/min, e imagem do processo de padronização via software de microscópio. Use a ampliação de 10x para monitorar o menisco recuando no modelo e a ampliação de 20x para observar a deposição de partículas individuais nas armadilhas microfrágicadas. Aumente a taxa de fluxo assim que o menisco chegar ao final do modelo para esvaziar o canal rapidamente.
   NOTA: Matrizes coloidais compostas de várias partículas podem ser produzidas executando o processo de padronização das etapas 5.1 a 5.3 em série. O canal é carregado com uma nova suspensão coloidal em cada iteração de acordo com a composição das matrizes coloidais desejadas. Cada passo de padronização adiciona uma partícula à matriz coloidal e pode ser executada sequencialmente até que as armadilhas tenham sido preenchidas com a sequência das partículas desejadas. A composição das matrizes coloidais resultantes é dada unicamente pela sequência de suspensões coloidais usadas para preencher as armadilhas (Figura 3B).

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Resultados

Uma plataforma microfluida que explora o conjunto assistido pela capilaridade para padronizar partículas coloidais e bactérias em armadilhas microfíbridas em um modelo PDMS foi desenvolvida. Duas geometrias de canais diferentes foram projetadas para otimizar a padronização de coloides e bactérias através do conjunto assistido pela capilaridade. A geometria do primeiro canal (Figura 1B) consiste em três seções paralelas de 23 mm de comprimento sem barreira física entre eles. As dua...

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Discussão

A plataforma microfluida descrita aqui permite a padronização de objetos micro-tamanhos, como coloides e bactérias, em arranjos espaciais prescritos em um substrato PDMS. O controle total sobre as condições ambientais oferecidos pelos microfluidos e a capacidade de padronizar células com precisão micrométrica concedida pela tecnologia sCAPA torna-a uma plataforma muito promissora para futuros estudos de fisiologia e ecologia.

Nos experimentos apresentados neste trabalho, o mestre de si...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		deep reactive ion exchange system
Alconox			detergent
AZ400K developer	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator	Life Imaging Services		used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge	Eppendorf	5424R	used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		heated glass plate
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout	Opensource		used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		microscope
openSCAD	Opensource		used to design the mold
OPTIspin SB20	ATM group	51-0002-01-00	spin developer
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786	added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S	Prusa		used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough	Prusa Research a.s.		UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer	Prusa		used to print the mold
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	448931	used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		vacuum spin coater