Modelage de micro-organismes et de microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité

Résumé

Nous présentons une technologie qui utilise l’assemblage assisté par capillarité dans une plate-forme microfluidique pour modeler des objets de taille micro en suspension dans un liquide, tels que des bactéries et des colloïdes, dans des réseaux prescrits sur un substrat de polydiméthylsiloxane.

Résumé

La modelage contrôlé des micro-organismes dans des arrangements spatiaux définis offre des possibilités uniques pour un large éventail d’applications biologiques, y compris des études de la physiologie microbienne et des interactions. Au niveau le plus simple, une modélisation spatiale précise des micro-organismes permettrait une imagerie fiable et à long terme d’un grand nombre de cellules individuelles et transformerait la capacité d’étudier quantitativement les interactions microbe-microbe dépendantes de la distance. De manière plus unique, le couplage d’une modélisation spatiale précise et d’un contrôle total des conditions environnementales, tel qu’offert par la technologie microfluidique, fournirait une plate-forme puissante et polyvalente pour les études unicellulaires en écologie microbienne.

Cet article présente une plate-forme microfluidique pour produire des modèles polyvalents et définis par l’utilisateur de micro-organismes dans un canal microfluidique, permettant un accès optique complet pour une surveillance à long terme et à haut débit. Cette nouvelle technologie microfluidique est basée sur l’assemblage de particules assisté par capillarité et exploite les forces capillaires résultant du mouvement contrôlé d’une suspension d’évaporation à l’intérieur d’un canal microfluidique pour déposer des objets microdimensionnels individuels dans un réseau de pièges microfabriqués sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS). Les dépôts séquentiels génèrent la disposition spatiale souhaitée d’un ou de plusieurs types d’objets de micro-taille, dictée uniquement par la géométrie des pièges et la séquence de remplissage.

La plate-forme a été calibrée à l’aide de particules colloïdales de différentes dimensions et matériaux: elle s’est avérée être un outil puissant pour générer divers motifs colloïdaux et effectuer la fonctionnalisation de surface des particules piégées. En outre, la plate-forme a été testée sur des cellules microbiennes, en utilisant des cellules d’Escherichia coli comme bactérie modèle. Des milliers de cellules individuelles ont été modelées à la surface et leur croissance a été surveillée au fil du temps. Dans cette plate-forme, le couplage du dépôt unicellulaire et de la technologie microfluidique permet à la fois la modélisation géométrique des micro-organismes et le contrôle précis des conditions environnementales. Il ouvre ainsi une fenêtre sur la physiologie des microbes isolés et l’écologie des interactions microbe-microbe, comme le montrent des expériences préliminaires.

Introduction

La modélisation spatiale de micro-organismes uniques, en particulier dans les arènes expérimentales qui permettent un contrôle total des conditions environnementales, telles que les dispositifs microfluidiques, est hautement souhaitable dans un large éventail de contextes. Par exemple, organiser les micro-organismes en réseaux réguliers permettrait l’imagerie précise d’un grand nombre de cellules individuelles et l’étude de leur croissance, de leur physiologie, de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux et de leur susceptibilité aux médicaments. Il permettrait également d’étudier les interactions cellule-cellule présentant un intérêt particulier dans la recherche sur la communication cellulaire (p. ex., la détection du quorum), l’alimentation croisée (p. ex., symbiose algale-bactérienne) ou l’antagonisme (p. ex., l’allélopathie), avec un contrôle total sur la localisation spatiale des cellules les unes par rapport aux autres. Les études de physiologie et d’évolution ^cellulaire1, les études d’interaction ^{cellule-cellule2}, le dépistage de la différenciation phénotypique3, la surveillance de l’environnement4 et le dépistage des ^{médicaments5} font partie des domaines qui peuvent grandement bénéficier d’une technologie capable de réaliser une telle analyse quantitative unicellulaire.

Plusieurs stratégies pour isoler et manipuler des cellules individuelles ont été proposées au cours des dernières années, allant des pièges optiques holographiques6 et ^{des méthodes de} fonctionnalisation de surface ^{hétérogène7,8,9,10} aux chimiostats unicellulaires11 et à la microfluidique des gouttelettes12. Ces méthodes sont soit techniquement très exigeantes, soit affectent la physiologie cellulaire et ne parviennent pas à fournir une plate-forme à haut débit pour modéliser des microbes qui peuvent être étudiés sur de longues périodes, assurant une résolution d’une seule cellule, un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales. L’objectif de cet article est de décrire une plate-forme permettant de modeler les bactéries avec une précision micrométrique dans des arrangements spatiaux prescrits sur une surface PDMS grâce à un assemblage assisté par capillarité. Cette plate-forme permet une modélisation spatiale précise et flexible des microbes et permet un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales, grâce à sa nature microfluidique.

La technologie derrière cette plate-forme est une technologie d’assemblage développée ces dernières années, nommée sCAPA13,14,15 (assemblage séquentiel de particules assistées par capillarité) qui a été intégrée dans une plate-forme microfluidique16. Le ménisque d’une gouttelette liquide en évaporation, tout en reculant sur un substrat de polydiméthylsiloxane à motifs (PDMS) à l’intérieur d’un canal microfluidique, exerce des forces capillaires qui piègent les particules colloïdales individuelles en suspension dans le liquide dans des puits micrométriques microfabriqués sur le substrat (Figure 1A). Les particules en suspension sont d’abord transportées vers l’interface air-liquide par des courants convectifs, puis placées dans les pièges par capillarité. Les forces capillaires exercées par le ménisque en mouvement agissent à plus grande échelle par rapport aux forces impliquées dans les interactions des particules.

Ainsi, le mécanisme d’assemblage n’est pas influencé par le matériau, les dimensions et les propriétés de surface des particules. Des paramètres tels que la concentration en particules, la vitesse du ménisque, la température et la tension superficielle de la suspension sont les seuls paramètres qui influencent le rendement du processus de modelage. Le lecteur peut trouver une description détaillée de l’influence des paramètres susmentionnés sur le processus de modelage dans 13,14,15. Dans la technologie sCAPA d’origine13,14,15, le processus de modelage colloïdal était effectué dans un système ouvert et nécessitait un étage piézoélectrique de haute précision pour entraîner la suspension à travers le gabarit. Cette plateforme exploite une stratégie différente et permet d’effectuer le modelage avec des équipements standards généralement utilisés en microfluidique dans un environnement contrôlé, minimisant ainsi les risques de contamination des échantillons.

Cette plate-forme microfluidique a d’abord été optimisée sur des particules colloïdales pour créer des réseaux réguliers de particules inertes, puis appliquée avec succès aux bactéries. Les deux plateformes microfluidiques sont décrites dans cet article (Figure 1B,C). La plupart des étapes préparatoires et de l’équipement expérimental décrits dans le protocole sont communs pour les deux applications (Figure 2). Nous rapportons des motifs colloïdaux pour démontrer que la technique peut être utilisée pour effectuer plusieurs dépôts séquentiels sur la même surface afin de créer des motifs complexes et multimatériaux. En particulier, une seule particule a été déposée par piège pour chaque étape afin de former des réseaux colloïdaux avec une géométrie et une composition spécifiques, uniquement dictées par la géométrie et la séquence de remplissage des pièges. En ce qui concerne les motifs bactériens, des dépôts uniques sont décrits, ce qui entraîne le dépôt d’une bactérie par piège. Une fois que les cellules sont modelées à la surface, le canal microfluidique est rincé avec un milieu pour favoriser la croissance bactérienne, l’étape préliminaire de toute étude unicellulaire.

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Protocole

1. Préparation du maître de silicium

REMARQUE: Les modèles PDMS portant les pièges microfabriqués qui forment le modèle pour les motifs colloïdaux et microbiens ont été fabriqués selon la méthode introduite par Geissler et al. ¹⁷. Le maître de silicium a été préparé par lithographie conventionnelle dans une salle blanche. Reportez-vous aux étapes suivantes pour la procédure et à la table des matériaux pour l’équipement.

1. Concevez les fonctionnalités à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
2. Préparez le masque en verre chromé avec une couche de résine photosensible positive en exposant les caractéristiques conçues avec un enregistreur laser direct UV.
   1. Développez le masque chrome-verre avec un développeur de spin en utilisant un développeur au rapport photorésine / eau de 1: 4 pendant 15 s.
   2. Immerger le masque dans un éthographe au chrome pendant 50 s.
   3. Traiter au plasma une plaquette de silicium de 10 cm pendant 3 min à 600 W.
   4. Déposer à la vapeur une couche d’hexaméthyldisilizane et cuire au four à 110 °C pour améliorer l’adhérence vers la résine photosensible.
   5. Déposez une couche de résine photosensible à 4 500 × g pendant 2 min.
   6. Exposez la fonction aux UV à travers le masque en verre chromé avec un aligneur de masque pendant 2 s et développez-la avec un développeur comme pour le masque.
3. Pour compléter la fabrication du maître de silicium, gravez la plaquette via un échange d’ions réactif profond, en ajustant le temps de gravure (<2 min) pour atteindre la profondeur souhaitée (mesurée avec un profilomètre).

2. Préparation de moules à microcanaux

1. Concevez le canal avec un logiciel de CAO et découpez-le avec un logiciel de découpe pour convertir le modèle conçu en instructions pour l’imprimante 3D, en réglant la distance de découpage à 0,05 mm.
2. Imprimez le canal avec une imprimante 3D pendant environ 1 h.
3. Lavez et postcurez le moule dans une machine à durcir et à laver dédiée.
   1. Mettez le moule dans un récipient rempli d’alcool isopropylique pur (IPA) et vortexez le liquide (laver pendant 20 min). Sortez le récipient rempli d’IPA de la machine.
   2. Une fois le moule lavé retiré du récipient IPA, remettez-le dans la machine à laver et à durcir et postcurez-le pendant 15 min à 35 °C.
      REMARQUE: La table des matériaux indique l’imprimante 3D et la machine de durcissement et de lavage utilisée dans le protocole de préparation du moule. Le modèle 3D a été découpé avec le logiciel de découpe propriétaire de l’imprimante 3D.
4. Placez l’impression dans un four UV pendant 12 h et placez-la dans un four à 80 °C pendant 12 h.
   REMARQUE: Cette étape garantit que tout le polymère est durci et que tout le polymère non durci est retiré de l’impression, car cela empêcherait le durcissement du PDMS.
5. Silaniser le moule par dépôt en phase vapeur de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane.
   1. Placez le moule 3D dans un dessiccateur sous vide avec 20 μL de trichloro concentré à 100% (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane pipeté sur une feuille d’aluminium placée près du moule.
   2. Créez un vide dans le dessiccateur pour générer de la vapeur et laissez agir pendant 40 min.
   3. Retirez le moule du dessiccateur et rincez-le avec de l’éthanol pur avant de verser du PDMS dessus.

3. Fabrication de la puce microfluidique

1. Préparer un mélange PDMS en mélangeant l’élastomère avec son agent de réticulation (Table des matériaux). Remuez vigoureusement le mélange pour mélanger les deux composants uniformément jusqu’à ce que des bulles d’air se forment et que le mélange PDMS semble opaque.
   REMARQUE: La quantité de réticulation doit être de 10% en poids de la quantité d’élastomère.
2. Dégazez le mélange d’élastomère et d’agent de réticulation dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bulles d’air piégées. Transférer le mélange dans le dessiccateur dans le récipient utilisé pour le mélange (étape 3.1). Continuez le processus de dégazage jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées et que le mélange ait à nouveau l’air transparent.
   REMARQUE: Le temps généralement requis pour la dessiccation est de 30 min.
3. Versez 3 g du mélange sur le maître de silicium pour produire le gabarit, qui servira de « plancher » de la puce microfluidique.
   REMARQUE: L’épaisseur de la couche PDMS peut être réglée en modifiant la quantité de mélange versée sur le maître de silicium.
   1. Pour obtenir un gabarit de 400 μm d’épaisseur, versez 3 g de PDMS sur le maître de silicium, placez le maître de silicium sur un enduit de spin et faites tourner le manteau à 21 × g pendant 5 s et 54 × g pendant 10 s, puis dégazez à nouveau comme décrit à l’étape 3.2 pour éliminer les bulles d’air piégées.
4. Versez 20 g du mélange PDMS sur le moule imprimé en 3D pour fabriquer le microcanal, qui servira de « toit » de la puce microfluidique, et dégazez-le comme décrit à l’étape 3.2 pendant 30 min.
5. Cuire la plaquette de silicium et le moule imprimé en 3D à 70 °C pendant au moins 2 h.
6. Décollez la couche PDMS du moule imprimé en 3D, coupez le PDMS avec une lame autour des microcanaux et percez les trous qui serviront d’entrée et de sortie du canal microfluidique.
7. Retirez le PDMS du maître de silicium et coupez la couche PDMS en morceaux plus petits avec les mêmes dimensions que les canaux microfluidiques qui seront collés sur les gabarits.
8. Frottez doucement les gabarits et les microcanaux à l’aide d’une solution détergente à 1% (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min, puis rincez à l’eau désionisée. Ensuite, rincez les gabarits et les microcanaux avec de l’isopropanol et rincez-les à l’eau désionisée. Sécher les gabarits et les microcanaux à température ambiante pendant 1 min avec de l’air comprimé à 1 bar.
9. Placez les gabarits et les microcanaux dans un nettoyeur plasma avec les surfaces à coller vers le haut. Allumez le nettoyeur plasma et traitez les modèles et les microcanaux au plasma pendant 40 s. Retirez-les du nettoyeur plasma et liez immédiatement les microcanaux au-dessus des gabarits en les mettant en contact les uns avec les autres.
10. Conservez les puces microfluidiques dans un four à 70 °C pendant cinq jours pour assurer la récupération hydrophobe du PDMS et avoir un angle de contact en recul dans la plage optimale, entre 30 et 60 °^10,11.

4. Motif bactérien

1. Un jour avant l’expérience, développer une population d’Escherichia coli (souche MG1655 prpsM-GFP). Inoculer la culture directement à partir du bouillon congelé et faire pousser pendant la nuit pendant 20 h dans un bouillon de lysogénie (LB) dans un incubateur agitateur à 37 °C. Ajouter 50 μg/mL de kanamycine pour que les cellules retiennent le plasmide prpsM-GFP.
2. Le jour de l’expérience, réglez l’incubateur de boîte (Figure 2A) à 37 °C plusieurs heures avant l’expérience pour avoir une température uniforme et stable avant de commencer l’expérience. Installez la pompe à seringue et la plaque de verre chauffée sur l’étage du microscope (Figure 2B, C), en réglant la température à la même température que l’incubateur de boîte.
   REMARQUE: L’incubateur de boîte dans lequel l’ensemble du système, y compris le microscope (Figure 2E), est enfermé garantit qu’une température uniforme et constante est maintenue tout au long de l’expérience lorsque le canal est rincé avec du milieu.
3. Quatre-vingt-dix minutes avant l’expérience, placez la puce microfluidique dans un récipient rempli de 100% d’éthanol (EtOH) et rincez le canal avec 100% d’EtOH pendant au moins 10 min. Placez la puce microfluidique dans un dessiccateur sous vide et dégazez pendant au moins 30 min. Échangez l’EtOH avec de l’eau distillée et traitez la puce sous vide pendant au moins 30 min. Mettez la puce microfluidique dans le four à 70 °C pendant 10 min pour éliminer toute trace de liquide laissée dans le canal.
   REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour empêcher la formation de bulles dans le canal lorsqu’il est rincé avec un milieu de culture. Ce protocole de prévention des bulles a été adapté de Wang et ^al.18.
4. Pipette 1 mL de milieu d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) (1x) dans un flacon de centrifugeuse et ajouter 10 μL de phosphate de potassium 0,132 M (_K2HPO4). Sortir la culture de nuit de l’incubateur à 37 °C et aliquoter 100 μL dans le flacon de centrifugeuse et centrifuger la culture à 2 300 × g pendant 2 min. Pipeter doucement le surnageant hors des flacons de centrifugeuse et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu MOPS frais avec 0,015 % v/v de Tween 20 et 0,01 % v/v de phosphate de potassium.
   REMARQUE: La concentration typique de la suspension bactérienne est comprise entre 0,015 et 0,15 vol%, ce qui assure la formation d’une zone d’accumulation étendue et mobile et empêche l’accumulation de particules sur le substrat. Le remplacement du milieu de nuit par un milieu frais minimise les risques de libération de films de bactéries sur le gabarit. Le manque de source de carbone dans le milieu frais empêche les cellules de se développer dans la suspension pendant le modelage du gabarit. Une concentration de 0,015 % v/v de Tween 20 dans la suspension est nécessaire pour que l’angle de contact du liquide en recul sur le gabarit PDMS se situe dans la plage optimale, entre 30 et 60°.
5. Chargez la suspension bactérienne dans une seringue de 1 mL et connectez la seringue à la puce à travers un tube microfluidique.
   1. Pour fixer la connexion entre la seringue et le tube, insérez directement une aiguille d’un diamètre extérieur de 0,6 mm dans le tube. Pour éviter de disperser toute suspension restant dans le voisinage de l’entrée à travers le canal, rincer le milieu frais à travers le trou utilisé comme sortie pendant le processus de modelage (figure 3A-III), plutôt que le trou utilisé comme entrée.
   2. Montez la seringue sur la pompe à seringue et injectez la suspension dans la puce microfluidique par l’entrée située dans la partie amont du canal jusqu’à ce que la suspension recouvre la région du gabarit avec des pièges.
      REMARQUE: Pendant le processus d’injection de liquide, l’air peut s’échapper par une sortie située à l’extrémité aval du canal.
   3. Réglez la pompe à seringue pour prélever la suspension bactérienne (figure 3A-I) à un débit de 0,07-0,2 μL/min, ce qui, dans la géométrie décrite, correspond à une vitesse de recul du ménisque de 80 à 100 μm/min.
   4. Surveillez le processus de modelage via un logiciel de microscope.
      REMARQUE: Ici, un grossissement de 10x a été utilisé pour surveiller le ménisque en recul sur le gabarit, et un grossissement de 20x a été utilisé pour surveiller le dépôt de bactéries individuelles dans les pièges microfabriqués.
6. Une fois que le gabarit a été modelé avec des cellules (Figure 3A-II), augmentez le débit de retrait pour vider rapidement le canal microfluidique et rincez-le avec du LB frais qui a été préalablement dégazé pendant au moins 30 min et préavertissé à 30 °C.
7. Réglez la pompe à seringue à un débit de 2 μL/min pour rincer doucement le canal. Une fois le canal rempli, augmenter le débit (15 μL/min) en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
8. Acquérir des images de bactéries en croissance au grossissement et à l’intervalle de temps souhaités.

5. Motifs colloïdaux

1. Pipette 900 μL d’une solution aqueuse Tween 20 à 0,015 % v/v dans un flacon de centrifugeuse et pipette 100 μL de la suspension colloïdale d’origine. Centrifuger la suspension à 13 500 × g pendant 1 min. Retirez délicatement le surnageant et remplacez-le par la solution aqueuse Tween 20 (0,015 % v/v). Répétez ce processus trois fois pour assurer le remplacement complet du solvant du fournisseur de la suspension de stock.
2. Chargez la suspension colloïdale dans une seringue de 1 mL et connectez la seringue à la puce à travers un tube microfluidique. Injecter la suspension dans la puce microfluidique à travers l’entrée située dans la section centrale, dans la partie amont du canal, et pousser progressivement la suspension jusqu’à ce que le gabarit soit recouvert.
3. Prélever la suspension colloïdale à un débit de 0,07-0,2 μL/min, ce qui correspond à une vitesse de recul du ménisque de 1-2 μm/min, et imager le processus de modelage via un logiciel de microscope. Utilisez un grossissement de 10x pour surveiller le ménisque en recul sur le gabarit et un grossissement de 20x pour observer le dépôt de particules individuelles dans les pièges microfabriqués. Augmentez le débit une fois que le ménisque atteint la fin du gabarit pour vider le canal rapidement.
   REMARQUE: Des réseaux colloïdaux composés de plusieurs particules peuvent être produits en exécutant le processus de modelage des étapes 5.1 à 5.3 en série. Le canal est chargé d’une nouvelle suspension colloïdale à chaque itération en fonction de la composition des réseaux colloïdaux souhaités. Chaque étape de modelage ajoute une particule au réseau colloïdal et peut être exécutée séquentiellement jusqu’à ce que les pièges aient été remplis avec la séquence de particules souhaitée. La composition des réseaux colloïdaux résultants est uniquement donnée par la séquence de suspensions colloïdales utilisées pour remplir les pièges (Figure 3B).

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Résultats

Une plate-forme microfluidique qui exploite l’assemblage assisté par capillarité pour modeler des particules colloïdales et des bactéries dans des pièges microfabriqués sur un modèle PDMS a été développée. Deux géométries de canaux différentes ont été conçues pour optimiser le modelage des colloïdes et des bactéries grâce à l’assemblage assisté par capillarité. La première géométrie du canal (figure 1B) se compose de trois sections parallèles de 23 mm de long s...

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Discussion

La plate-forme microfluidique décrite ici permet de modeler des objets de taille micro, tels que des colloïdes et des bactéries, dans des arrangements spatiaux prescrits sur un substrat PDMS. Le contrôle total des conditions environnementales offertes par la microfluidique et la capacité de modeler les cellules avec une précision micrométrique accordée par la technologie sCAPA en font une plate-forme très prometteuse pour les futures études de physiologie et d’écologie.

Dans les e...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		deep reactive ion exchange system
Alconox			detergent
AZ400K developer	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator	Life Imaging Services		used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge	Eppendorf	5424R	used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		heated glass plate
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout	Opensource		used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		microscope
openSCAD	Opensource		used to design the mold
OPTIspin SB20	ATM group	51-0002-01-00	spin developer
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786	added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S	Prusa		used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough	Prusa Research a.s.		UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer	Prusa		used to print the mold
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	448931	used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		vacuum spin coater