ロス手術のげっ歯類モデル:全身位置における同系肺動脈移植移植

要約

我々は、ロス処置をシミュレートするために、下行大動脈への肺根移植のマウスモデルを確立する方法を実証する。このモデルは、全身位置における肺自家移植片リモデリングの中長期評価を可能にし、その適応を促進するための治療戦略を開発する基礎となる。

要約

大動脈弁疾患に対するロス手術は、その優れた長期的結果により、新たな関心を取り戻しました。それにもかかわらず、自立根置換術として採用された場合、肺自家移植片の拡張およびそれに続く大動脈逆流の可能性が記載されている。いくつかの動物モデルが提案されている。しかしながら、これらは通常、 エクス ビボモデルまたは比較的高価な大型動物モデルを用いた インビボ 実験に限定される。本研究では、全身位置における肺動脈移植片(PAG)移植のげっ歯類モデルの確立を目指した。合計39匹の成体ルイスラットが含まれていた。安楽死の直後に、ドナー動物から肺根を採取した(n=17)。同系レシピエント(n=17)および偽手術(n=5)ラットを鎮静させ、換気した。レシピエント群では、PAGを後腎腹部大動脈位置にエンドツーエンドの吻合で移植した。偽手術ラットは、大動脈の切除および再吻合のみを受けた。動物を2ヶ月間の連続超音波研究および死後組織学的分析で追跡した。ネイティブ位置のPAG直径の中央値は3.20mm(IQR=3.18-3.23)であった。追跡調査では、PAGの中央径は1週間で4.03mm(IQR=3.74-4.13)、1ヶ月で4.07mm(IQR=3.80-4.28)、2ヶ月で4.27mm(IQR=3.90-4.35)であった(p<0.01)。ピーク収縮期速度は、1週間で220.07mm/s(IQR=210.43-246.41)、1ヶ月で430.88mm/s(IQR=375.28-495.56)、2ヶ月で373.68mm/s(IQR=305.78-429.81)であり、実験終了時の偽手術群(p=0.5)と差はなかった。組織学的分析は、内皮血栓症の徴候を示さなかった。この研究は、げっ歯類モデルが肺根の高圧系への長期適応の評価を可能にする可能性があることを示した。全身に配置された同系PAG移植は、ロス手術の結果をさらに改善するための新規手術技術および薬物療法の開発および評価のためのシンプルで実現可能なプラットフォームを表す。

概要

先天性大動脈弁狭窄症は、病変が弁膜レベルに位置する左心室管の閉塞を特徴とする先天性心疾患のサブグループである。この奇形は、出生1000人あたり約0.04~0.38人に影響を及ぼします¹。

修正に使用できるオプションは多数あり、それぞれに長所と短所があります。両室矯正²に適した患者の場合、このアプローチは弁修復(経皮的または外科的弁膜切除術)またはその置換^{を目的としている可能性があります3}。後者は、大動脈弁が回収不能であると考えられる場合に好ましい。しかし、利用可能な選択肢は小児患者には限られています。実際、生体補綴弁は、早期石灰化のために若年集団の大動脈置換術のために示されていません⁴。一方、機械式バルブの変性はかなり遅いですが、これらは生涯にわたる抗凝固療法を必要とします⁵。さらに、これらの補綴物の主な限界は、患者がさらなる再介入を受ける素因となる成長可能性の欠如によって表される。

小児集団における興味深い治療選択肢は、肺自家移植片を「ロス手術」と名付けられた大動脈位置に移すことである。この場合、肺弁はホモグラフト(図1)^{6に置き換えられます}。この手順は、肺自家移植片がその成長可能性を維持し、生涯にわたる抗凝固療法のリスクを伴わないため、おそらく子供にとって最良の外科的選択を表すことができる。さらに、Ross処置は、機械的または生物学的弁を避けるために若年成人においても大きな価値があり、最良の外科的解決策になる可能性を秘めている。

肺自家移植による大動脈弁置換術後の結果は優れており、生存率は98%を超え、長期転帰も良好です⁷。文献研究は、それぞれ4歳および12歳で肺ホモグラフトを置き換えることから93%および90%の自由を報告している⁸。

この手順の主な制限は、特に自立根置換体として使用される場合、自家移植片が長期的に拡張する傾向である。これは、再介入を必要とする可能性のある弁膜無能を引き起こす可能性があります。実際、これまでに実施された最長の追跡調査では、自家移植片置換術の再手術からの自由度は、10年で88%、20年で75%と報告されています⁹。

実験的な環境でロス手術を再現する可能性は、全身圧に対する肺自家移植片適応の根底にあるメカニズムを調査するための基本的な前提条件を表す。過去にいくつかのモデルが提案されている。しかしながら、これらは通常、比較的高価な大型動物を用いた エクスビボ 実験または インビボ 動物モデルに限定される。本研究では、自立根としての全身位置での肺動脈移植片(PAG)移植のげっ歯類モデルの確立を目指した。

プロトコル

すべての手順は、パドヴァ大学動物ケア委員会(OPBA、プロトコル番号番号55/2017)によって承認され、欧州連合指令2010/63/UEおよび実験動物の世話と使用に関するイタリア法26/2014に準拠して、イタリア保健省(認可番号700/2018-PR)によって承認されています。

1. 動物の世話と実験モデル

1. すべてのルイスラットが単一の会社から入手されていることを確認してください(材料表)。ネズミを、食料と水に自由にアクセスできる従来の施設で維持する。
2. ラットの体重が、レシピエント群で320〜400g、ドナー群で200〜250gの範囲であることを確認します。

2. 術前プロトコル

メモ: すべての操作は、クリーンな条件下で実行する必要があります。同系移植を行うために、雄および雌の成体ルイスラットをレシピエントおよびドナーとしても使用する。

1. 手術の15分前にトラマドール(5mg / kg)の腹腔内注射を行う。
2. 手術直前に筋肉内ゲンタマイシン(5mg / kg)の単回投与を投与する。
3. 麻酔誘導のために、動物が置かれているポリ(メチルメタクリレート)チャンバーに1L /分の酸素中の4%セボフルランを供給します。麻酔のメンテナンスのために、手順全体を通して1 L /分の酸素中に2.0-2.5%のセボフルランを使用してください。
4. 剃刀で胸骨から生殖器領域の1cm上まで2cm幅の正中線に沿って動物を剃ります。その後、ヨウ素溶液で皮膚を殺菌する。
5. 動物が濡れるのを防ぎ、手術中の熱分散を防ぐために、動物を透明なプラスチックフィルムで覆ってください。
6. 有害な刺激に対する応答の欠如を評価することによって、手順を実行する前に麻酔のレベルを評価する。

3. ドナーの操作

1. 動物と心臓の準備:
   1. 麻酔をかけられた動物をコルクトレイの上に置き、尾側を外科医に向けます。約5〜6cmの神経骨 - 恥骨切開を行い、2つの筋皮膚フラップを横方向に後退させる。
   2. 500IUのヘパリンを含む1mLの生理食塩水を4°Cで腹部大静脈を通して投与する。
   3. 1分後、横隔膜を左から右に切断し、前胸部切開術を行い、心臓を露出させる。
   4. 4°Cで生理食塩水を滴下して鼓動する心臓を冷却する。
   5. 大動脈弓の完全なビューを得るために、心臓周囲切除術と胸腺摘出術を行います。大動脈を囲む残りの脂肪組織を除去します.
   6. アーチで切断, 指名動脈の起源のすぐ上;後者も断ち切ってください。
   7. 胸部下大静脈(IVC)を切断し、22Gカニューレを挿入して、4°Cで20〜25mLの生理食塩水を心臓に注入し、光圧をかけた。心臓の鼓動が止まり、大動脈からの流れがはっきりしたら灌流を中止する。
2. PAG外植:
   注:PAGの正確な収穫と繊細な取り扱いは、レシピエントへの最適な移植を達成するために必須です。楽器で直接触れず、代わりに綿棒を使用してください。
   1. 超音波研究を実行して、元の位置のPA直径を評価します。
   2. 容器の後壁の下にマイクロプライヤーを挿入し、PAGの長さを最大にするために、その分岐部にできるだけ近いマイクロハサミを使用して後者を切断する。
   3. リング先端のマイクロ鉗子でPAを静かに保持し、マイクロスプリングハサミで右心室から分離します。いくつかの右心室筋を含むPAGを収穫する。
3. PAGの準備:
   1. 手術台の上の冷たい生理食塩水で湿らせたガーゼの上にPAGを置き、手術顕微鏡下で容器を検査する。
   2. 豊富な周囲の組織を切断し、心室筋を1mmだけ残します。容器の長さを5mmに設定します。

4. 肺動脈移植片(PAG)移植

1. レシピエント動物の調製:
   1. 麻酔をかけられた動物をコルクトレイの上に置き、尾側を外科医に向けます。
   2. 中央縦切開を行い、腹部を開いたままにするために2つのミニリトラクターを使用します。
   3. 2本の綿棒で腸を抽出し、39°Cの生理食塩水で浸したガーゼで覆い、腎外腹部大動脈(AA)の露出による後腹膜領域の視覚化を可能にする。
      注:手術中は、げっ歯類に共通する重篤な状態である低体温症を防ぐために、39°Cの生理食塩水を含む注射器を使用して腸を時々湿らせることが重要です。
   4. 2つの綿棒を使用して、2つの腎動脈と腸骨分岐の間の後頭頂腹膜を剥ぎ取り、下顎AAの周りの脂肪組織を除去する。AAの上に脂肪のごく一部だけを残して、容器での取り扱いを容易にします。
   5. AA を IVC から分離します。この手順を実行するには、まず、後大動脈壁の後ろに湾曲した鉗子を通し、それを使用してAAとIVCの間の通路を開きます。次に、2-0シルク縫合糸を使用してAAの周りにループを作成し、容器を持ち上げ、AAをIVCから分離します。6/0シルク縫合糸で下顎AAから生じる腰椎動脈をリゲートし、それを分割する。
   6. 動物を反時計回りに90°回転させ、頭をオペレータの左側に配置します。AAは現在、微視的なフィールドで水平に横たわっています。
   7. 2つのヤサルギルクリップを使用して、インフラレナルAAをクランプし、互いに1.5cmの距離に置きます。2 つのクリップの中間点に AA をトランセクトします。
   8. 容器の両端を生理食塩水中のヘパリン(1 UI/mL)で灌漑し、血栓を除去します。容器から外来の破片を取り除きます。
2. PAG移植:
   1. PAGを2つの端の間に配置して、心室端を動物の頭蓋部に向けて配置する。
   2. 10-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、PGをAAに接続する2つの画期的なシングルステッチを実行します。血管円周の反対側に縫合糸を配置して、PAGの両端に手順を実行します。
   3. 遠位端から始めて、PAGとAAの間でエンドツーエンドの吻合を行う。遠位ランドマーク縫合糸の両端の1つを後吻合に使用し、レシピエントから移植片へのアウトイン/インアウトシーケンスを使用して、約6ステッチのランニング縫合糸を実行します。
   4. 縫合糸が近位ランドマークに到達したら、縫合糸および近位ランドマーク縫合糸の両端の1つを用いて正方形の結び目によって完了する二重ハーフヒッチを行う。牽引力を提供するために縫合糸にゴム製の蚊の鉗子を適用します。
   5. 前壁に同じ吻合を行う。PAGの近位端で手順全体を実行します。近位吻合を行うときは、縫合糸ラインに小葉を含めないように特に注意してください。
   6. 吻合を確認するために、最初に遠位クリップを放してPAGを逆行性血液(低圧流)で満たします。単一の縫合糸で血液漏れを修復します。遠位吻合が評価されたら、近位側で同じ手順を実行します。
3. 受信者に対する操作の最終段階:
   1. PAGの開存性を評価し、PAGの両側の縫合糸ライン上にゼラチンスポンジの2つのストリップを塗布する(必要な場合)。止血を助けるために2つの綿棒で数秒間穏やかな圧力をかけます。
   2. 腸を腹腔内に再配置し、4/0ポリプロピレン製の縫合糸で壁を閉じます。

5. 偽操作手順

1. レシピエントラットについて先に例示したのと同一の動物の調製を行う。
2. 腎と腸骨動脈の起源の中間にある腎下部AAを切断する。
3. 前述のように、エンドツーエンドの吻合を用いてAAの両端を再近似する。2つのクリップを取り外し、正確な止血手順を実行します。
4. レシピエント動物と同様に、腸を再配置し、腹壁を層状に閉じます。

6. 術後のケアとフォローアップ

1. 温かい生理食塩水(5mL)を動物の背中の皮下組織に投与して水分補給を行う。ラットを加熱ランプの下に置き、麻酔が停止してから通常最大5分かかる覚醒まで視覚的に監視する。動物を22〜24°Cの室温のケージに入れ、食物と水に即時かつ無制限にアクセスできます。
2. 術後鎮痛のために筋肉内トラマドール(5mg / kg)を手術後最初の48時間、1日2回投与する。その後、レシピエントの健康状態と体重を毎日、定期的に監視します。
3. フォローアップ:フォローアップ中に、PAG機能を評価するために、1週間、1ヶ月、および2ヶ月でセリアート超音波試験を実施する。これらの研究中に、血管直径、ピーク収縮期速度(PSV)、および拡張末期速度を測定する。これらのパラメータをPAG内および近位および遠位AAのレベルで測定する。
4. CO2を数分間適用して₂ ヶ月のフォローアップの後に動物を安楽死させ、その後PAGを外植し、組織病理学的分析を受ける。

結果

合計39匹の成体ルイスラットがこの研究に含まれた:17匹の動物をPAGドナーとして、17匹をレシピエントとして、5匹を偽手術(対照群)として使用した(表1)。雄ラットは22匹(56%)、雌ラットは17匹(44%)であった。後者はドナーグループでのみ使用されました。

手術中に致命的な事象は発生せず、100%生存した。追跡期間中、移植群の2匹の動物は、それぞれ12日および51...

ディスカッション

自家肺根による大動脈弁置換術(Ross手術)は、自家移植片の好ましいプロファイルおよび潜在的な成長のために、先天性大動脈弁狭窄修復のための魅力的な選択肢を表す¹⁰。この手順の主な制限は、大動脈新弁の潜在的な拡張であり、これは長期的な逆流の発症の素因となる。全身圧に曝された後の肺動脈上の修飾を特徴付ける可能性は、肺自家移植不全の原因を理解するた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Monico SpA	AIC 030805105	Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient
7.5% Povidone-Iodine	B Braun	AIC 032151211
Barraquer	Aesculap	FD 232R	Straight micro needle holder for the vascular anastomoses
Castroviejo needle holder	Not available	J 4065	To close the animal
Clip applying forceps	Rudolf Medical	RU 3994-05	For clip application
Cotton swabs	Johnson & Johnson Medical SpA	N/A	Supermarket product. Sterilized
Curved micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-06	Used to pass sutures underneath the vases.
Depilatory cream	RB healthcare	N/A	Supermarket product
Electrocautery machine	LED SpA	Surton 200
Fine scissors	Rudolf Medical	RU 2422-11	For opening the abdomen (recipient)
Fine-tip curved Vannas micro scissors	Aesculap	OC 497R	Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene
Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit	Harvard Apparatus Ltd	K 017041	Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter
Gentamycin	MSD Italia Srl	AIC 020891014	Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery
Heparin	Pharmatex Italia Srl	AIC 034692044	500 IU into the recipient abdominal vena cava
I.V. Catheter	Smiths Medical Ltd	4036	20G
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33	To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient
Jeweler bipolar forceps	GIMA SpA	30665	0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases
Lewis rats (LEW/HanHsd)	Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy	86104M	Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients)
Micro-Mosquito	Rudolf Medical	RU 3121-10	In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis
Operating microscope	Leica Microsystems	M 400-E	Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications
Perma-Hand silk 2-0	Johnson & Johnson Medical SpA	C026D	To lift the aorta
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Prolene 10-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W2790	Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses
Retractors	Not any	N/A	Two home-made retractors
Ring tip micro forceps	Rudolf Medical	RU 4079-14	For delicate manipulation
Sevoflurane	AbbVie Srl	AIC 031841036	Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia
Spring type micro scissors	Rudolf Medical	RU 2380-14	Straight; 14 cm long
Standard aneurysm clips	Rudolf Medical	RU 3980-12	Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta
Sterile gauze of non-woven fabric material	Luigi Salvadori SpA	26161V	7.5x7.5 cm, four layers
Straight Doyen scissors	Rudolf Medical	RU/1428-16	For use to the donor
Straight micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-04	10.5 cm long. Used throughout the anastomosis
Syringes	Artsana SpA	N/A	20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping
TiCron 4-0	Covidien	CV-331	For closing muscles and skin
Tissue forceps V. Mueller	McKesson	CH 6950-009	Used for skin and muscles
Tramadol	SALF SpA	AIC 044718029	Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular
Virgin silk 8-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W818	For arterial branch ligation