Ross Operasyonunun Kemirgen Modeli: Sistemik Pozisyonda Singeneik Pulmoner Arter Greft İmplantasyonu

Özet

Ross prosedürünü simüle etmek için alçalma aortuna pulmoner kök implantasyonunun bir murine modelinin nasıl kurulacağımızı gösteriyoruz. Bu model, pulmoner otograft remodeling'in sistemik bir pozisyonda orta/uzun vadeli değerlendirilmesini sağlar ve adaptasyonunu teşvik etmek için terapötik stratejiler geliştirmenin temelini temsil eder.

Özet

Aort kapak hastalığı için Ross operasyonu, olağanüstü uzun vadeli sonuçları nedeniyle yeni bir ilgi kazandı. Bununla birlikte, bağımsız kök replasmanı olarak kullanılırken, pulmoner otograft ve sonraki aort kusmasının olası genişlemesi açıklanmaktadır. Birkaç hayvan modeli önerilmiştir. Bununla birlikte, bunlar genellikle ex-vivo modelleriyle veya nispeten pahalı büyük hayvan modelleriyle in-vivo deneylerle sınırlıdır. Bu çalışmada, sistemik bir pozisyonda pulmoner arter grefti (PAG) implantasyonunun kemirgen modelini oluşturmaya çalıştık. Toplam 39 yetişkin Lewis sıçanı dahil edildi. Ötanaziden hemen sonra pulmoner kök donör bir hayvandan toplanmıştır (n=17). Singeneik alıcı (n=17) ve sham-operated (n=5) sıçanlar yatıştırıldı ve havalandırıldı. Alıcı grupta PAG'a infra-renal abdominal aort pozisyonunda uç-uç anastomoz takıldı. Sham tarafından işletilen sıçanlara sadece aort transeksiyonu ve yeniden anastomoz uygulandı. Hayvanlar iki ay boyunca seri ultrason çalışmaları ve ölüm sonrası histolojik analizlerle takip edildi. Ortanca PAG çapı 3,20 mm idi (IQR=3,18-3,23). Takipte PAG'nin ortanca çapı 1 haftada 4,03 mm (IQR=3,74-4,13) idi, 1 ayda 4,07 mm (IQR=3,80-4,28), 2 ayda 4,27 mm (IQR=3,90-4,35) (s<0,01). Pik sistolik hız 1 haftada 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41), 1 ayda 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) idi, ve 2 ayda (p=0,02) 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) ve denemenin sonundaki sahtekâr gruptan farklı değildi (p=0,5). Histolojik analizde endotel trombozu belirtisine rastlanmadı. Bu çalışma, kemirgen modellerinin pulmoner kökün yüksek basınç sistemine uzun süreli adaptasyonunun değerlendirilmesine izin verebileceğini göstermiştir. Sistemik olarak yerleştirilmiş bir syngeneic PAG implantasyonu, Ross operasyonunun sonuçlarını daha da iyileştirmek için yeni cerrahi tekniklerin ve ilaç tedavilerinin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için basit ve uygulanabilir bir platformu temsil eder.

Giriş

Konjenital aort kapak darlığı, lezyonun valvüler düzeyde bulunduğu sol ventrikül yolunun tıkanma ile karakterize konjenital kalp hastalığının bir alt grubudur. Malformasyon her 1000 canlı doğumda yaklaşık 0.04-0.38'i ^etkiler1.

Düzeltme için mevcut seçenekler, her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan birçok seçenektir. Biventriküler düzeltmeye uygun hastalar ^için2, yaklaşım kapak onarımı (perkütan veya cerrahi valvulotomi) veya değiştirilmesine yönelik ^olabilir3. İkincisi, aort kapağının kurtarılamaz olduğu düşünüldüğünde tercih edilir; ancak pediatrik hastalar için mevcut seçenekler sınırlıdır. Nitekim biyoprostetik kapaklar erken kireçlenmeleri nedeniyle genç popülasyonda aort replasmanı için belirtilmemiştir4. Öte yandan, mekanik kapakçıklardaki dejenerasyon oldukça yavaştır, ancak bunlar ömür boyu antikoagülan tedavi ^gerektirir5. Ek olarak, bu protezlerin ana sınırlaması, hastaları ek yeniden yorumlamalara yatkın olan büyüme potansiyelinin eksikliği ile temsil edilir.

Pediatrik popülasyonda ilginç bir terapötik seçenek, pulmoner otograftın "Ross operasyonu" adlı aort pozisyonuna aktarılmasıdır. Bu durumda pulmoner kapak daha sonra bir homograft ile değiştirilir (Şekil 1)⁶. Bu prosedür muhtemelen çocuklar için en iyi cerrahi seçimi temsil edebilir, çünkü pulmoner otograft büyüme potansiyelini korur ve ömür boyu antikoagülan tedavi risklerini taşımaz. Ayrıca, Ross prosedürü, en iyi cerrahi çözüm olma potansiyeline sahip mekanik veya biyolojik bir kapaktan kaçınmak için genç yetişkinlerde de büyük değere sahip olabilir.

Pulmoner otograft ile aort kapak değişimi sonrası sonuçlar mükemmeldir, sağkalım% 98'den büyüktür ve iyi uzun vadeli ^sonuçlar7. Literatür çalışmaları pulmoner homograftın yerine sırasıyla 4 ve 12 yaşlarında %93 ve %90 özgürlük ^{bildirmektedir8}.

Bu prosedürün en büyük sınırlaması, özellikle bağımsız bir kök değişimi olarak kullanılırken, otograftın uzun vadede genişleme eğilimidir. Bu, yeniden yorumlama gerektirebilecek valvüler yetersizliğe neden olabilir. Gerçekten de, şimdiye kadar yapılan en uzun takip çalışması, 10 yılda% 88 ve 20 ^yıl9'da% 75 otograft değişimi için yeniden çalışma özgürlüğü bildirmektedir.

Bir Ross operasyonunu deneysel bir ortamda yeniden yaratma olasılığı, pulmoner otograft adaptasyonunun sistemik basınçlara temel mekanizmasını araştırmak için temel bir ön koşulu temsil eder. Geçmişte birkaç model önerildi. Bununla birlikte, bunlar genellikle nispeten pahalı büyük hayvanlara sahip ex-vivo deneyleri veya in-vivo hayvan modelleri ile sınırlıdır. Bu çalışmada, bağımsız kök olarak sistemik bir pozisyonda pulmoner arter grefti (PAG) implantasyonunun kemirgen modelini oluşturmaya çalıştık.

Protokol

Tüm prosedürler Padova Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (OPBA, protokol numarası n° 55/2017) tarafından onaylanmış ve İtalya Sağlık Bakanlığı (Yetkilendirme n° 700/2018-PR) tarafından yetkilendirilmiştir, Avrupa Birliği Direktifi 2010/63/UE ve İtalya'nın Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için 26/2014 sayılı Kanunu'na uygun olarak.

1. Hayvan bakımı ve deneysel model

1. Tüm Lewis sıçanlarının tek bir şirketten (Malzeme Masası) elde edildiğinden emin olun. Sıçanları yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile geleneksel tesislerde muhafaza edin.
2. Sıçanların ağırlığının alıcı grubu için 320-400 g ve donör grubu için 200-250 g arasında değiştiğinden emin olun.

2. Ameliyat öncesi protokol

NOT: Tüm işlemler temiz koşullarda yapılmalıdır. Singeneik bir nakil yapmak için erkek ve dişi yetişkin Lewis sıçanlarını alıcı ve donör olarak da kullanın.

1. Ameliyattan 15 dakika önce tramadol (5 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu gerçekleştirin.
2. Ameliyattan hemen önce tek doz kas içi Gentamisin (5 mg/kg) sürün.
3. Anestezi indüksiyonu için, hayvanın yerleştiği bir poli (metil methakrilit) odasına 1 L / dk oksijende% 4 sevofluran sağlayın. Anestezi bakımı için işlem boyunca 1 L/dk oksijende %2.0-2.5 sevofluran kullanın.
4. Hayvanı orta hat boyunca sternumdan 2 cm genişliğe, genital bölgenin 1 cm üstüne jiletle tıraş edin. Daha sonra iyot çözeltisi ile cildi sterilize edin.
5. Hayvanın ıslanmasını önlemek ve ameliyat sırasında ısı dağılımını önlemek için hayvanı şeffaf bir plastik filmle örtün.
6. Zararlı bir uyarana yanıt vermemeyi değerlendirerek işlemi yapmadan önce anestezi seviyesini değerlendirin.

3. Donör operasyonu

1. Hayvan ve kalp hazırlığı:
   1. Uyuşturuluz hayvanı, kaudal tarafı cerraha bakacak şekilde bir mantar tepsisine yerleştirin. Yaklaşık 5-6 cm'lik bir xipho-kasık kesisi gerçekleştirin ve iki kas-deri kapaklarını yanal olarak geri çekin.
   2. Karın vena kava yoluyla 500 IU heparin içeren 4 °C'de 1 mL salin çözeltisi hacmi geçirin.
   3. 1 dakika sonra diyaframı soldan sağa kesin ve kalbi açığa çıkarmak için ön torakotomi işlemi gerçekleştirin.
   4. 4 °C'de salin çözeltisi damlatarak atan kalbi soğutun.
   5. Aort kemerinin tam bir görünümünü elde etmek için perikardiektomi ve timektomi gerçekleştirin. Aortu çevreleyen kalan yağ dokularını çıkarın.
   6. Innominat arterin kökeninin hemen üzerinde kemerde kesin; ikincisini de kopar.
   7. Torasik inferior vena kavayı (IVC) kesin ve kalbi 4 °C'de 20-25 mL tuzlu su çözeltisi ile aşılamak için hafif basınç uygulayarak 22 G'lik bir ampul yerleştirin. Kalp durduğunda perfüzyonu durdurun ve aorttan akış netleşti.
2. PAG explant:
   NOT: Alıcıda optimum implantasyon elde etmek için PAG'nin doğru bir şekilde toplanması ve hassas bir şekilde işlenmesi zorunludur. Doğrudan aletlerle dokunmayın, bunun yerine pamuklu çubuklar kullanın.
   1. PA çapını kendi pozisyonunda değerlendirmek için bir ultrason çalışması gerçekleştirin.
   2. Geminin arka duvarının altına bir mikro-plier yerleştirin ve PAG'nin uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için çatallanmasına mümkün olduğunca yakın bir mikro makas kullanarak ikincisini kesin.
   3. PA'yı halka uçlu mikroasiplerle hafifçe tutun ve mikro yay makası ile sağ ventrikülden ayırın. Sağ ventrikül kası da dahil olmak üzere PAG'yi hasat edin.
3. PAG hazırlığı:
   1. PAG'yi ameliyat masasına soğuk salin ile nemlendirilmiş bir gazlı bez üzerine yerleştirin ve kabı çalışma mikroskobu altında inceleyin.
   2. Sadece 1 mm ventrikül kası bırakarak bol miktarda çevreleyen dokuyu kesin. Kabın uzunluğunu 5 mm olarak ayarlayın.

4. Pulmoner arter grefti (PAG) implantasyonu

1. Alıcı hayvanın hazırlanması:
   1. Uyuşturuluz hayvanı, kaudal tarafı cerraha bakacak şekilde bir mantar tepsisine yerleştirin.
   2. Ortanca uzunlamasına bir kesi yapın ve karnı açık tutmak için iki mini retraktör kullanın.
   3. Bağırsakları iki pamuklu çubukla çıkarın ve 39 °C salin ile ıslatılmış bir gazlı bezle örtün ve infra-renal abdominal aortun (AA) maruz kalmasıyla retroperitoneal bölgenin görselleştirilmesini sağlar.
      NOT: Ameliyat sırasında, kemirgenlerde yaygın olan kritik bir durum olan hipotermiyi önlemek için 39 °C salin içeren bir şırınna kullanarak bağırsakları zaman zaman nemlendirmek önemlidir.
   4. İki pamuklu çubuk kullanarak iki renal arter ve iliak çatallanma arasındaki arka parietal peritonu soyun ve kızılötesi AA etrafındaki yağ dokusunu çıkarın. Damarda kullanımı kolaylaştırmak için AA'nın üzerinde sadece küçük bir yağ parçası bırakın.
   5. AA'yı IVC'den ayırın. Bu işlemi gerçekleştirmek için, önce arka aort duvarının arkasına kavisli bir tokmak geçirin ve AA ile IVC arasında bir geçit açmak için kullanın. Ardından, gemiyi kaldırmak ve AA'yı IVC'den ayırmak için AA etrafında bir döngü oluşturmak için 2-0 ipek dikiş kullanın. Kızılötesi AA'dan kaynaklanan herhangi bir bel arterini 6/0 ipek dikiş ile bağlayın ve bölün.
   6. Hayvanı saat yönünün tersine 90° döndürün, başı operatörün sol tarafına yerleştirin. AA şimdi mikroskobik alanda yatay olarak yatıyordu.
   7. Kızılötesi AA'yı sıkıştırmak ve birbirinden 1,5 cm mesafeye yerleştirmek için iki Yaşargil klipsi kullanın. AA'yı iki klip arasındaki orta noktadan aktarın.
   8. Damarların iki ucunun herhangi bir pıhtıyı çıkarmak için salin çözeltisinde heparin (1 UI/mL) ile sulanın. Damarlardaki macerasal kalıntıları çıkarın.
2. PAG implantasyonu:
   1. PAG'yi iki ucun arasına, ventrikül ucu hayvanın kraniyal kısmına doğru yerleştirin.
   2. PG'yi AA'ya bağlayan iki dönüm noktası tek dikişi gerçekleştirmek için 10-0 polipropilen dikiş kullanın. Dikişi damar çevresinin karşı taraflarına yerleştirerek PAG'nin her iki ucundaki işlemi gerçekleştirin.
   3. Pag ve AA arasında distal uçtan başlayarak uçtan uca bir anastomoz gerçekleştirin. Yaklaşık altı dikişten oluşan bir dikiş gerçekleştirmek için alıcıdan grefte çıkış/çıkış sırası kullanarak posterior anastomoz için distal dönüm noktası dikişinin iki ucundan birini kullanın.
   4. Dikiş proksimal dönüm noktasına ulaştığında, dikişi ve proksimal dönüm noktası dikişinin iki ucundan birini kullanarak kare bir düğümle tamamlanan çift yarım bir otostop gerçekleştirin. Çekiş sağlamak için dikişlere kauçuk-shod sivrisinek tokmakları uygulayın.
   5. Ön duvarda aynı anastomozu gerçekleştirin. PAG'nin proksimal ucundaki tüm prosedürü sürdürin. Dikiş çizgisine herhangi bir broşür dahil etmemek için proksimal anastomoz yaparken özellikle dikkat edin.
   6. Anastomozu kontrol etmek için PAG'nin retrograd kan (düşük basınç akışı) ile doldurulmasını sağlamak için önce distal klipsi bırakın. Tek bir dikişle herhangi bir kan sızıntıyı onarın. Distal anastomoz değerlendirildikten sonra, proksimal uçta aynı işlemi uygulayın.
3. Alıcı üzerindeki işlemin son aşamaları:
   1. PAG'nin açıklığını değerlendirin ve PAG'nin her iki tarafındaki dikiş çizgilerinin üzerine iki şerit jelatin süngeri uygulayın (gerekirse). Hemostaz yardımcı olmak için iki pamuklu çubukla birkaç saniye hafif basınç uygulayın.
   2. Bağırsakları karın boşluğuna yer edin ve duvarları 4/0 polipropilen çalışan bir dikişle kapatın.

5. Sham tarafından işletilen prosedür

1. Alıcı sıçanlar için daha önce gösterildiği gibi hayvanın aynı hazırlığını gerçekleştirin.
2. Renal ve iliak arterlerin kökeninin ortasında, infra-renal AA'yı kesin.
3. AA'nın iki ucunun daha önce açıklandığı gibi uç-uca bir anastomoz kullanarak yeniden örneklenin. İki klipsi çıkarın ve doğru bir hemostaz prosedürü uygulayın.
4. Bağırsakları yeniden konumlandırın ve alıcı hayvanlara gelince karın duvarını katmanlar halinde kapatın.

6. Ameliyat sonrası bakım ve takip

1. Hidrasyon için hayvanın sırtının deri altı dokusuna ılık tuzlu su çözeltisi (5 mL) sürün. Sıçanı bir ısıtma lambasının altına yerleştirin ve uyanmaya kadar görsel olarak izleyin, bu da anestezi durdurulduktan sonra genellikle 5 dakikaya kadar sürer. Hayvanı, yiyecek ve suya anında ve sınırsız erişimle 22-24 ° C oda sıcaklığında bir kafese yerleştirin.
2. Ameliyat sonrası analjezi için intramüsküler tramadol (5 mg/kg) ameliyattan sonraki ilk 48 saat boyunca günde iki kez uygulama. Daha sonra, alıcının sağlık durumunu ve vücut ağırlığını günlük olarak düzenli olarak izleyin.
3. Takip: Takip sırasında PAG fonksiyonunu değerlendirmek için bir hafta, bir ay ve iki ayda seriate ultrason çalışmaları gerçekleştirin. Bu çalışmalar sırasında damar çapını, tepe sistolik hızını (PSV) ve son diyastolik hızı ölçün. Bu parametreleri PAG içinde ve proksimal ve distal AA seviyesinde ölçün.
4. Birkaç dakika _CO2 uygulamasıyla iki aylık takiplerden sonra hayvanları ötenazi yapın ve ardından histopatolojik analizden geçecek pag'ı ayıklayın.

Sonuçlar

Bu çalışmaya toplam 39 yetişkin Lewis sıçanı dahil edildi: PAG bağışçısı olarak 17 hayvan, alıcı olarak 17 hayvan ve sham-operated (kontrol grubu) olarak 5 hayvan kullanıldı (Tablo 1). Erkek sıçanlar 22 (%56) ve dişi 17 (%44); ikincisi sadece donör grubunda kullanılmıştır.

Operasyon sırasında %100 sağkalım ile ölümcül bir olay meydana gelmedi. Takip sırasında, nakil grubundan iki hayvan sırasıyla 12 ve 51 günde ölümcül bir sonuç elde et...

Tartışmalar

Otolog pulmoner kök (Ross operasyonu) ile aort kapak değişimi, ^{otograft10'un} olumlu profili ve potansiyel büyümesi nedeniyle konjenital aort kapak darlığı onarımı için çekici bir seçeneği temsil eder. Bu prosedürün en büyük sınırlaması, uzun süreli kusma gelişimine yatkın olan aort neo-kapakçığının potansiyel genişlemesidir. Sistemik basınçlara maruz kaldıktan sonra pulmoner arterdeki modifikasyonların karakterize etme olasılığı, pulmoner otograft yetmezliğin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Monico SpA	AIC 030805105	Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient
7.5% Povidone-Iodine	B Braun	AIC 032151211
Barraquer	Aesculap	FD 232R	Straight micro needle holder for the vascular anastomoses
Castroviejo needle holder	Not available	J 4065	To close the animal
Clip applying forceps	Rudolf Medical	RU 3994-05	For clip application
Cotton swabs	Johnson & Johnson Medical SpA	N/A	Supermarket product. Sterilized
Curved micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-06	Used to pass sutures underneath the vases.
Depilatory cream	RB healthcare	N/A	Supermarket product
Electrocautery machine	LED SpA	Surton 200
Fine scissors	Rudolf Medical	RU 2422-11	For opening the abdomen (recipient)
Fine-tip curved Vannas micro scissors	Aesculap	OC 497R	Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene
Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit	Harvard Apparatus Ltd	K 017041	Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter
Gentamycin	MSD Italia Srl	AIC 020891014	Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery
Heparin	Pharmatex Italia Srl	AIC 034692044	500 IU into the recipient abdominal vena cava
I.V. Catheter	Smiths Medical Ltd	4036	20G
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33	To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient
Jeweler bipolar forceps	GIMA SpA	30665	0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases
Lewis rats (LEW/HanHsd)	Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy	86104M	Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients)
Micro-Mosquito	Rudolf Medical	RU 3121-10	In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis
Operating microscope	Leica Microsystems	M 400-E	Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications
Perma-Hand silk 2-0	Johnson & Johnson Medical SpA	C026D	To lift the aorta
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Prolene 10-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W2790	Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses
Retractors	Not any	N/A	Two home-made retractors
Ring tip micro forceps	Rudolf Medical	RU 4079-14	For delicate manipulation
Sevoflurane	AbbVie Srl	AIC 031841036	Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia
Spring type micro scissors	Rudolf Medical	RU 2380-14	Straight; 14 cm long
Standard aneurysm clips	Rudolf Medical	RU 3980-12	Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta
Sterile gauze of non-woven fabric material	Luigi Salvadori SpA	26161V	7.5x7.5 cm, four layers
Straight Doyen scissors	Rudolf Medical	RU/1428-16	For use to the donor
Straight micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-04	10.5 cm long. Used throughout the anastomosis
Syringes	Artsana SpA	N/A	20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping
TiCron 4-0	Covidien	CV-331	For closing muscles and skin
Tissue forceps V. Mueller	McKesson	CH 6950-009	Used for skin and muscles
Tramadol	SALF SpA	AIC 044718029	Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular
Virgin silk 8-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W818	For arterial branch ligation