食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ

要約

鉄(Fe)バイオアベイラビリティに関するCaco-2細胞バイオアッセイは、食品、食品、サプリメント、食事、さらには食事療法からのFeバイオアベイラビリティを評価するための費用効果が高く汎用性の高いアプローチです。ヒトの研究に対して徹底的に検証されており、Feバイオアベイラビリティの研究のための最先端を表しています。

要約

Feバイオアベイラビリティに関する知識は、食品中のFeの栄養価を評価するために重要です。Feバイオアベイラビリティの in vivo 測定は、コスト、スループット、および食品Feの同位体標識に固有の警告によって制限されます。したがって、高スループットで費用対効果の高いアプローチに対する重要なニーズが存在します。Caco-2細胞バイオアッセイは、このニーズを満たすために開発されました。FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイは、Caco-2として知られるヒト腸管上皮細胞株の培養と組み合わせたシミュレートされた胃および腸の消化を利用します。Caco-2細胞では、Feの取り込みは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって容易に測定されるFe貯蔵タンパク質であるフェリチンの細胞内形成を刺激します。フェリチンはFeの取り込みに比例して形成されます。したがって、Caco-2細胞フェリチン産生を測定することにより、模擬食品消化物から腸細胞への腸内Fe取り込みを評価することができます。

このアプローチにより、モデルは食品Feのバイオアベイラビリティを決定する重要な初期ステップを再現します。1998年の開始以来、このモデルアプローチは、ヒトFeバイオアベイラビリティに影響を与えることが知られている要因と厳密に比較されてきました。さらに、それは並行研究に適用されており、Fe生物強化作物を評価する3つの人間有効性研究があります。すべての場合において、バイオアッセイは、因子、作物、および全体的な食事からFeバイオアベイラビリティの相対量を正しく予測しました。この論文は、FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイを実施するために必要な in vitro 消化プロセスおよび細胞フェリチンELISAと組み合わせたCaco-2細胞培養の詳細な方法を提供します。

概要

FeバイオアベイラビリティのためのCaco-2細胞バイオアッセイの研究の必要性と利点を完全に理解するには、まず、このモデルの出現前に実施されていたアプローチを理解する必要があります。in vivoでの食品または食事からのFeバイオアベイラビリティの測定は、特に食事または食事で食品の組み合わせを評価する必要がある場合、困難な作業です。同位体標識は、過去50年間にわたってFeバイオアベイラビリティを測定するための最も一般的なアプローチでした¹。同位体標識は、単食および複数食の研究に使用され、長期の研究には実用的ではありません。^57Feや58FeなどのFeの安定同位体が最も一般的に使用されています。しかし、^59Feなどの放射性同位元素では、全身計数²を利用した研究が行われています。植物性食品の場合、同位体標識は外因性または内因性標識によって行われています。外因性標識のために、既知量の同位体が食品または食事に添加される。次に、食品を混合し、消費前に15〜30分の平衡期間をプロトコルに組み込みます。水耕栽培培養(同位体を養液に添加して、成長および発達する間に植物に取り込む)は、植物性食品の固有の表示に必要です。各アプローチの長所と短所については、以下で説明します。

外因性同位体標識
1970年代初頭から中期にかけて、食品中のFeの外因性標識によってヒトのFe吸収が研究され、食品または食事中の既知の量のFeに既知量の同位体が添加され、混合され、測定前に15〜30分間平衡化されました。様々な量の外因性同位体が使用されており、真性Feの1%から100%の範囲であるが、最も一般的には7%〜30%³の範囲である。外因性標識は、外因性Fe同位体が食品または食事の内因性Feと完全に平衡化されるという仮定に基づいています。次に、外因性同位体吸収が測定され、外因性同位体の各原子が計算されて、所定の数の固有Fe原子を表します。この計算は、相対モル量に基づいています。1983年に、この手法の複数の検証研究がレビュー論文⁴にまとめられました。この手法の検証は、外因性同位体標識の吸収率と内因性同位体標識の吸収率を同時に比較することによって行われました。したがって、外因性吸収と内因性吸収の比が1に近いことは、Feの各プールが等しく吸収されたことを示唆している。当時、1に近い比率は、外因性同位体と食品または食事の固有Feとの平衡を表すとも考えられていました。外因性Fe吸収と内因性Fe吸収の比は平均値0.40から1.62の範囲であり、63の比較で平均(±SD)比は1.08±0.14であった。本レビューで要約したすべての研究において、外因性標識と内因性Feとの平衡を直接テストしたものはなかったことに注意することが重要です。要約すると、レビューの著者は次のように結論付けました。

「外因性タグ技術は、特定の実験条件下でいくつかの食品に有効であることが証明されています。しかし、この方法は、すべての種類の食品に関してまだ証明されているとは言えません。外因性タグ法は、不溶性の鉄を含む食事からの鉄吸収を監視するのには適していません。この技術の有効性は、外因性タグがすべての内因性の非ヘム食品鉄と完全に交換するという基本的な仮定に依存しています。現在のところ、異なる形態の非ヘム鉄が外因性タグによってどの程度完全に標識されているかは知られていない。これは、鉄阻害剤が食品中のある種の非ヘム鉄とは異なる方法で外因性タグに影響を与える可能性があることを示唆している研究に照らして重要です。完全な同位体交換を損なう可能性のある食物因子に関する研究は乏しい。したがって、外因性タグ研究からのバイオアベイラビリティデータの解釈には、食品または食事に存在する可能性のある交換阻害剤を考慮する必要があります。」

1983年以来、Fe ^3,5の外因性標識の精度を評価した2つの研究のみが発表されています。これらの両方の研究において、外因性同位体標識の平衡化は、これらの研究では主食作物であった食品の固有のFeと直接比較されました。白、赤、黒豆の品種が、レンズ豆とトウモロコシとともにテストされました。確立されたin vitro消化技術とFeの溶解度と沈殿の測定を使用して、両方の研究は、外因性同位体標識が一貫して完全な平衡化をもたらさないことを示し、一部の豆品種では、外因性同位体の量と種皮の色に応じて不均衡が非常に高くなる可能性があるという証拠^{があります3}。1983年のレビュー論文の結論にもかかわらず、豆の外因性標識研究は継続された6,7,8,9,10,11,12。これらの研究のいずれも、外因性標識と内因性Feとの平衡化のテストは含まれていなかった。

本質的ラベリング
Feバイオアベイラビリティの評価のための植物性食品の固有の標識は、外因性標識における平衡化の精度の問題を排除します。しかしながら、このアプローチは、水耕栽培のための温室スペースを必要とするため、大量の材料を生み出すことができない。水耕栽培は労働集約的であり、大量の高価な安定同位体を必要とし、そしてしばしば収量および種子Fe濃度の点で異なる植物の成長をもたらす。コストがかかるため、内因性標識は、Feの取り込みの根底にあるメカニズムや食品からのFeの取り込みに影響を与える要因を理解することを目的とした小規模な研究にのみ適しています。主食作物の1〜2 kgの生産には、同位体と水耕栽培のアプローチにもよりますが、材料だけで約20,000ドルから30,000ドルの費用がかかります^13,14。

同位体標識に関連する課題を考慮して、研究者はin vitroアプローチの開発を目指しました。初期の方法は、生物学的利用能の推定値としてFe溶解度またはFe透析可能性の測定と相まって、シミュレートされた胃および腸の食物を利用しました¹⁵。このような研究では、Feは可溶性であり、化合物に強固に結合しているため、交換不可能であり、バイオアベイラビリティの過大評価につながる可能性があるため、Fe透析可能性はバイオアベイラビリティの一貫した尺度ではないことがすぐにわかりました。これらの課題に対処するために、ヒト腸管細胞株を利用する方法論が進化し、それによって生体成分が追加され、Fe取り込み¹⁶の測定が可能になりました。ヒト腸細胞であるCaco-2細胞は、ヒト結腸癌に由来し、栄養摂取研究に広く使用されています。この細胞株は、培養において、細胞が小腸のブラシ境界細胞と同様に機能する腸細胞に分化するので有用である。研究によると、Caco-2細胞は、Feの取り込みに影響を与える因子に対して適切なトランスポーターと応答を示します^17,18。

Caco-2細胞におけるFe取り込みを測定するために放射性同位元素を利用した最初の研究は、Caco-2細胞のフェリチン形成に基づいてFe取り込みを測定するように改良された。Caco-2細胞フェリチン測定は、サンプルスループットを向上させ、放射性同位元素の取り扱いと外因性Feと内因性^Fe19,20の平衡化の問題を打ち消しました。フェリチン形成によるFe取り込みの測定により、研究者は複雑な食事を含む幅広い食品を研究することができました²¹。したがって、Caco-2細胞のFe取り込みと組み合わせたシミュレートされた(in vitro)消化は、食品からのFe取り込みのより良い生理学的評価を提供しました。このモデルは主にFeバイオアベイラビリティの相対的な違いを決定することに注意することが重要です。多くの有用な細胞株と同様に、Caco-2細胞も応答性にばらつきを示していますが、食品間のFe取り込みに一貫した相対的な違いを維持しています。適切な技術と細部への注意深い注意は、Caco-2細胞における一貫した細胞フェリチン形成応答を改善することができる。

インビトロ消化/Caco-2細胞モデルは、Caco-2細胞バイオアッセイとしても知られています。このアッセイは、ヒトおよび動物の研究との直接比較によって徹底的に検証されています²²。バイオアッセイとヒト有効性試験との直接並行比較に加えて、このモデルは、Fe取り込みにおいてヒトのそれと質的に類似した応答を示すことが示されている^18,19,23。したがって、in vitroアプローチとして、Caco-2細胞バイオアッセイは、食品からのFe栄養を評価するためのスクリーニングツールとして高い信頼性を保証します。それは多くの食品および食品に広く適用されている21、^24、25、26、^27、28。

1998年の開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイは、腸のFe摂取に影響を与える要因の特定に役立ったため、Fe栄養の分野を進歩させてきました。そうすることで、このモデルは、より決定的で費用のかからない人間の研究のための研究目標を開発し、洗練させました。また、モデルの使用は、いくつかの人間の試験の必要性を否定すると主張することもできます。

要約すると、食品または食事からのFeの相対送達は、Caco−2細胞バイオアッセイを用いて測定することができる。試験食中のFeの量に関係なく、バイオアッセイは、腸細胞に取り込まれるFeの相対量、つまり吸収プロセスの最初のステップを定義します。これは、Feバイオアベイラビリティを定義する上で最も重要なステップであり、ほとんどの場合、目標は食品中のFeの栄養価を改善するか、少なくとも監視する目的で測定することです。鉄の状態は吸収によって調節され、したがってFeの取り込みは栄養ニーズを満たすためにFe欠乏個体でアップレギュレーションされることを考えると、モデルの標準条件は、細胞によるFeの取り込みが最大になるように設計されている。このようにして、バイオアッセイは、Feを送達する食品の可能性の真の尺度を提供します。

プロトコル

注:読者にとって便利な参照ポイントとして、以下の方法論では、バイオアッセイの実行において、20の実験サンプルからのFeバイオアベイラビリティの測定に必要な特定の培養条件と材料、および必要な品質管理について説明します。この容量を超えてサンプル数を増やすことは、バイオアッセイ内のさまざまな細胞培養および in vitro 消化ステップに必要な時間のため、推奨されません。

1.サンプル量の選択

1. 固体または液体の食品の場合、テストするサンプルを代表すると見なすことができる食品の量を決定します。
   1. 豆品種からのFeバイオアベイラビリティの試験では、100〜150 gの豆種子を使用し、この量を均質なサンプルに加工します。
   2. 強化ジュース、乳製品、スポーツ飲料などの液体サンプルの場合は、サンプリングする前に食品がよく混合されていることを確認してください。
      注:上記の豆種子材料の量は、この主食作物の種子間の固有の違いを説明するために不可欠です。

2. サンプルの調製

1. 処理する前に、食品サンプルの汚れやほこりを蒸留脱イオン水で洗い流してください。
2. 実験目的に応じて、調理方法や粉砕など、適量の試料を加工してください。
   注意: 調理および加工には、汚染物質Feの潜在的な発生源ではない調理器具および機器を使用することが重要です。ステンレス鋼の機器は汚染しません。ただし、石臼グラインダー、鋳鉄製調理器具、およびFeを含む非ステンレス鋼機器などの機器は、かなりの量の汚染物質Feを追加する可能性があります。多くの場合、標準のステンレス鋼コーヒーグラインダーが粉砕に適しています。
3. 凍結乾燥し、均質な粉末に粉砕する。
   注:均質化されると、研究によると、測定される各食品に対して3つの独立した分析の複製が適切であることが示されています。
   1. サンプルの均一性を達成するのが難しい場合は、製品の配合または処理を修正してください。これが不可能な場合は、非均質性が重大でない場合は複製を追加します。
   2. ほとんどの均質な固形食品では、反復ごとに0.5 gの凍結乾燥サンプルを使用します。必要に応じて、反復ごとに最大1.0 gのサンプルを使用しますが、0.5 gを超えると応答の程度に利点があるかどうかを確認します。
      注意: 固形食品が0.5 gを超えると、透析膜が詰まる可能性があります(以下を参照)。
   3. 1〜2 mLの液体サンプルを使用してください。
      注:液体サンプルでは凍結乾燥は必要ないことがよくあります。

3. Caco-2細胞培養

1. ストックカルチャー
   1. 認定サプライヤーからCaco-2細胞を入手します。
   2. 25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、および1%抗生物質抗真菌溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、5%_CO2 空気雰囲気(一定の湿度)のインキュベーター内でストックバイアルから細胞を培養します。
   3. 十分な細胞が利用可能になったら、通常7〜10日間の培養後、細胞をコラーゲンコーティングされていないフラスコに30,000細胞/^cm2の密度で播種します。
   4. フラスコのサイズは、マルチウェルプレートの播種に必要な細胞数に応じて選択してください。
      注:一般に、T225(225 cm 2)フラスコは、バイオアッセイごとに11枚のマルチウェル(6ウェル、9.66 cm² /ウェル)プレート(サンプル比較用に10プレート、品質管理用に1プレート)を使用する実験に最適です。
   5. フラスコ内で細胞を7日間増殖させ、1日おきに培地を交換し、7^日目 にマルチウェルプレートの播種に使用します。
      注:細胞がストック培養から開始され、その後一連の実験で使用されるときから10〜15継代以下の継代範囲を使用することをお勧めします。広範囲の継代が細胞株に適応的な変化をもたらし、したがってモデルの応答にばらつきをもたらす可能性があるため、細胞培養継代は制限する必要があります。
2. マルチウェルプレートでの細胞培養
   1. Caco-2細胞を50,000細胞/^cm2 の密度で6ウェルコラーゲンコーティングプレートに播種します。
      注: この手順は通常、水曜日に実行すると最適に機能します。次の手順により、この曜日が最適である理由が明らかになります。
   2. 25 mM HEPES(pH 7.2)、10%(v/v)FBS、および1%抗生物質抗真菌溶液を添加したDMEMを使用して、5%CO2空気雰囲気(一定の湿度)のインキュベーターで37°Cで₁₂ 日間細胞を増殖させます。
      注:細胞単層を12日以上培養すると、細胞の異常増殖を引き起こす可能性があります。以前の研究では、これらの条件下で、播種後12日で、細胞単層が成熟し、プレートによく付着し、応答の一貫性において最適であることが明確に示されています²⁹、^30、31。細胞を19〜21日までなど、より長く増殖させると、細胞の異常増殖が起こり、培地は栄養素を急速に枯渇させ、不健康な単層をもたらします。
   3. 12日間は、一貫した毎日のスケジュールで少なくとも2日ごとに培地を交換してください。
   4. 播種後12^日目に 、培養液を10 mMパイプ(ピペラジン-N,N'-ビス-[2-エタンスルホン酸])、1%抗生物質抗真菌溶液、ヒドロコルチゾン(4 mg/L)、インスリン(5 mg/L)、セレン(5 μg/L)、トリヨードチロニン(34 μg/L)、および上皮成長因子(20 μg/L)を添加した2 mLの最小必須培地(MEM [pH 7])と交換します。
      注:シードが水曜日に開始された場合、12^日目 は月曜日になります。
   5. 翌日(すなわち、13日目)に、MEMを取り外し、1mLのMEM(pH 7)と交換します。
      注: この手順は火曜日に実行されます。これはバイオアッセイが始まる日です。したがって、13日間のスケジュールは、一貫した毎週のスケジュールの利点をもたらし、バイオアッセイを同じ平日に一貫して実施することができます。

4. 体外 消化

1. インサートリングの作製
   1. 酸洗浄透析膜を取り付けたシリコンOリングを使用して、滅菌済みインサートリングを作成します(図1A)。
      注:バイオアッセイ当日の1日前(つまり、月曜日、12日目)にインサートを準備し、使用できるようになるまで4°Cの18MΩ水に保管します。
   2. バイオアッセイ当日(13日目火曜日)に、冷蔵庫からインサートを取り外し、水を切り、水を0.5 M HClと交換します。 使用前に、層流フードに室温で少なくとも1時間放置してください。
      注:この手順は、培養プレートからMEMを取り除く前に実行する必要があります。メンブレンの酸洗浄は、汚染可能性のあるFeを除去し、インサートリングおよびメンブレンを滅菌する役割を果たす。
   3. インサートから0.5 M HClを排出し、滅菌した18 MΩ水ですすいでください。使用する準備ができるまで、層流フード内の室温で滅菌18MΩ水に保管してください。
   4. Caco-2細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルにリングを挿入し、2チャンバーシステムを作成します。インサート付きのプレートをインキュベーターに戻します。
      注:この手順は、新しい1.0 mLのMEMを各ウェルに追加した直後に実行する必要があります(手順3.2.5を参照)。
2. ペプシン溶液の調製
   1. 実験当日、0.145 gのペプシンを50 mLの0.1 M HClに溶解してペプシン溶液を調製します。 室温で30分間、プラットフォームシェーカーで溶液を穏やかに振とうします。
3. パンクレアチン胆汁溶液の調製
   1. 実験と同じ日に、2.1gのNaHCO3を250mLの18MΩ水に溶解して0.1M NaHCO3を調製した。
   2. 0.35gのパンクレアチンおよび2.1gの胆汁抽出物を175mLの0.1M NaHCO₃に混合する。
   3. パンクレアチンと胆汁抽出物が可溶になったら、弱陽イオン交換樹脂( 材料表を参照)を87.5 g加え、室温で30分間振とうして混合します。
   4. スラリーを大きなカラムに注ぎ、溶出液を集めます。
   5. 追加の70 mLの0.1 M NaHCO₃でカラムを溶出し、この容量をパンクレアチン胆汁溶液に収集します。
      注:樹脂の目的は、パンクレアチン胆汁抽出物に一般的に見られる汚染物質Feを除去することです。
4. インビトロ消化を開始します。
   1. 滅菌済みの50 mL遠沈管(ポリプロピレン)でサンプルを計量し、続いて140 mM NaClおよび5 mM KClを含むpH 2の生理食塩水10 mLを添加します。
   2. 調製したブタペプシン溶液0.5 mLをサンプルに加えて胃消化プロセスを開始し、ロッキングシェーカーで低く穏やかな設定で37°Cで1時間インキュベートします。
   3. この期間に続いて、1.0 M NaHCO₃でpHを5.5〜6.0に調整することにより、各サンプルの腸管消化プロセスを開始します。
   4. 2.5 mLのパンクレアチン胆汁溶液を各サンプルチューブに加え、1.0 M NaHCO₃でpHを6.9〜7.0に調整します。
   5. pHを調整したら、140 mM NaCl、5 mM KCl(pH 6.7)溶液を使用して各チューブ内の体積を均等化し、目標値15 gでチューブの重量を測定します。
      注意: 一部の食品では、食品の緩衝能力に応じて、総量を16gまたは17gにする必要があるかもしれません。
   6. 各腸管消化物1.5 mLを、Caco-2細胞を含む6ウェル培養プレートの対応するウェルの上部チャンバー(すなわち、透析膜を備えたインサートリングを含む)に移します(図1B)。
   7. プレートカバーを元に戻し、ロッキングシェーカーで37°C(5%_CO2 空気雰囲気)で6振動/分で2時間インキュベートします。
   8. ダイジェストでインサートリングを取り外し、各ウェルにさらに1 mLのMEM(pH 7)を追加します。
   9. 細胞培養プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2空気雰囲気下)に戻し、さらに₂₂ 時間反応します。
   10. 22時間後、細胞培養培地を取り出し、2.0 mLの18 MΩ水を細胞単層に加えます。
       注:水は細胞を浸透圧溶解します。
   11. 細胞ライセート全体を標準的なポリプロピレン製マイクロ遠心チューブなどに回収し、その後の細胞タンパク質および細胞フェリチン分析を行います。

5. Caco-2細胞フェリチンおよび細胞タンパク質の測定

1. ステップ4.4.10の細胞ライセートを使用します。細胞フェリチンおよびタンパク質の測定用。
   1. Caco-2細胞のフェリチン含有量を測定するには、マウス抗フェリチン抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートのインキュベーション時間を30分から2時間に増やすことを除いて、キットの指示に従ってください( 材料表を参照)。
   2. 細胞タンパク質を測定するには、細胞タンパク質キットに記載されている指示に従ってください(材料の表を参照)。

結果

主食作物におけるFeバイオアベイラビリティの同定と測定
このモデルを開発した主な理由の1つは、主食作物のFeバイオアベイラビリティに影響を与える要因を特定し、植物育種家がFeバイオアベイラビリティを高めた品種を特定および開発できるようにするツールを提供することでした。一般的な豆(Phaseolus vulgaris)は、Fe生物強化のための作物として世界的に標的にされ?...

ディスカッション

その開始以来、Caco-2細胞バイオアッセイのためのこの方法を説明する多数の研究が発表されてきた。基本的な条件は、1998年の最初の発行以来比較的変わっていません¹⁸。しかし、過去20年間にわたり、バイオアッセイの応答に前例のない一貫性をもたらすために、多くの技術的詳細が洗練され、標準化されてきました。細胞培養と in vitro 消化条件への慎重かつ正確な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific