O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Resumo

O bioensaponenciamento celular Caco-2 para biodisponibilidade de ferro (Fe) representa uma abordagem econômica e versátil para avaliar a biodisponibilidade da Fe a partir de alimentos, produtos alimentícios, suplementos, refeições e até regimes dietéticos. Validada minuciosamente aos estudos humanos, representa o estado da arte para estudos de biodisponibilidade fe.

Resumo

O conhecimento da biodisponibilidade fe é fundamental para a avaliação da qualidade nutricional da Fe nos alimentos. A medição in vivo da biodisponibilidade fe é limitada pelo custo, throughput e as ressalvas inerentes à rotulagem isotópica do alimento Fe. Assim, existe uma necessidade crítica de uma abordagem de alto rendimento e custo-benefício. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para satisfazer essa necessidade. O bioensaio celular Caco-2 para biodisponibilidade fe utiliza digestão gástrica e intestinal simulada juntamente com a cultura de uma linha celular epitelial intestinal humana conhecida como Caco-2. Nas células de Caco-2, a absorção de Fe estimula a formação intracelular de ferritina, uma proteína de armazenamento Fe facilmente medida por ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Forma-se de ferritina proporcional à absorção de Fe; assim, medindo a produção de ferritina celular Caco-2, pode-se avaliar a absorção intestinal de Fe a partir de digestões simuladas de alimentos para o enterócito.

Através dessa abordagem, o modelo replica o passo inicial chave que determina a biodisponibilidade de Alimentos Fe. Desde sua criação, em 1998, essa abordagem modelo tem sido rigorosamente comparada a fatores conhecidos por influenciar a biodisponibilidade humana fe. Além disso, tem sido aplicado em estudos paralelos, com três estudos de eficácia humana avaliando culturas bioesforificadas da Fe. Em todos os casos, o bioensaio previu corretamente as quantidades relativas da biodisponibilidade fe dos fatores, culturas e dieta geral. Este artigo fornece métodos detalhados sobre a cultura celular Caco-2, juntamente com o processo de digestão in vitro e ferritina celular ELISA necessário para conduzir o bioensa de célula Caco-2 para biodisponibilidade fe.

Introdução

Para entender completamente a necessidade e o benefício da pesquisa da biodisponibilidade celular Caco-2 para a biodisponibilidade da Fe, é preciso primeiro entender as abordagens que estavam em vigor antes do advento desse modelo. A medição da biodisponibilidade fe a partir de um alimento ou refeição in vivo é uma tarefa desafiadora, particularmente quando combinações de alimentos precisam ser avaliadas em uma refeição ou dieta. A rotulagem isotópica tem sido a abordagem mais comum para a medição da biodisponibilidade fe nos últimos 50 anos¹. A rotulagem isotópica é usada para estudos de refeição única e múltiplas refeições e é impraticável para estudos de longo prazo. Isótopos estáveis de Fe como ⁵⁷Fe e ⁵⁸Fe são os mais utilizados; no entanto, estudos têm sido realizados com radioisótopos como ⁵⁹Fe, utilizando a contagem de corpo inteiro². Para alimentos vegetais, a rotulagem isotópica tem sido feita através de rotulagem extrínseca ou intrínseca. Para rotulagem extrínseca, uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à comida ou refeição. O alimento é então misturado, e um período de equilíbrio de 15-30 min é incorporado ao protocolo antes do consumo. A cultura hidropônica que adiciona o isótopo à solução de nutrientes para incorporá-lo na planta enquanto ela cresce e se desenvolve - é necessária para a rotulagem intrínseca de alimentos vegetais. Os prós e contras de cada abordagem são discutidos abaixo.

Rotulagem isotópica extrínseca
No início da década de 1970, a absorção de Fe humano foi estudada pela rotulagem extrínseca de Fe em alimentos, onde uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à quantidade conhecida de Fe na comida ou refeição, misturada e equilibrada por 15-30 minutos antes das medições. Várias quantidades de isótopos extrínsecos têm sido utilizadas, variando de 1% a 100% do Fe intrínseco, mas mais comumente na faixa de 7%-30%³. A rotulagem extrínseca baseia-se no pressuposto de que o isótopo fe extrínseco fica totalmente equilibrado com o Fe intrínseco da comida ou refeição. A absorção de isótopos extrínsecos é então medida, e cada átomo do isótopo extrínseco é calculado para representar um determinado número de átomos fe intrínsecos. Este cálculo é baseado nas quantidades relativas molares. Em 1983, múltiplos estudos de validação da técnica foram resumidos em artigo^{de revisão 4}. A validação da técnica foi feita comparando simultaneamente a absorção percentual do rótulo isotópico extrínseco à absorção percentual de um rótulo isotópico intrínseco. Assim, uma razão da absorção extrínseca para intrínseca próxima a 1 sugere que cada piscina de Fe foi igualmente absorvida. Na época, também foi considerada uma relação próxima a 1, representando o equilíbrio do isótopo extrínseco com o Fe intrínseco da comida ou refeição. As razões de absorção fe extrínseca à intrínseca variaram de valores médios de 0,40 a 1,62, com razão média (±SD) de 1,08 ± 0,14 em 63 comparações. É importante notar que, em todos os estudos resumidos nesta revisão, nenhum testou diretamente o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco. Em resumo, os autores da revisão concluíram o seguinte:

"A técnica de etiqueta extrínseca tem se mostrado válida para vários alimentos em determinadas condições experimentais. Mas, esse método ainda não pode ser considerado comprovado em relação a todos os tipos de alimentos. O método de etiqueta extrínseca não é apropriado para monitorar a absorção de ferro a partir de uma dieta que contém formas insolúveis de ferro. A validade desta técnica baseia-se no pressuposto básico de que a tag extrínseca troca completamente com todo ferro alimentar não-hemo endógeno. No momento, não se sabe como completamente as diferentes formas de ferro não-heme são rotuladas por uma tag extrínseca. Isso é importante à luz de estudos que sugerem que os inibidores de ferro podem afetar a etiqueta extrínseca de forma diferente de algumas formas de ferro não-heme nos alimentos. Pesquisas sobre fatores alimentares que podem prejudicar uma troca isotópica completa são escassas. Assim, a interpretação dos dados de biodisponibilidade da pesquisa de etiquetas extrínsecas requer a consideração de inibidores de troca que possam estar presentes na alimentação ou na dieta."

Desde 1983, foram publicados apenas dois estudos que avaliaram a exatidão da rotulagem extrínseca de Fe ^3,5. Em ambos os estudos, o equilíbrio de um rótulo isotópico extrínseco foi diretamente comparado com o Fe intrínseco dos alimentos, que, nesses estudos, eram culturas alimentares básicas. Foram testadas variedades de feijão branco, vermelho e preto, juntamente com lentilhas e milho. Utilizando técnicas de digestão in vitro estabelecidas e a medição da solubilidade e precipitação de Fe, ambos os estudos demonstraram que a rotulagem isotópica extrínseca não resulta consistentemente em equilíbrio total, com evidências de que, para algumas variedades de feijão, a misequilibração pode ser muito alta dependendo da quantidade de isótopo extrínseco e da cor^{do casaco de sementes 3}. Apesar das conclusões do artigo de revisão de 1983, os estudos de rotulagem extrínseca de feijão continuaram^em 6,7,8,9,10,11,12. Nenhum desses estudos incluiu testar o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco.

Rotulagem intrínseca
A rotulagem intrínseca de alimentos vegetais para a avaliação da biodisponibilidade fe elimina as questões de precisão do equilíbrio na rotulagem extrínseca. No entanto, essa abordagem não pode produzir grandes quantidades de material devido à exigência de espaço de estufa para a cultura hidropônica. A cultura hidropônica é intensiva em mão-de-obra, requer uma alta quantidade de isótopo estável caro, e muitas vezes resulta em crescimento vegetal diferente em termos de produção e concentração de sementes Fe. Devido ao custo, a rotulagem intrínseca só é adequada para estudos de pequena escala que visam compreender mecanismos subjacentes à absorção de Fe ou fatores que influenciam a absorção de Fe dos alimentos. A produção de 1-2 kg de uma cultura de alimentos básicos custa aproximadamente US $ 20.000-US $ 30.000 apenas para materiais, dependendo do isótopo e abordagem hidropônica^13,14.

Dado os desafios associados à rotulagem isotópica, os investigadores procuraram desenvolver abordagens in vitro. Os métodos iniciais utilizaram alimentos gástricos e intestinais simulados, juntamente com a medição da solubilidade fe ou dialyzabilidade fe como estimativa de biodisponibilidade¹⁵. Tais estudos rapidamente descobriram que a dialise fe não era uma medida consistente de biodisponibilidade, pois Fe pode ser solúvel, firmemente ligado a compostos e, portanto, não trocável, levando à superestimação da biodisponibilidade. Para lidar com essas questões, evoluiu a metodologia de utilização de uma linha celular intestinal humana, adicionando assim um componente vivo e permitindo a medição da captação de Fe¹⁶. As células intestinais humanas-Caco-2 foram originadas de um carcinoma de cólon humano e têm sido amplamente utilizadas em estudos de absorção de nutrientes. Esta linha celular é útil, pois, na cultura, as células se diferenciam em enterócitos que funcionam de forma semelhante às células fronteiriças do intestino delgado. Estudos mostram que as células Caco-2 apresentam os transportadores apropriados e resposta a fatores que influenciam a absorção^{de Fe 17,18}.

Os estudos iniciais, utilizando radioisótopos para medir a absorção de Fe em células Caco-2, foram refinados para medir a absorção de Fe com base na formação de ferritina celular Caco-2. A medição da ferritina celular Caco-2 aumentou o rendimento da amostra e negou questões de manuseio de radioisótopos e o equilíbrio da Fe extrínseca com fe intrínseco^19,20. A medição da absorção de Fe através da formação de ferritina permitiu aos pesquisadores estudar uma ampla gama de alimentos, incluindo refeições complexas²¹. Assim, a digestão simulada (in vitro) juntamente com a absorção fe celular Caco-2 proporcionou uma melhor avaliação fisiológica da absorção fe dos alimentos. É importante notar que este modelo determina principalmente diferenças relativas na biodisponibilidade fe. Como muitas linhas celulares úteis, as células Caco-2 também mostraram variabilidade na responsividade, mas mantiveram diferenças relativas consistentes na absorção de Fe entre os alimentos. A técnica adequada e a atenção cuidadosa aos detalhes podem melhorar a resposta consistente da formação de ferritina celular nas células Caco-2.

O modelo de célula in vitro/Caco-2 também é conhecido como bioensaio celular Caco-2. Este ensaio foi minuciosamente validado por meio de comparação direta com estudos humanos e animais²². Além da comparação paralela direta do bioensativo aos ensaios de eficácia humana, este modelo tem mostrado uma resposta qualitativamente semelhante na absorção de Fe à de humanos 18,19,23. Portanto, como abordagem in vitro, o bioensa de células Caco-2 garante alta credibilidade como ferramenta de triagem para avaliação da nutrição fe a partir de alimentos. Tem sido amplamente aplicado a inúmeros alimentos e produtos alimentícios 21,24,25,26,27,28.

Desde sua criação, em 1998, o bioensaio celular Caco-2 avançou no campo da nutrição fe, pois ajudou a identificar fatores que influenciam a absorção intestinal do Fe. Ao fazê-lo, esse modelo desenvolveu e refinou os objetivos de pesquisa para estudos humanos mais definitivos e menos dispendiosos. Pode-se também argumentar que o uso do modelo nega a necessidade de alguns testes em humanos.

Em resumo, a entrega relativa de Fe de um alimento ou refeição pode ser medida com o bioensaio celular Caco-2. Independentemente da quantidade de Fe na refeição de teste, o bioensaio define a quantidade relativa de Fe levada para o enterócito - a primeira etapa do processo de absorção. Este é o passo mais importante na definição da biodisponibilidade fe, pois na maioria das vezes o objetivo é medir com a intenção de melhorar ou, no mínimo, monitorar a qualidade nutricional de Fe em um alimento. Dado que o estado do ferro é regulado pela absorção e, portanto, a absorção de Fe é regulada em indivíduos deficientes fe para atender às necessidades nutricionais, as condições padrão do modelo são projetadas para que a absorção fe pelas células seja máxima. Dessa forma, o bioensaio fornece uma verdadeira medida do potencial do alimento para entregar Fe.

Protocolo

NOTA: Como ponto de referência conveniente para os leitores, a seguinte metodologia descreve as condições de cultura específicas e materiais necessários para a medição da biodisponibilidade fe a partir de 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade necessários, em uma execução do bioensaio. O aumento do número de amostras além dessa capacidade não é recomendado devido ao tempo necessário para várias culturas celulares e etapas de digestão in vitro dentro do bioensaio.

1. Escolher a quantidade de amostras

1. Para alimentos sólidos ou líquidos, determine uma quantidade de alimentos que podem ser considerados representativos da amostra a ser testada.
   1. Em testes para biodisponibilidade fe de uma variedade de feijão, use 100-150 g de semente de feijão e processe essa quantidade para uma amostra homogênea.
   2. Para amostras líquidas, como sucos fortificados, produtos lácteos e bebidas esportivas, certifique-se de que os alimentos estão bem misturados antes da amostragem.
      NOTA: A quantidade de material de semente de feijão mencionado acima é essencial para explicar as diferenças inerentes entre as sementes desta cultura de grampo.

2. Preparação de amostras

1. Enxágüe o solo e a poeira de qualquer amostra de alimentos com água destilada desionizada antes do processamento.
2. Processe a quantidade adequada de amostra conforme os objetivos experimentais, como pelo método de cozimento e fresagem.
   NOTA: Para cozinhar e processar, é fundamental usar panelas e equipamentos que não são uma fonte potencial de contaminante Fe. Equipamento de aço inoxidável não contamina; no entanto, equipamentos como moedores de moinho de pedra, panelas de ferro fundido e qualquer equipamento de aço não inoxidável contendo Fe pode adicionar quantidades significativas de Fe contaminante. Um moedor de café de aço inoxidável padrão é muitas vezes adequado para moagem.
3. Lyophilize e triture em pó homogêneo.
   NOTA: Uma vez homogeneizadas, pesquisas mostraram que três replicações independentes de análise são adequadas para cada alimento que está sendo medido.
   1. Se a homogeneidade da amostra for difícil de alcançar, revise a formulação ou processamento do produto. Se isso não for possível, adicione replicações se a não homogeneidade não for grave.
   2. Para a maioria dos alimentos sólidos homogêneos, utilize 0,5 g de amostra liofilizada por réplica. Se necessário, use até 1,0 g de amostra por réplica, mas verifique se mais de 0,5 g produz um benefício no grau de resposta.
      NOTA: Quantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos podem entupir a membrana de diálise (veja abaixo).
   3. Use 1-2 mL de amostras líquidas.
      NOTA: A lyofilização muitas vezes não é necessária para amostras líquidas.

3. Cultura celular caco-2

1. Culturas de ações
   1. Adquira células Caco-2 de um fornecedor certificado.
   2. Cultura as células a partir de frascos de estoque a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% CO₂ (umidade constante) usando o Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco complementado com 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) e 1% solução antimíctica antibiótico-antimíctica.
   3. Uma vez que células suficientes estão disponíveis, geralmente após 7-10 dias de cultura, semearam as células em frascos não revestidos de colágeno a uma densidade de 30.000 células/cm².
   4. Escolha o tamanho do frasco dependendo do número de células disponíveis e necessárias para semeadura de placas multiwell.
      NOTA: Em geral, os frascos T225 (225 cm²) funcionam melhor para experimentos onde são utilizadas 11 placas multiwell (6-well; 9,66 cm²/well) (10 placas para comparações de amostras, 1 placa para controles de qualidade) por bioensaio.
   5. Cultivar células em frascos por 7 dias, mudando o meio a cada dois dias, e usar no^7º dia para semear as placas multiwell.
      NOTA: Recomenda-se usar uma faixa de passagem de no máximo 10-15 passagens de quando as células são iniciadas a partir da cultura do estoque e posteriormente usadas em uma série de experimentos. As passagens de cultura celular devem ser limitadas, pois uma ampla gama de passagens pode resultar em mudanças adaptativas na linha celular e, assim, variabilidade na resposta do modelo.
2. Cultura celular em placas multiwell
   1. Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células/cm² em placas revestidas de colágeno de 6 poços.
      NOTA: Esta etapa geralmente funciona melhor se feita em uma quarta-feira. Os seguintes passos tornarão evidente por que este dia da semana é ótimo.
   2. Cresça as células por 12 dias a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% de CO₂ (umidade constante) utilizando DMEM complementado com HEPES de 25 mM (pH 7.2), 10% (v/v) FBS e 1% solução antimicomolética antibiótico.
      NOTA: A colheita das monocamadas celulares por mais de 12 dias pode resultar em crescimento excessivo celular. Pesquisas anteriores mostraram claramente que, nessas condições, aos 12 dias após a semeadura, a monocamada celular é madura, bem presa à placa, e ótima na consistência da resposta 29,30,31. O crescimento das células por mais tempo, como até 19-21 dias, resulta em crescimento excessivo celular, e a mídia rapidamente se esgota em nutrientes, resultando em monocamadas não saudáveis.
   3. Durante o período de 12 dias, troque o meio pelo menos a cada 2 dias em um horário diário consistente.
   4. No pós-semeadura de^{12 dias} , substitua o meio de cultura por 2 mL de Meio Essencial Mínimo (MEM [pH 7]) complementado com PIPES de 10 mM (piperazine-N,N'-bis-[2-ácido estanolfônico]), solução antibiótico-antimicomolética de 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selênio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fator de crescimento epidérmico (20 μg/L).
      NOTA: Se a semeadura fosse iniciada em uma quarta-feira, então o^12º dia seria uma segunda-feira.
   5. No dia seguinte (ou seja, dia 13), retire o MEM e substitua-o por 1 mL de MEM (pH 7).
      NOTA: Esta etapa ocorreria em uma terça-feira. Este é o dia em que o bioensaio começa; assim, o cronograma de 13 dias rende a vantagem de um cronograma semanal consistente, permitindo que o bioensaio seja realizado de forma consistente no mesmo dia da semana.

4. Digestão in vitro

1. Preparação de anéis de inserção
   1. Crie um anel de inserção esterilizado usando um anel O de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido (Figura 1A).
      NOTA: Prepare as pastilhas com 1 dia de antecedência (ou seja, segunda-feira, dia 12) do dia do bioensaio e armazene em 18 MΩ água a 4°C até estar pronto para uso.
   2. No dia do bioensaio (terça-feira, dia 13), retire as pastilhas da geladeira, escorra e substitua a água por 0,5 M HCl. Deixe-a em temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar por pelo menos 1h antes de ser usada.
      NOTA: Esta etapa deve ser feita antes de remover o MEM das placas de cultura. A lavagem ácida da membrana serve para remover a possível contaminação do Fe e esteriliza o anel e a membrana da inserção.
   3. Escorra os 0,5 M HCl das pastilhas e enxágue com água estéril de 18 MΩ. Guarde em água estéril de 18 MΩ à temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar até estar pronta para uso.
   4. Insira um anel em cada poço das placas de 6 poços com células Caco-2, criando assim um sistema de duas câmaras. Devolva as placas com as pastilhas para a incubadora.
      NOTA: Esta etapa deve ser feita logo após a adição de 1,0 mL de MEM a cada poço (ver Passo 3.2.5.).
2. Preparação da solução pepsina
   1. No dia do experimento, prepare a solução pepsina dissolvendo 0,145 g de pepsina em 50 mL de 0,1 M HCl. Agite a solução suavemente em um agitador de plataforma por 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Preparação da solução pancreatina-bile
   1. No mesmo dia do experimento, prepare 0,1 M NaHCO₃ dissolvendo 2,1 g de NaHCO₃ em 250 mL de 18 MΩ de água.
   2. Misture 0,35 g de pancreatina e 2,1 g de extrato de bile em 175 mL de 0,1 M NaHCO₃.
   3. Uma vez que o extrato de pancreatina e biliar seja solubilizado, adicione 87,5 g de uma fraca resina de troca de cáção (ver a Tabela de Materiais) e misture tremendo por 30 minutos à temperatura ambiente.
   4. Despeje o chorume em uma coluna grande e colete o elunato.
   5. Elute a coluna com um adicional de 70 mL de 0,1 M NaHCO₃, coletando este volume na solução bile pancreatina.
      NOTA: O objetivo da resina é remover o contaminante Fe comumente encontrado nos extratos de pâncreas-bile.
4. Iniciar digestão in vitro .
   1. Pesar a amostra em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL (polipropileno), seguido pela adição de 10 mL de soro fisiológico no pH 2, contendo 140 mM NaCl e 5 mM KCl.
   2. Inicie o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mL da solução de pepsina suína preparada à amostra e incubar em um agitador de balanço em um ajuste baixo e suave por 1h a 37 °C.
   3. Após esse período, inicie o processo de digestão intestinal de cada amostra ajustando o pH para 5,5-6,0 com 1,0 M NaHCO₃.
   4. Adicione 2,5 mL da solução pancreatina-bile a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9-7,0 com 1,0 M NaHCO₃.
   5. Uma vez ajustado o pH, equalize o volume em cada tubo usando a solução de 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7), medindo o peso do tubo com um valor-alvo de 15 g.
      NOTA: Para alguns alimentos, pode-se precisar levar o volume total para 16 g ou 17 g, dependendo da capacidade de tampão dos alimentos.
   6. Transfira 1,5 mL de cada digestão intestinal para a câmara superior (ou seja, contendo o anel de inserção com a membrana de diálise) de um poço correspondente da placa de cultura de 6 poços contendo as células Caco-2 (Figura 1B).
   7. Substitua a tampa da placa e incubar a 37 °C (atmosfera de ar de 5% CO₂ ) em um agitador de balanço a 6 oscilações/min por 2h.
   8. Remova o anel de inserção com o digestor e adicione mais 1 mL de MEM (pH 7) a cada poço.
   9. Retorne a placa de cultura celular à incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de ar CO₂ ) por mais 22 h.
   10. Após 22 h, remova o meio de cultura celular e adicione 2,0 mL de água de 18 MΩ à monocamada celular.
       NOTA: A água vai liseticamente as células.
   11. Colher toda a célula lysate em tubos padrão de microcentrífugo de polipropileno ou semelhante para análises subsequentes de proteína celular e ferritina celular.

5. Medição da ferritina celular Caco-2 e proteína celular

1. Use o lisecelular do passo 4.4.10. para a medição da ferritina celular e proteína.
   1. Para medir o teor de ferritina das células Caco-2, siga as instruções do kit (veja a Tabela de Materiais), com exceção do aumento do tempo de incubação de 30 min para 2 h para o conjugado de anticorpo anti-ferritina do rato (HRP).
   2. Para medir a proteína celular, siga as instruções fornecidas no kit de proteína celular (veja a Tabela de Materiais).

Resultados

Identificação e medição da biodisponibilidade de Fe em culturas de alimentos básicos
Uma das principais razões para o desenvolvimento desse modelo foi identificar fatores que influenciam a biodisponibilidade da Fe nas culturas alimentares básicas e fornecer uma ferramenta para os criadores de plantas que lhes permitiriam identificar e desenvolver variedades com biodisponibilidade fe aprimorada. O feijão comum (Phaseolus vulgaris) tem sido alvo globalmente como uma cultura para a biofo...

Discussão

Desde sua criação, inúmeros estudos foram publicados que descrevem este método para o bioensaio celular Caco-2. As condições básicas permaneceram relativamente inalteradas desde a publicação inicial em 1998¹⁸. No entanto, nos últimos 20 anos, inúmeros detalhes técnicos foram refinados e padronizados para produzir consistência sem precedentes na resposta ao bioensaio. A adesão cuidadosa e precisa à cultura celular e às condições de digestão in vitro são a chave para a r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific