Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la misurazione della biodisponibilità del ferro negli alimenti

Riepilogo

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità del ferro (Fe) rappresenta un approccio economico e versatile per valutare la biodisponibilità del Fe da alimenti, prodotti alimentari, integratori, pasti e persino regimi dietetici. Completamente validato per studi sull'uomo, rappresenta lo stato dell'arte per gli studi sulla biodisponibilità del Fe.

Abstract

La conoscenza della biodisponibilità del Fe è fondamentale per la valutazione della qualità nutrizionale della Fe negli alimenti. La misurazione in vivo della biodisponibilità del Fe è limitata dai costi, dalla produttività e dalle avvertenze inerenti all'etichettatura isotopica del Fe alimentare. Pertanto, esiste una necessità critica per un approccio che sia ad alto rendimento ed economico. Il biotest sulle cellule Caco-2 è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe utilizza la digestione gastrica e intestinale simulata accoppiata con la coltura di una linea cellulare epiteliale intestinale umana nota come Caco-2. Nelle cellule Caco-2, l'assorbimento di Fe stimola la formazione intracellulare di ferritina, una proteina di stoccaggio del Fe facilmente misurabile mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). La ferritina si forma in proporzione all'assorbimento di Fe; quindi, misurando la produzione di ferritina cellulare Caco-2, è possibile valutare l'assorbimento intestinale di Fe da digerimenti alimentari simulati nell'enterocita.

Attraverso questo approccio, il modello replica il passaggio iniziale chiave che determina la biodisponibilità del Fe alimentare. Fin dal suo inizio nel 1998, questo approccio modello è stato rigorosamente confrontato con fattori noti per influenzare la biodisponibilità umana di Fe. Inoltre, è stato applicato in studi paralleli, con tre studi di efficacia umana che valutano le colture biofortificate Fe. In tutti i casi, il biotest ha previsto correttamente le quantità relative di biodisponibilità di Fe dai fattori, dalle colture e dalla dieta generale. Questo articolo fornisce metodi dettagliati sulla coltura cellulare di Caco-2 accoppiata con il processo di digestione in vitro e l'ELISA della ferritina cellulare necessari per condurre il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe.

Introduzione

Per comprendere appieno la necessità di ricerca e il beneficio del saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe, è necessario prima comprendere gli approcci che erano in atto prima dell'avvento di questo modello. La misurazione della biodisponibilità del Fe da un alimento o pasto in vivo è un compito impegnativo, in particolare quando le combinazioni di alimenti devono essere valutate in un pasto o in una dieta. L'etichettatura isotopica è stato l'approccio più comune per la misurazione della biodisponibilità del Fe negli ultimi 50 anni¹. L'etichettatura isotopica viene utilizzata per studi a pasto singolo e multipasto ed è poco pratica per studi a lungo termine. Gli isotopi stabili di Fe come ⁵⁷Fe e ⁵⁸Fe sono i più comunemente usati; tuttavia, sono stati condotti studi con radioisotopi come ⁵⁹Fe, utilizzando il conteggio di tutto il corpo². Per gli alimenti vegetali, l'etichettatura isotopica è stata effettuata tramite etichettatura estrinseca o intrinseca. Per l'etichettatura estrinseca, una quantità nota di isotopo viene aggiunta al cibo o al pasto. Il cibo viene quindi miscelato e un periodo di equilibrio di 15-30 minuti viene incorporato nel protocollo prima del consumo. La coltura idroponica - aggiungendo l'isotopo alla soluzione nutritiva per incorporarla nella pianta mentre cresce e si sviluppa - è necessaria per l'etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali. I pro e i contro di ciascun approccio sono discussi di seguito.

Etichettatura isotopica estrinseca
Nella prima metà degli anni 1970, l'assorbimento umano di Fe è stato studiato mediante etichettatura estrinseca di Fe negli alimenti, in cui una quantità nota di isotopo viene aggiunta alla quantità nota di Fe nel cibo o nel pasto, miscelata ed equilibrata per 15-30 minuti prima delle misurazioni. Sono state utilizzate varie quantità di isotopi estrinseci, che vanno dall'1% al 100% del Fe intrinseco, ma più comunemente nell'intervallo 7%-30%³. L'etichettatura estrinseca si basa sul presupposto che l'isotopo Fe estrinseco sia completamente equilibrato con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. Viene quindi misurato l'assorbimento isotopico estrinseco e ogni atomo dell'isotopo estrinseco viene calcolato per rappresentare un dato numero di atomi di Fe intrinseci. Questo calcolo si basa sulle quantità molari relative. Nel 1983, diversi studi di convalida della tecnica sono stati riassunti in un documento di revisione⁴. La convalida della tecnica è stata effettuata confrontando simultaneamente l'assorbimento percentuale dell'etichetta isotopica estrinseca con l'assorbimento percentuale di un'etichetta isotopica intrinseca. Pertanto, un rapporto tra l'assorbimento estrinseco e quello intrinseco vicino a 1 suggerisce che ogni pool di Fe è stato ugualmente assorbito. All'epoca, un rapporto vicino a 1 era anche considerato rappresentare l'equilibrio dell'isotopo estrinseco con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. I rapporti tra assorbimento estrinseco e intrinseco di Fe variavano da valori medi di 0,40 a 1,62, con un rapporto medio (±SD) di 1,08 ± 0,14 in 63 confronti. È importante notare che, in tutti gli studi riassunti in questa recensione, nessuno ha testato direttamente l'equilibrio dell'etichetta estrinseca con il Fe intrinseco. In sintesi, gli autori della revisione hanno concluso quanto segue:

"La tecnica del tag estrinseco si è dimostrata valida per diversi alimenti in determinate condizioni sperimentali. Ma questo metodo non può ancora essere considerato provato per quanto riguarda tutti i tipi di alimenti. Il metodo del tag estrinseco non è appropriato per monitorare l'assorbimento del ferro da una dieta che contiene forme insolubili di ferro. La validità di questa tecnica si basa sul presupposto di base che il tag estrinseco si scambia completamente con tutto il ferro alimentare nonheme endogeno. Al momento non è noto quanto completamente le diverse forme di ferro nonheme siano etichettate da un tag estrinseco. Questo è importante alla luce di studi che hanno suggerito che gli inibitori del ferro possono influenzare il tag estrinseco in modo diverso rispetto ad alcune forme di ferro nonheme negli alimenti. La ricerca sui fattori alimentari che possono compromettere uno scambio isotopico completo è scarsa. Pertanto, l'interpretazione dei dati di biodisponibilità dalla ricerca sui tag estrinseci richiede la considerazione degli inibitori dello scambio che possono essere presenti nel cibo o nella dieta".

Dal 1983 sono stati pubblicati solo due studi che hanno valutato l'accuratezza dell'etichettatura estrinseca di Fe ^3,5. In entrambi questi studi, l'equilibrio di un'etichetta isotopica estrinseca è stato direttamente confrontato con il Fe intrinseco degli alimenti, che, in questi studi, erano colture alimentari di base. Sono state testate varietà di fagioli bianchi, rossi e neri, insieme a lenticchie e mais. Utilizzando tecniche di digestione in vitro consolidate e la misurazione della solubilità e della precipitazione del Fe, entrambi gli studi hanno dimostrato che l'etichettatura isotopica estrinseca non porta costantemente a un completo equilibrio, con evidenza che, per alcune varietà di fagioli, il disequilibrio può essere molto elevato a seconda della quantità di isotopo estrinseco e del colore del rivestimento del seme³. Nonostante le conclusioni del documento di revisione del 1983, gli studi di etichettatura estrinseca dei fagioli sono continuati 6,7,8,9,10,11,12. Nessuno di questi studi includeva la verifica dell'equilibrio dell'etichetta estrinseca con il Fe intrinseco.

Etichettatura intrinseca
L'etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali per la valutazione della biodisponibilità del Fe elimina i problemi di accuratezza dell'equilibrio nell'etichettatura estrinseca. Tuttavia, questo approccio non può produrre grandi quantità di materiale a causa della necessità di spazio in serra per la coltura idroponica. La coltura idroponica è laboriosa, richiede un'elevata quantità di isotopi stabili costosi e spesso si traduce in una crescita delle piante diversa in termini di resa e concentrazione di Fe del seme. A causa del costo, l'etichettatura intrinseca è adatta solo per studi su piccola scala volti a comprendere i meccanismi alla base dell'assorbimento di Fe o i fattori che influenzano l'assorbimento di Fe dagli alimenti. La produzione di 1-2 kg di una coltura alimentare di base costa circa $ 20.000- $ 30.000 per i soli materiali, a seconda dell'isotopo e dell'approccio idroponico^13,14.

Date le sfide associate all'etichettatura isotopica, i ricercatori hanno cercato di sviluppare approcci in vitro. I primi metodi utilizzavano alimenti gastrici e intestinali simulati, accoppiati con la misurazione della solubilità di Fe o della dializzabilità di Fe come stima della biodisponibilità¹⁵. Tali studi hanno rapidamente scoperto che la dializzabilità del Fe non era una misura coerente della biodisponibilità in quanto la Fe può essere solubile, strettamente legata ai composti e, quindi, non scambiabile, portando alla sovrastima della biodisponibilità. Per affrontare questi problemi, la metodologia per utilizzare una linea cellulare intestinale umana si è evoluta, aggiungendo così un componente vivente e consentendo la misurazione dell'assorbimento di Fe¹⁶. Le cellule intestinali umane - cellule Caco-2 - hanno avuto origine da un carcinoma del colon umano e sono state ampiamente utilizzate negli studi sull'assorbimento dei nutrienti. Questa linea cellulare è utile in quanto, in coltura, le cellule si differenziano in enterociti che funzionano in modo simile alle cellule del bordo del pennello dell'intestino tenue. Gli studi hanno dimostrato che le cellule Caco-2 mostrano i trasportatori appropriati e la risposta ai fattori che influenzano l'assorbimento di Fe^17,18.

Gli studi iniziali, utilizzando radioisotopi per misurare l'assorbimento di Fe nelle cellule Caco-2, sono stati perfezionati per misurare l'assorbimento di Fe sulla base della formazione di ferritina cellulare Caco-2. La misurazione della ferritina cellulare Caco-2 ha migliorato la produttività del campione e ha annullato i problemi di gestione dei radioisotopi e l'equilibrio del Fe estrinseco con Fe intrinseco^19,20. La misurazione dell'assorbimento di Fe attraverso la formazione di ferritina ha permesso ai ricercatori di studiare una vasta gamma di alimenti, compresi i pasti complessi²¹. Pertanto, la digestione simulata (in vitro) accoppiata con l'assorbimento di Fe delle cellule Caco-2 ha fornito una migliore valutazione fisiologica dell'assorbimento di Fe dagli alimenti. È importante notare che questo modello determina principalmente differenze relative nella biodisponibilità di Fe. Come molte linee cellulari utili, anche le cellule Caco-2 hanno mostrato variabilità nella reattività, ma hanno mantenuto differenze relative consistenti nell'assorbimento di Fe tra gli alimenti. Una tecnica corretta e un'attenta attenzione ai dettagli possono migliorare la risposta coerente alla formazione di ferritina cellulare nelle cellule Caco-2.

Il modello di digestione in vitro / cellule Caco-2 è anche noto come test biologico delle cellule Caco-2. Questo test è stato accuratamente convalidato mediante confronto diretto con studi sull'uomo e sugli animali²². Oltre al confronto parallelo diretto del saggio biologico con gli studi di efficacia umana, questo modello ha dimostrato di mostrare una risposta qualitativamente simile nell'assorbimento di Fe a quella degli esseri umani^18,19,23. Pertanto, come approccio in vitro, il biotest sulle cellule Caco-2 garantisce un'elevata credibilità come strumento di screening per valutare la nutrizione di Fe dagli alimenti. È stato ampiamente applicato a numerosi alimenti e prodotti alimentari 21,24,25,26,27,28.

Fin dal suo inizio nel 1998, il biotest sulle cellule Caco-2 ha fatto progredire il campo della nutrizione del Fe in quanto ha contribuito a identificare i fattori che influenzano l'assorbimento intestinale di Fe. In tal modo, questo modello ha sviluppato e perfezionato obiettivi di ricerca per studi umani più definitivi e meno costosi. Si potrebbe anche sostenere che l'uso del modello nega la necessità di alcune sperimentazioni umane.

In sintesi, la consegna relativa di Fe da un alimento o pasto può essere misurata con il biotest cellulare Caco-2. Indipendentemente dalla quantità di Fe nel pasto di prova, il biotest definisce la quantità relativa di Fe assorbita nell'enterocita, la prima fase del processo di assorbimento. Questo è il passo più importante nella definizione della biodisponibilità del Fe, poiché il più delle volte l'obiettivo è misurare con l'intento di migliorare o, per lo meno, monitorare la qualità nutrizionale del Fe in un alimento. Dato che lo stato del ferro è regolato dall'assorbimento, e quindi l'assorbimento di Fe è sovraregolato in individui carenti di Fe per soddisfare le esigenze nutrizionali, le condizioni standard del modello sono progettate in modo che l'assorbimento di Fe da parte delle cellule sia massimo. In questo modo, il saggio biologico fornisce una vera misura del potenziale del cibo per fornire Fe.

Protocollo

NOTA: Come comodo punto di riferimento per i lettori, la seguente metodologia descrive le condizioni specifiche della coltura e i materiali richiesti per la misurazione della biodisponibilità del Fe da 20 campioni sperimentali, oltre ai controlli di qualità richiesti, in una serie del saggio biologico. L'aumento del numero di campioni oltre questa capacità non è raccomandato a causa del tempo necessario per varie colture cellulari e fasi di digestione in vitro all'interno del biotest.

1. Scelta della quantità di campioni

1. Per gli alimenti solidi o liquidi, determinare una quantità di alimenti che può essere considerata rappresentativa del campione da testare.
   1. Nel test per la biodisponibilità di Fe da una varietà di fagioli, utilizzare 100-150 g di semi di fagioli e trattare questa quantità in un campione omogeneo.
   2. Per campioni liquidi come succhi fortificati, prodotti lattiero-caseari e bevande sportive, assicurarsi che il cibo sia ben miscelato prima del campionamento.
      NOTA: La quantità di materiale di semi di fagioli sopra menzionata è essenziale per tenere conto delle differenze intrinseche tra i semi di questa coltura di base.

2. Preparazione dei campioni

1. Risciacquare via lo sporco e la polvere da qualsiasi campione di cibo con acqua distillata-deionizzata prima della lavorazione.
2. Elaborare la quantità appropriata di campione secondo gli obiettivi sperimentali, ad esempio mediante metodo di cottura e macinazione.
   NOTA: Per la cottura e la lavorazione, è fondamentale utilizzare pentole e attrezzature che non siano una potenziale fonte di contaminante Fe. Le attrezzature in acciaio inossidabile non contaminano; tuttavia, attrezzature come smerigliatrici per mulini a pietra, pentole in ghisa e qualsiasi attrezzatura non in acciaio inossidabile contenente Fe possono aggiungere quantità significative di Fe contaminante. Un macinino da caffè standard in acciaio inossidabile è spesso adeguato per la macinatura.
3. Liofilizzare e macinare in una polvere omogenea.
   NOTA: Una volta omogeneizzato, la ricerca ha dimostrato che tre repliche indipendenti di analisi sono adeguate per ogni alimento misurato.
   1. Se l'omogeneità del campione è difficile da raggiungere, rivedere la formulazione o la lavorazione del prodotto. Se ciò non è possibile, aggiungere repliche se la non omogeneità non è grave.
   2. Per la maggior parte degli alimenti solidi omogenei, utilizzare 0,5 g di campione liofilizzato per replica. Se necessario, utilizzare fino a 1,0 g di campione per replica, ma controllare se più di 0,5 g produce un beneficio nel grado di risposta.
      NOTA: Quantità superiori a 0,5 g di alimenti solidi possono ostruire la membrana di dialisi (vedere sotto).
   3. Utilizzare 1-2 ml di campioni liquidi.
      NOTA: La liofilizzazione spesso non è necessaria per i campioni liquidi.

3. Coltura cellulare di Caco-2

1. Colture di stock
   1. Acquistare celle Caco-2 da un fornitore certificato.
   2. Coltura delle cellule da flaconcini di riserva a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria al 5% di CO 2 (umidità costante) utilizzando il Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con 25 mM HEPES (pH_7,2 ), siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
   3. Una volta che sono disponibili cellule sufficienti, di solito dopo 7-10 giorni di coltura, seminare le cellule in palloni non rivestiti di collagene ad una densità di 30.000 cellule / cm².
   4. Scegliere la dimensione del pallone in base al numero di celle disponibili e necessarie per la semina di piastre multipozzetto.
      NOTA: In generale, i palloni T225 (225 cm 2) funzionano meglio per esperimenti in cui vengono utilizzate 11 piastre multipozzetto (6 pozzetti; 9,66 cm²/pozzetto) (10 piastre per confronti di campioni, 1 piastra per controlli di qualità) per saggio biologico.
   5. Coltivare le cellule in fiaschi per 7 giorni, cambiando il terreno a giorni alterni e utilizzare il 7^° giorno per seminare le piastre multipozzetto.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare un intervallo di passaggi non superiore a 10-15 passaggi da quando le cellule vengono avviate dalla coltura madre e successivamente utilizzate in una serie di esperimenti. I passaggi di coltura cellulare dovrebbero essere limitati in quanto un'ampia gamma di passaggi può comportare cambiamenti adattativi nella linea cellulare e, quindi, variabilità nella risposta del modello.
2. Coltura cellulare su piastre multipozzetto
   1. Seminare le cellule Caco-2 ad una densità di 50.000 cellule / cm² in piastre rivestite di collagene a 6 pozzetti.
      NOTA: questo passaggio di solito funziona meglio se eseguito di mercoledì. I seguenti passaggi renderanno evidente perché questo giorno della settimana è ottimale.
   2. Coltivare le cellule per 12 giorni a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria al 5% di CO 2 (umidità costante) utilizzando DMEM integrato con 25 mM HEPES (pH_7,2 ), 10% (v / v) FBS e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
      NOTA: La coltura dei monostrati cellulari per più di 12 giorni può causare una crescita eccessiva delle cellule. Ricerche precedenti hanno chiaramente dimostrato che, in queste condizioni, a 12 giorni dopo la semina, il monostrato cellulare è maturo, attaccato bene alla piastra e ottimale nella consistenza della risposta 29,30,31. Crescere le cellule più a lungo, ad esempio fino a 19-21 giorni, provoca una crescita eccessiva delle cellule e il mezzo si esaurisce rapidamente in sostanze nutritive, con conseguente monostrato malsano.
   3. Durante il periodo di 12 giorni, cambiare il mezzo almeno ogni 2 giorni su un programma giornaliero coerente.
   4. Il 12^{° giorno dopo} la semina, sostituire il terreno di coltura con 2 ml di Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]) integrato con 10 mM PIPES (piperazina-N,N'-bis-[acido 2-etansolfonico]), soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, idrocortisone (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fattore di crescita epidermico (20 μg/L).
      NOTA: Se la semina è iniziata di mercoledì, il 12^° giorno sarebbe un lunedì.
   5. Il giorno seguente (cioè il giorno 13), rimuovere il MEM e sostituirlo con 1 mL di MEM (pH 7).
      Nota : questo passaggio si verifica di martedì. Questo è il giorno in cui inizia il saggio biologico; Pertanto, il programma di 13 giorni offre il vantaggio di un programma settimanale coerente, consentendo al test biologico di essere condotto in modo coerente nello stesso giorno della settimana.

4. Digestione in vitro

1. Preparazione degli anelli di inserimento
   1. Creare un anello di inserimento sterilizzato utilizzando un O-ring in silicone dotato di una membrana di dialisi lavata con acido (Figura 1A).
      NOTA: Preparare gli inserti 1 giorno prima (cioè lunedì, giorno 12) del giorno del biotest e conservare in 18 MΩ acqua a 4 °C fino al momento dell'uso.
   2. Il giorno del biotest (martedì, giorno 13), rimuovere gli inserti dal frigorifero, scolare e sostituire l'acqua con 0,5 M HCl. Lasciare a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per almeno 1 ora prima dell'uso.
      NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima di rimuovere il MEM dalle piastre di coltura. Il lavaggio acido della membrana serve a rimuovere possibili contaminanti di Fe e sterilizza l'anello di inserimento e la membrana.
   3. Scolare lo 0,5 M HCl dagli inserti e risciacquare con acqua sterile da 18 MΩ. Conservare in acqua sterile da 18 MΩ a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare fino al momento dell'uso.
   4. Inserire un anello in ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti con celle Caco-2, creando così un sistema a due camere. Restituire le piastre con gli inserti all'incubatore.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito subito dopo l'aggiunta di 1,0 mL di MEM a ciascun pozzetto (vedere il punto 3.2.5.).
2. Preparazione della soluzione di pepsina
   1. Il giorno dell'esperimento, preparare la soluzione di pepsina sciogliendo 0,145 g di pepsina in 50 ml di 0,1 M HCl. Agitare delicatamente la soluzione su uno shaker a piattaforma per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Preparazione della soluzione pancreatina-bile
   1. Lo stesso giorno dell'esperimento, preparare 0,1 M NaHCO 3 sciogliendo 2,1 g di NaHCO₃ in 250 ml di 18 MΩ di acqua.
   2. Mescolare 0,35 g di pancreatina e 2,1 g di estratto biliare in 175 ml di 0,1 M NaHCO₃.
   3. Una volta solubilizzati la pancreatina e l'estratto biliare, aggiungere 87,5 g di una resina a scambio cationico debole (vedere la tabella dei materiali) e mescolare agitando per 30 minuti a temperatura ambiente.
   4. Versare il liquame in una grande colonna e raccogliere l'eluato.
   5. Eluire la colonna con altri 70 ml di 0,1 M NaHCO₃, raccogliendo questo volume nella soluzione biliare pancreatica.
      NOTA: Lo scopo della resina è quello di rimuovere il contaminante Fe comunemente presente negli estratti pancreatina-bile.
4. Avviare la digestione in vitro .
   1. Pesare il campione in una provetta sterile da centrifuga da 50 mL (polipropilene), seguita dall'aggiunta di 10 mL di soluzione fisiologica a pH 2, contenente 140 mM NaCl e 5 mM KCl.
   2. Avviare il processo di digestione gastrica aggiungendo 0,5 ml della soluzione di pepsina suina preparata al campione e incubare su uno shaker a dondolo a bassa temperatura per 1 ora a 37 °C.
   3. Dopo questo periodo, avviare il processo di digestione intestinale di ciascun campione regolando il pH a 5,5-6,0 con 1,0 M NaHCO₃.
   4. Aggiungere 2,5 ml della soluzione pancreatina-bile a ciascuna provetta e regolare il pH a 6,9-7,0 con 1,0 M NaHCO₃.
   5. Una volta regolato il pH, equalizzare il volume in ciascun tubo utilizzando una soluzione di 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7), misurando il peso del tubo con un valore target di 15 g.
      NOTA: Per alcuni alimenti, potrebbe essere necessario portare il volume totale a 16 g o 17 g, a seconda della capacità tampone degli alimenti.
   6. Trasferire 1,5 ml di ciascun digest intestinale nella camera superiore (cioè contenente l'anello di inserimento con la membrana di dialisi) di un pozzetto corrispondente della piastra di coltura a 6 pozzetti contenente le cellule Caco-2 (Figura 1B).
   7. Riposizionare il coperchio della piastra e incubare a 37 °C (5% CO 2 atmosfera d'aria) su uno shaker oscillante a 6 oscillazioni/min per₂ ore.
   8. Rimuovere l'anello di inserimento con il digestore e aggiungere un ulteriore 1 mL di MEM (pH 7) a ciascun pozzetto.
   9. Riportare la piastra di coltura cellulare nell'incubatore (37 °C; 5% CO₂ atmosfera d'aria) per altre 22 ore.
   10. Dopo 22 ore, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 2,0 ml di acqua 18 MΩ al monostrato cellulare.
       NOTA: L'acqua lisa osmoticamente le cellule.
   11. Raccogliere l'intero lisato cellulare in provette standard di microcentrifuga in polipropilene o simili per le successive analisi delle proteine cellulari e della ferritina cellulare.

5. Misurazione della ferritina cellulare Caco-2 e della proteina cellulare

1. Utilizzare il lisato cellulare del punto 4.4.10. per la misurazione della ferritina cellulare e delle proteine.
   1. Per misurare il contenuto di ferritina delle cellule Caco-2, seguire le istruzioni del kit (vedere la Tabella dei materiali), ad eccezione dell'aumento del tempo di incubazione da 30 minuti a 2 ore per il coniugato topo anti-ferritina anticorpo-perossidasi di rafano (HRP).
   2. Per misurare le proteine cellulari, seguire le istruzioni fornite nel kit di proteine cellulari (vedere la tabella dei materiali).

Risultati

Identificazione e misurazione della biodisponibilità del Fe nelle colture alimentari di base
Uno dei motivi principali per lo sviluppo di questo modello è stato quello di identificare i fattori che influenzano la biodisponibilità di Fe nelle colture alimentari di base e fornire uno strumento per i selezionatori di piante che consentisse loro di identificare e sviluppare varietà con una maggiore biodisponibilità di Fe. Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris) è stato preso di mira a livell...

Discussione

Fin dal suo inizio, sono stati pubblicati numerosi studi che descrivono questo metodo per il biotest delle cellule Caco-2. Le condizioni di base sono rimaste relativamente invariate dalla pubblicazione iniziale nel 1998¹⁸. Tuttavia, negli ultimi 20 anni, numerosi dettagli tecnici sono stati perfezionati e standardizzati per produrre una coerenza senza precedenti nella risposta del saggio biologico. Un'aderenza attenta e precisa alla coltura cellulare e alle condizioni di digestione in vitro

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific