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要約

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。

要約

タイプ3分泌システム(T3SS)は、グラム陰性菌が真核生物宿主細胞の細胞質ゾルに直接エフェクタータンパク質のバッテリーを注入することを可能にします。侵入すると、注入されたエフェクタータンパク質は真核生物のシグナル伝達経路を協調的に調節し、細胞機能を再プログラムして、細菌の侵入と生存を可能にします。感染の状況下でこれらの分泌されたエフェクタータンパク質をモニタリングおよび局在化することは、宿主-病原体相互作用の動的インターフェースを定義するためのフットプリントを提供します。しかし、宿主細胞内の細菌タンパク質の構造/機能を破壊することなく標識およびイメージングすることは技術的に困難です。

蛍光融合タンパク質を構築しても、融合タンパク質は分泌装置を詰まらせて分泌されないため、この問題は解決しません。これらの障害を克服するために、我々は最近、遺伝暗号拡張(GCE)を用いて、細菌分泌エフェクターやその他の標識が困難なタンパク質の部位特異的蛍光標識法を採用しました。この論文では、GCE部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識するための完全なステップバイステップのプロトコルを提供し、その後、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をイメージングするための指示を提供します。

最近の知見は、GCE を介して 非標準アミノ酸(ncAA)を取り込み、続いてテトラジン含有色素による生体直交標識を行うことが、細菌分泌タンパク質の選択的標識と可視化、およびその後の宿主での画像解析のための実行可能な技術であることを示唆しています。この記事の目的は、GCEを使用して超解像イメージングを実施し、細菌やウイルスのさまざまな生物学的プロセス、および宿主と病原体の相互作用を研究することに関心のある研究者が採用できる、簡単で明確なプロトコルを提供することです。

概要

細菌感染症は長い間、人間の健康に対する深刻な危険と見なされてきました。病原体は、高度に進化し、非常に強力で複雑な防御システム、およびさまざまな細菌の病原性因子(エフェクタータンパク質と呼ばれる)を使用して、宿主の免疫応答を回避し、感染を確立します1,2。しかし、これらの系の根底にある分子メカニズムと個々のエフェクタータンパク質の役割は、病因発生時に宿主細胞内の重要なタンパク質成分とエフェクターを直接追跡するための適切なアプローチが不足しているため、まだほとんど知られていません。

典型的な例の1つは、急性胃腸炎を引き起こすサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムです。サルモネラチフィムリウムは、タイプ3分泌系(T3SS)を使用して、さまざまなエフェクタータンパク質を宿主細胞に直接注入します。サルモネラ菌が宿主細胞に入るとすぐに、サルモネラ菌含有液胞(SCV)3,4と呼ばれる酸性膜結合コンパートメントに存在します。SCVの酸性pHは、サルモネラ病原性アイランド2(SPI-2)にコードされたT3SSを活性化し、液胞膜を横切って20以上のエフェクタータンパク質のボレーを宿主細胞質ゾル5,6,7,8に移動します。宿主内では、これらの複雑なエフェクタータンパク質のカクテルが宿主細胞のシグナル伝達経路を協調的に操作し、その結果、SCVから微小管に沿って伸びた非常にダイナミックで複雑な管状膜構造が形成され、サルモネラ菌誘発フィラメント(SIF)と呼ばれ、サルモネラ菌が宿主細胞内で生存および複製できるようになります9,10,11。

細菌のエフェクター局在を視覚化、追跡、モニタリングし、宿主細胞内での輸送と相互作用を調べる方法は、細菌の病因を支えるメカニズムへの重要な洞察を提供します。宿主細胞内でのサルモネラ菌分泌T3SSエフェクタータンパク質の標識と局在化は、技術的な課題であることが証明されています12,13;それにもかかわらず、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の開発は、生体系内のタンパク質を研究し視覚化する私たちの能力を変えました。しかし、蛍光タンパク質のサイズ(~25-30 kDa)15は、多くの場合、目的のタンパク質のサイズと同等かそれ以上です(POI、例えば、SsaPの場合は13.65 kDa、SifAの場合は37.4 kDa)。実際、エフェクターの蛍光タンパク質標識は、標識されたエフェクターの分泌を遮断し、T3SS14を詰まらせることがよくあります。

さらに、蛍光タンパク質は安定性が低く、光退色前に放出する光子の数が少ないため、超解像顕微鏡技術16、17、18、特に光活性化局在顕微鏡(PALM)、STORM、および誘導放出枯渇(STED)顕微鏡での使用が制限されています。有機蛍光色素の光物性は蛍光タンパク質の光物性よりも優れていますが、CLIP/SNAP19,20、Split-GFP 21、ReAsH/FlAsH 22,23、HA-Tags 24,25などの方法/技術には、翻訳後修飾またはトラフィッキングを妨害することにより、目的のエフェクタータンパク質の構造機能を損なう可能性のある追加のタンパク質またはペプチド付加が必要です。必要なタンパク質修飾を最小限に抑える代替方法として、GCEを介した翻訳中にncAAをPOIに組み込む方法があります。ncAAは蛍光性であるか、またはクリックケミストリー12、13、26、27、28を介して蛍光にすることができる。

GCEを使用すると、微小で機能的な生物学的直交基(アジド、シクロプロペン、シクロオクチン基など)を持つncAAを、標的タンパク質のほぼすべての場所に導入できます。この戦略では、ネイティブコドンは、POIの遺伝子内の指定された位置にあるアンバー(TAG)終止コドンなどのまれなコドンと交換されます。修飾されたタンパク質は、その後、直交アミノアシル-tRNA合成酵素/tRNAペアと一緒に細胞内で発現されます。tRNA合成酵素活性部位は、1つの特定のncAAのみを受け取るように設計されており、その後、アンバーコドンを認識するtRNAの3'末端に共有結合します。ncAAは単に増殖培地に導入されますが、細胞に取り込まれて細胞質ゾルに到達しなければならず、そこでアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)がそれを直交tRNAにリンクすることができます。その後、指定された位置のPOIに組み込まれます(図1を参照)12。したがって、GCEは、ケトン、アジド、アルキン、シクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジン、ノルボネン、α、β不飽和アミド、ビシクロ[6.1.0]-ノニンなどの多数の生体直交反応性基をPOIに組み込むことを可能にし、従来のタンパク質標識法の制限を克服する可能性があります12,26,27,28。

超解像イメージング技術の最近の新たなトレンドは、分子レベルで生物学的構造を調査するための新しい道を開きました。特に、1分子、局在化ベースの超解像技術であるSTORMは、~20-30 nmまでの細胞構造を可視化するための貴重なツールとなり、一度に1分子ずつ生物学的プロセスを調査することができ、従来のアンサンブル平均研究ではまだ知られていない細胞内分子の役割を発見しました13。.単一分子および超解像技術では、最高の分解能を得るために、明るく光安定性のある有機蛍光色素を含む小さなタグが必要です。我々は最近、GCEが超解像イメージングに適したプローブを組み込むために使用できることを実証しました12。

細胞内のタンパク質標識のための最良の選択肢の2つは、ビシクロ[6.1.0]ノニネリジン(BCN)およびトランスシクロオクテン-リジン(TCO;図1に示す)であり、これらはtRNA/シンテターゼペアの変異体(ここではtRNA Pyl/PylRS AFと呼ばれる)を使用して遺伝的にコードされている可能性があり、ここでPylはピロリジンを表し、AFはピロリジン12を自然にコードするメタノサルシナマゼイに由来する合理的に設計された二重変異体(Y306A、Y384F)を表します。 29,30,31。ひずみ促進逆電子要求ディールス・アルダー環化付加(SPIEDAC)反応により、これらのアミノ酸はテトラジン結合体と化学選択的に反応します(図1)12,30,31。このような環化付加反応は非常に速く、生細胞と互換性があります。それらはまた、適切なフルオロフォアがテトラジン部分12、26、32で官能化されている場合、蛍光性であってもよい。この論文では、GCEを使用して宿主細胞に送達された細菌エフェクターのダイナミクスをモニタリングするための最適化されたプロトコルを提示し、その後、dSTORMを使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をモニタリングします。この結果は、GCEを介したncAAの取り込みとそれに続く蛍光発生テトラジン含有色素とのクリック反応が、選択的標識、分泌タンパク質の可視化、およびその後の宿主における細胞内局在化のための汎用性の高い方法であることを示しています。ただし、ここで詳述するすべてのコンポーネントと手順は、GCEシステムを他の生物学的問題を調査するように調整または置換することができます。

プロトコル

1. プラスミド構築

  1. POIを発現する遺伝子を、大腸菌BL21(DE3)でPOIを発現する発現プラスミド(例えば、pET28a-sseJ 10TAG)にクローニングする。この工程は、変異体が機能的であるとの判定を容易にする。
  2. 宿主細胞におけるサルモネラ菌分泌エフェクターの可視化のために、以前の報告7、12、24に記載されているように、天然プロモーターの制御下で標的POI SseJを発現する発現プラスミド(pWSK29-sseJ-HA)を構築します。部位特異的突然変異誘発法を用いて、フェニルアラニン-10のコドンをSseJ(pWSK29-sseJ 10TAG-HA)のアンバーコドン(TAG)に置換し、AAT-TAG-ACTモチーフを確保します33,34。
  3. 上記のプラスミドに加えて、トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン(TCO*A)をPOIに遺伝的に組み込むには、プラスミドpEVOLにコードされた進化したtRNA/シンテターゼペア(tRNAPyl/PylRS AF)遺伝子を含む別の発現プラスミド(pEVOL-PylRS-AF)31を使用します。
    注:プラスミドおよびクローニングプロトコルの詳細な説明は、以前のレポート30、31に記載されています。
  4. 市販のプラスミド調製キットを使用して、高品質のプラスミドDNAを入手してください。精製されたDNAの場合、最適な260/280の比率は~1.8です。必要に応じて、1%アガロースゲル電気泳動を使用してDNA純度を確認します。

2.細菌培養の準備

  1. 変異体が大腸菌で機能していることを試験するための二重形質転換体の入手
    1. BL21コンピテントセルを-80°Cから取り出し、氷上で約20〜30分間解凍します。
    2. 1–5 μLの各プラスミド(~50 ngのpEVOL-PylRS-AFおよびpET28a-sseJ 10TAG)を200 μLの化学的に有能なBL21細胞と1.5 mLの微量遠心チューブで混合します。コンピテントセルとプラスミド混合物を穏やかに混合します。氷上で30分間インキュベートします。
    3. 微小遠心チューブを42°Cの水浴中で45秒間ヒートショックします。チューブを2分間氷上に戻します。
    4. 1 mLの温かいLB培地を微量遠心チューブに加え、混合物を15 mLのコニカルチューブにすばやく移します。細胞を振とう機で37°C、250 rpmで1時間インキュベートします。形質転換細胞の一部または全部を、適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上にプレートする。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      注:このプロトコルでは、35 μg/mLのクロラムフェニコールと50 μg/mLのカナマイシンを使用して、それぞれpEVOL-PylRS-AFとpET28a-sseJ 10TAGを選択しました。変換ステップでは、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを使用して成功したトランスフォーメーションを評価します。
  2. 変異体をサルモネラ菌に移し、宿主細胞中のサルモネラ菌分泌エフェクターを可視化します。
    1. 冷却したマイクロ遠心チューブ内で、pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGをそれぞれ2〜3 μLの電気コンピテントサルモネラチフィムリウム14028株40〜60 μLに加えます。混合物をピペットで穏やかに混合する。
    2. エレクトロポレーション混合物を冷却(0.2cm電極ギャップ)キュベットに移す。エレクトロポレーションの設定を 2.5 kV、200 Ω、25 μFに設定します。キュベットをエレクトロポレーションチャンバー内に置きます。チャンバー電極がマイクロパルサーキュベットとしっかりと接触していることを確認してください。
    3. ビープ音が鳴るまで パルス ボタンを押し続けます。
    4. すぐに1mLの温かいLB培地をキュベットに加えます。内容物全体を15mLのコニカルチューブに移します。細胞を37°Cでインキュベートし、250rpmで1時間振とうします。
    5. サルモネラ菌のエレクトロポレーション混合物の一部または全部を、適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上にプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      注:このプロトコルでは、35μg/mLのクロラムフェニコールと100μg/mLのアンピシリンをそれぞれpEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGの選択に使用しました。
  3. 培養準備
    1. サルモネラ菌または大腸菌の単一コロニーを、適切な抗生物質を含む5 mLのLB培地に接種します。37°Cで一晩増殖させ、250rpmで振とうする。

3. ncAA含有タンパク質の発現と蛍光標識

  1. 大腸菌におけるncAA含有タンパク質の発現
    1. 100 μLの初代培養液を、35 μg/mLのクロラムフェニコールと50 μg/mLのカナマイシンを含む5 mLのLB培地(1:50希釈)に移し、続いてOD600 が0.4〜0.6に達するまで250 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
    2. 1 mM TCO*A ストック溶液 (10 mL; 表 1)。
    3. 培養液がOD600 = 0.4〜0.6に達したら、LB培地を1 mM TCO*A、35 μg/mLクロラムフェニコール、および50 μg/mLカナマイシンを含む新しいLBと交換します。
      注:または、ステップ5.4.2の説明に従ってTCO*Aストック溶液を調製することもできます。
    4. 1 mM IPTG、0.2%アラビノースの存在下でタンパク質発現を誘導し、34°C、250 rpmで一晩振とうします。11,000 × gで5分間遠心分離して菌体を回収します。上清を除去し、さらに使用するまでペレットを-20°Cで凍結させる。
    5. 対照実験では、同じ実験を繰り返しますが、ncAAの非存在下でncAA含有タンパク質を発現させます。大腸菌におけるncAA保有タンパク質のin vitro蛍光標識については、ステップ3.3に記載されている詳細な手順に従ってください。
  2. サルモネラ菌におけるncAA含有タンパク質の発現
    1. 初代培養液100 μLを、クロラムフェニコール35 μg/mLとアンピシリン100 μg/mLを含むLB培地5 mL(1:50希釈)に移し、37°Cでインキュベートし、OD600 が0.6に達するまで250 rpmで振とうします。
    2. 表1に記載のように修飾N-最小培地(MgM、pH 5.6)を調製する。
    3. LB培地を、1 mM TCO*Aを添加した修飾N-最小培地(MgM)と交換します(表1)。細菌を34°Cで30分間増殖させます。次に、0.2%アラビノース、25 mg / mLクロラムフェニコール、および100 mg / mLアンピシリンを加え、250 rpmで振とうしながら、さらに6時間細胞を増殖させます。
    4. 6時間後、ncAAを含まない新鮮なMgM(pH 5.6)培地(表1)で、30分間隔で細菌を4回洗浄します。洗浄ステップでは、室温で15分間972× gを使用します。
    5. 細菌を遠心分離し、1x PBSバッファーに再懸濁し、暗所で4°Cで1時間インキュベートして、過剰なncAAを除去します。1時間後、細菌を3,000 × g、4°Cで15分間遠心分離し、さらに使用するために保存します。
    6. 対照実験では、ncAAの非存在下でncAA含有タンパク質を発現させることにより、同じ実験を繰り返します。
  3. ネズミチフス菌におけるncAA含有タンパク質のin vitro蛍光標識
    1. SseJ-F10TCO-HAを発現する サルモネラ 細胞をTCO*Aの非存在下または存在下(ステップ3.2から)で1x PBSに再懸濁します。PBSでOD600 を4に調整します。細胞を20 μM Janelia Fluor 646-テトラジン(JF646-Tz)または20 μM BDP-Fl-テトラジン(DMSO中の5 mMストック溶液)とともに暗所で37°Cでインキュベートし、250 rpmで1〜2時間振とうします。
    2. 細胞をペレット化し、5%DMSOおよび0.2%プルロニックF-127を含むPBSで3〜4倍洗浄し、5%DMSOを含むPBSに再懸濁し、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。1x PBSで2回もう一度洗います。洗浄ステップでは、972 × gを使用し、室温で15分間使用します。
    3. 共焦点顕微鏡を使用して細胞をすぐにイメージングするか、PBS中の1.5%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温暗所で30〜45分間固定します。
    4. 固定した細胞をPBSで2回洗浄し、最後にPBS中の50 mM NH4Clで15分間洗浄して、余分なPFAを除去します。細胞をPBSに再懸濁し、4°Cで3〜4日以内保存します。セクション6で説明されているように、共焦点顕微鏡を使用して細菌を画像化します。

4. ncAA含有タンパク質の生化学的特性評価

  1. 細胞溶解
    1. セクション3.1の細胞を溶解バッファー(表1)に再懸濁し、室温で30分以上インキュベートします。混合物を氷上で15分間冷やす。
      注: 使用する細胞重量に対する溶解バッファー の比率を 1:10に保ちます。
    2. まだ氷上で再懸濁した細胞を超音波処理します。超音波処理器を使用して、少なくとも6倍の設定7で30秒間パルスし、1分のギャップがあります(材料の表を参照)。
    3. 細胞ライセートを20,500 × g、4°Cで15分間スピンダウンします(4°Cを維持することが重要です)。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。
  2. SDSページ分析
    1. 5x SDSローディング色素を準備します(表1)。5 μLのSDSゲルローディングバッファーを13 μLの細胞ライセートに加えます。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルバッファーを2 mLチューブ中で95°Cで10分間変性させ、混合物を2,000 × g で50秒間遠心分離し、12%SDSポリアクリルアミドゲルにロードします。
    2. ゲルカセットを組み立て、ゲル電気泳動装置に入れ、電気泳動装置を電源に接続します。ランニングバッファーを注ぎ、分子量マーカーとタンパク質サンプルをロードし、ブロモフェノールが分離ゲルの底に達するまで100 Vでゲルを実行します。
      注:-20°Cで保存されたライセートは、凍結融解サイクルのたびに品質が低下する傾向があるため、すぐに分析を開始してください。
    3. ゲルをクーマシーブループロテイン染色で染色します。

5. HeLa細胞におけるサルモネラ 菌分泌エフェクターSseJ-F10TCO-HAの生体直交標識

  1. ペニシリン-ストレプトマイシン(1x)に加えて10%(v/v)FBSを添加した高グルコース(4.5 g / L)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で、HeLa細胞を37°C、5%CO2、湿度95%で培養および維持します。
  2. 感染の1日前に細菌を培養する。pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGを含むサルモネラ菌14028の単一コロニーを、抗生物質含有標準LBブロス5 mLに37°C、250 rpmで一晩振とうします。
  3. 感染の1日前にHeLa細胞を播種します。HeLa細胞を含む組織培養フラスコ(T-75)を~80%のコンフルエントで取り、細胞密度の顕微鏡検査によって決定します。温かいPBSで細胞を洗います。3 mLの温かい0.25%トリプシン/EDTAで細胞を37°C、5%CO2で5分間剥離します。
    1. 2 mLのDMEM(+10%FBS)を使用してトリプシンをクエンチします。細胞を再懸濁した後、フラスコの内容物全体を15 mLチューブに移します。セルを1,000 × g で5分間スピンダウンします。上清をチューブから取り出します。HeLa細胞ペレットを予温した増殖培地に再懸濁します。
    2. 血球計算盤を使用して懸濁液を調べ、存在する細胞を数えます。希釈した細胞ストックを1×105 細胞/mLで調製します。ウェルあたり0.5 ×10 5 HeLa細胞を500 μLのDMEM + 10%FBS増殖培地に8ウェルチャンバースライドで播種します。チャンバースライドをインキュベーター内の37°C、5%CO2、湿度95%で24時間保持します。
  4. 細菌感染
    1. pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGを保有する継代培養サルモネラ菌14028sを、100 μLの一晩細菌培養物(ステップ5.2から)を35 μg/mLクロラムフェニコールおよび100 μg/mLアンピシリンを含む3 mLのLB培地(1:30希釈)に希釈し、続いて37°Cで250 rpmで5〜7時間振とうしてインキュベートします。
      注:この段階では、培養物は指数関数的後期に達し、細菌は非常に侵襲的です。
    2. 100 mM TCO*Aストック溶液と完全な培地を準備します(表1)。
    3. HeLa細胞感染を開始するには、インキュベーターからHeLa細胞を取り出し、予熱したDPBSで細胞を洗浄してから、500 μLの新鮮なDMEM(+10%FBS)を各ウェルに加えます。感染が始まるまでチャンバースライドをCO2 インキュベーターに戻します。
    4. 5〜7時間のインキュベーション後、サルモネラ菌培養物を1 mLのDMEM増殖培地(~3 × 108 cfu/mL)でOD600 = 0.2に希釈します。チャンバースライドの各ウェルに必要量のサルモネラ菌種源を追加して、感染多重度(MOI)が100になるようにします。
    5. 感染細胞をCO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。細胞外サル モネラ菌を除去するために、予熱したDPBSで細胞を3回洗浄します。この時点を感染後0時間に設定します。100 μg/mLのゲンタマイシンを含む完全培地(表1)500 μLを1時間加えます。1時間後、細胞をDPBSで3倍洗浄します。500 μLの完全な培地を追加します(ステップ5.4.2; 表1)チャンバースライドの各ウェルに0.2%アラビノース、10 μg/mLのゲンタマイシンを添加しました。
    6. 対照実験では、TCO*AなしでHeLa細胞の同様の感染を行います。
    7. チャンバースライドをCO2 インキュベーター内で10時間インキュベートします。
  5. 生細胞における化学ベースの標識をクリック
    1. 細菌感染細胞の標識に進みます。TCO*Aなしで培地全体を予熱します(表1)。
    2. 感染後10時間後、完全培地をTCO*Aを含まない新鮮な完全培地と交換し、予熱したDPBSでそれぞれ30分間隔でHeLa細胞を4回洗浄し、続いて新しい完全培地(TCO*Aなし)を洗浄します。
    3. DMSO中の0.5 mM色素テトラジンストック溶液を調製します。
      注:宿主細胞中の サルモネラ 菌分泌エフェクターを標識するために、2つのプロトコルが提示されています。プロトコル1では、JF646-Tzストックをウシミルクからの1%カゼインナトリウム塩を含む1x PBSで希釈して色素混合物を調製し、最終的な作業溶液が2 μMになるようにします。プロトコル2では、温かい完全培地(FBSおよびTCO*Aを含まない)を準備し、2 μM JF646-TZを追加します。 この色素混合物をラベリングセッションごとに新鮮にします。可能であれば暗闇の中で作業します(フードや部屋の照明を暗くします)。
    4. 感染後12時間後、細胞から培地を吸引します。予熱したDPBSでセルを2回または3回洗浄します。あるグループのウェルに、プロトコル1に記載されている色素溶液混合物500 μLを追加し、同じチャンバースライドの別のグループのウェルに、ステップ5.5.3および後の注で述べたプロトコル2に記載されている色素溶液混合物500 μLを追加します。チャンバースライドをCO 2インキュベーターに1.5〜2 時間戻します。
    5. 感染後13.5〜14時間後、予熱したDPBSでHeLa細胞を2回すすぎます。500 μLの新鮮なDMEM(FBSを補給)を加えます。チャンバースライドをインキュベーターに30分間戻します。予熱したDPBSで細胞を洗浄し、続いて新鮮なDMEMを30分間隔で4回洗浄します。
    6. 感染後16時間で、各ウェルに200 μLの4%PFAを添加し、暗所で室温で10分間インキュベートすることにより、HeLa細胞をPFAで固定します。PFAを吸引し、PBSで3回すすぎ、細胞を暗所で4°CのPBSに保存します。
      注意: PFAは非常に有毒な化学物質です。吸入、皮膚や目の接触を避けてください。取り扱うときは保護具を着用してください。標識されたサンプルが光にさらされないようにするには、細胞培養フードの光を消してください。
  6. HAタグ付きタンパク質の免疫染色
    1. PBSを吸引し、ブロッキング溶液で一度すすいでください(表1)。
    2. 固定したHeLa細胞をPBSベースの一次抗体溶液(表1)とともに、暗所で室温で1時間インキュベートします。ウサギ抗HA一次抗体を使用して、分泌されたSseJを染色します(1:500希釈)。
    3. 1時間後、0.5 mLの0.1%トゥイーン-20/1x PBSで細胞を2回穏やかに洗浄します。Tween/PBS溶液で洗浄しながら、細胞を0.5 mLの0.1%Tween20/1x PBSで5分間インキュベートします。
    4. 二次抗体ロバ抗ウサギ555 1:500を二次抗体溶液で希釈し、暗所で室温で1時間インキュベートします。
    5. 1時間後、細胞を0.5 mLの0.1%トゥイーン-20/1x PBSで2回穏やかに洗浄し、0.5 mLの0.1%トゥイーン20/1x PBSで2回5分間インキュベートします。
    6. 細胞を0.5 mLの1x PBSで3回洗浄し、暗所で4°Cで保存します。
      注:固定細胞は、4°CのPBSに数週間保存できます。 免疫染色は土壇場で行われるべきです。

6. 共焦点イメージング

  1. スピニングディスク(SD)やSTED顕微鏡などの共焦点顕微鏡を使用してください。
    1. スキャンモード(XYZ)、スキャン速度(400 Hz)、解像度(512 x 512)、倍率(100x)、Zスタッキングなどの画像取得設定を調整します。
    2. DAPI、BDP-Tz、およびJF646テトラジン用の正しい励起/発光フィルターを使用してください。
      注:このプロトコルでは、パルス白色光レーザーを備えたSTED顕微鏡システムで共焦点イメージングが実行され、470〜670 nmの範囲の励起と、405 nm、488 nm、および647 nmでの励起用のUV405 nmダイオードレーザーを選択できました。適切な発光範囲は、内蔵の音響光学ビームスプリッターと、共焦点システムのプリズムベースの調整可能なマルチバンドスペクトル検出を組み合わせて設定されました。
    3. 100×/1.4の油浸対物レンズを使用して画像を取得します。

7. 超解像(dSTORM)イメージング

  1. 撮影の3時間前に顕微鏡の電源を入れて、熱平衡を確保します(これより前にイメージングを開始すると、ドリフトが発生する可能性が高くなります)。カメラを-70°Cに冷却します。
  2. その間、新鮮なGLOX-BMEイメージングバッファーを準備します(表1)。
  3. 細胞を顕微鏡に持ってきます。イメージングチャンバーをサンプルホルダーの顕微鏡ステージに置きます。ホルダーで、サンプルが平らで安全であることを確認してください。ウェル内の培地を、新たに作製したGLOX-BMEイメージングバッファー0.4 mLで交換します。
  4. 正しいレーザーラインとフィルターセットを設定します。レーザー出力を~1 mWに下げて、目的のHeLaセルを特定します。647 nmの低いレーザー密度でサンプルを照らしながら、焦点面とレーザービーム角度を調整します(この場合、HILOは信号対バックグラウンド[SBR]を上げるため、急傾斜角[HILO]が推奨されます)。HILO 照明角度を調整します。
    注:このプロトコルでは、Tirf対物レンズ(100x Apo TIRF油浸対物レンズ、NA 1.49)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡( 材料の表を参照)を使用して、Alexa Fluor 647チャンネルでSseJの超解像イメージングを取得しました。蛍光は、μManagerを介して制御されたEMCCDカメラで検出されました。
  5. プリアンプのゲインを3に設定し、μManagerでフレーム転送を有効にします。以前のレポート35で説明したように、dSTORM測定の感度を高めるには、EMゲインを200に設定します。
  6. dSTORMイメージングの前に、ターゲット構造の基準回折制限画像をキャプチャします。蛍光色素を暗状態に切り替えるには、レーザーを最大出力までオンにします。
    注:JF646蛍光色素が647 nm励起光の連続照射によって主に暗い状態に変化したときに、JF646蛍光色素の個々の急速に点滅する分子が観察されました(前述のように36)。
  7. 点滅イベントが空間と時間で区切られる適切なレベルにレーザー強度を調整し、露光時間を30ミリ秒に設定して、取得を開始します。10,000〜30,000フレームを取得します。
    注意: まばたきを最適化するには、レーザー強度を変更する必要があります。検出されたイベント(重なり合う粒子の点滅)が多すぎる場合は、レーザー強度を上げることを検討してください。理想的な長さはサンプルの品質によって異なりますが、~10,000フレームは識別可能な特徴を示す必要があります。

8. dストームの画像再構成

  1. 画像解析には適切なソフトウェアを使用してください。
    注:利用可能な多くのオープンソースの画像再構成プログラムの1つであるThunderSTORMについて、以下で簡単に説明します。
  2. ImageJを開き、生データをインポートします。ThunderSTORMプラグインを開き、デバイスに対応するカメラ設定を構成します。
  3. [分析の実行]に移動し、画像フィルタリング(平均化フィルターの差)、局在化方法(極大)、分子のサブピクセル局在(積分ガウスPSF)などの適切な設定を行います。[OK] をクリックして、イメージの再構築を開始します。
    注:必要に応じて、ThunderSTORMでパラメータを設定するための詳細な手順はすでに説明されています37。

結果

このプロトコルペーパーでは、図1に示すように、サルモネラ菌分泌エフェクターの部位特異的蛍光標識と可視化のためのGCEベースの方法について説明します。トランスシクロオクテンバイオ直交基(TCO)を有するncAAと蛍光色素の化学構造を図1Aに示す。SseJ標識は、GCE技術を介した直交アミノアシル-tRNA合成酵素/...

ディスカッション

本明細書に記載のアプローチは、感染後に細菌T3SSによって宿主細胞に注入されたエフェクタータンパク質の正確な位置を追跡するために使用された。T3SSは、サルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア菌などの細胞内病原体によって、病原性成分を宿主に輸送するために使用されます。超解像イメージング技術の開発により、これまで想像もできなかった解像度で病原性因子を?...

開示事項

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

謝辞

この作業は、テキサス州ガルベストンのテキサス大学医学部からのスタートアップ資金と、L.J.K.へのテキサススター賞によってサポートされました。プラスミドpEVOL-PylRS-AFについて、Edward Lemke教授(欧州分子生物学研究所、ハイデルベルク、ドイツ)に感謝します。 図1 の画像は、BioRenderを使用して作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris/Glycine SDS running bufferBIO-RAD1610732
Ammonium chlorideFischer ScientificA661-500
Ammonium sulphateFischer ScientificBP212R-1
Ampicillin SodiumSigma-AldrichA01665 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermiFischer Scientific15240096
ArabinoseSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-tetrazineLumiprobe (USA)2.14E+02
β-mercaptoethanolMillipore444203250 mL
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
CaseinSigma-AldrichC8654
CatalaseSigma-AldrichC9322
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ SpectrophotometerDeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibodyInvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
EMCCD CameraAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)Eppendorf, Hamburg, Germany30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)Fischer10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm)Fischer Scientific97203Pack of 100
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBIO-RAD1652660
GentamycinSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
Glucose oxidaseSigma-AldrichG7141-50KU
GlycerolFischer ScientificBF229-4
HeLa cellsATTCCCL-2
HEPES BufferCorning25-060-C1100 mL
Hydrocloric acidFischer ScientificA144-212
ImageJImage processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LCoomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazineTocris Bioscience7279
KanamycinSigma-Aldrich606155 g
LB BrothBD Difco244620500 g
LysozymeSigma-AldrichL6876
μManager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20860.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture FlasksThermiFischer Scientific156499
Omnipur Casamino AcidCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Electron Microscopy Sciences 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFFor plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep KitQiagen27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasicFischer ScientificP285-500
Potassium sulphateAcros Organic424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibodySigma-AldrichH6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028sRef.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sodium hydroxideFischer ScientificSS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Sonic Dismembrator Model 100Fischer Scientific24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)Leica Microsystems, Wetzlar, Germanyhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%  GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well tissue culture chamber slidesSARSTEDT94.6190.802

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