АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье представлен простой и понятный протокол для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием расширения генетического кода (GCE) и визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии (dSTORM)

Аннотация

Системы секреции третьего типа (T3SS) позволяют грамотрицательным бактериям вводить батарею эффекторных белков непосредственно в цитозоль эукариотических клеток-хозяев. При входе введенные эффекторные белки совместно модулируют эукариотические сигнальные пути и перепрограммируют клеточные функции, обеспечивая проникновение и выживание бактерий. Мониторинг и локализация этих секретируемых эффекторных белков в контексте инфекций обеспечивает след для определения динамического интерфейса взаимодействий хозяина и патогена. Однако маркировка и визуализация бактериальных белков в клетках-хозяевах без нарушения их структуры/функции технически сложны.

Построение флуоресцентных слитых белков не решает эту проблему, потому что слитые белки заклинивают секреторный аппарат и, таким образом, не секретируются. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы недавно применили метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки эффекторов, секретируемых бактериями, а также других трудно маркируемых белков с использованием расширения генетического кода (GCE). В этой статье представлен полный пошаговый протокол маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием сайта GCE, за которым следуют указания по визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструирующей микроскопии (dSTORM)

Недавние результаты свидетельствуют о том, что включение неканонических аминокислот (ncAA) через GCE с последующей биоортогональной маркировкой тетразинсодержащими красителями является жизнеспособным методом селективного мечения и визуализации бактериальных секретируемых белков и последующего анализа изображений в организме хозяина. Цель этой статьи — предоставить простой и понятный протокол, который может быть использован исследователями, заинтересованными в проведении визуализации сверхвысокого разрешения с использованием GCE для изучения различных биологических процессов в бактериях и вирусах, а также взаимодействия хозяина и патогена.

Введение

Бактериальные инфекции долгое время считались серьезной опасностью для здоровья человека. Патогены используют высокоразвитые, чрезвычайно мощные и сложные защитные системы, а также различные факторы бактериальной вирулентности (называемые эффекторными белками) для уклонения от иммунных реакций хозяина и установления инфекций 1,2. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих систем, и роль отдельных эффекторных белков до сих пор в значительной степени неизвестны из-за отсутствия подходящих подходов для непосредственного отслеживания важнейших белковых компонентов и эффекторов в клетках-хозяевах во время патогенеза.

Одним из типичных примеров является Salmonella enterica serovar Typhimurium, который вызывает острый гастроэнтерит. Сальмонелла Typhimurium использует системы секреции третьего типа (T3SS) для инъекции различных эффекторных белков непосредственно в клетки-хозяева. Как только сальмонелла попадает в клетку-хозяина, она находится в кислом мембраносвязанном компартменте, называемом сальмонеллосодержащей вакуолью (SCV)3,4. Кислотный рН SCV активирует T3SS, кодируемый островком патогенности сальмонеллы 2 (SPI-2), и перемещает залп из 20 или более эффекторных белков через вакуолярную мембрану в цитозоль хозяина 5,6,7,8. Внутри хозяина эти сложные коктейли эффекторных белков координируют сигнальные пути клетки-хозяина, что приводит к образованию высокодинамичных, сложных трубчатых мембранных структур, простирающихся от SCV вдоль микротрубочек, называемых сальмонелла-индуцированными филаментами (SIF), которые позволяют сальмонеллам выживать и реплицироваться в клетках-хозяевах9,10,11.

Методы визуализации, отслеживания и мониторинга локализации бактериальных эффекторов, а также изучения их трафика и взаимодействия внутри клеток-хозяев дают критическое представление о механизмах, лежащих в основе бактериального патогенеза. Маркировка и локализация секретируемых сальмонеллой эффекторных белков T3SS внутри клеток-хозяев оказалась технологической проблемой12,13; Тем не менее, разработка генетически кодируемых флуоресцентных белков изменила нашу способность изучать и визуализировать белки в живых системах. Однако размер флуоресцентных белков (~25-30 кДа)15 часто сопоставим или даже больше, чем размер интересующего белка (POI; например, 13,65 кДа для SsaP, 37,4 кДа для SifA). Фактически, флуоресцентная белковая маркировка эффекторов часто блокирует секрецию меченого эффектора и заклинивает T3SS14.

Кроме того, флуоресцентные белки менее стабильны и испускают небольшое количество фотонов перед фотообесцвечиванием, что ограничивает их использование в микроскопических методах сверхвысокого разрешения16,17,18, особенно в фотоактивационной локализационной микроскопии (PALM), STORM и микроскопии с истощением стимулированного излучения (STED). В то время как фотофизические свойства органических флуоресцентных красителей превосходят свойства флуоресцентных белков, методы/методы, такие как CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 и HA-Tags24,25, требуют дополнительного белкового или пептидного придатка, который может нарушить структурно-функциональную функцию интересующего эффекторного белка, препятствуя посттрансляционной модификации или транспортировке. Альтернативный метод, который сводит к минимуму необходимую модификацию белка, включает включение ncAA в POI во время трансляции через GCE. ncAA либо флуоресцентны, либо могут быть сделаны флуоресцентными с помощью клик-химии 12,13,26,27,28.

Используя GCE, ncAA с крошечными функциональными биоортогональными группами (такими как азид, циклопропен или циклооктинная группа) могут быть введены практически в любое место в целевом белке. В этой стратегии нативный кодон заменяется редким кодоном, таким как янтарный (TAG) стоп-кодон в определенной позиции в гене POI. Модифицированный белок впоследствии экспрессируется в клетках вместе с ортогональной парой аминоацил-тРНК-синтетаза/тРНК. Активный сайт тРНК-синтетазы предназначен для получения только одного конкретного ncAA, который затем ковалентно присоединяется к 3'-концу тРНК, распознающему янтарный кодон. ncAA просто вводится в питательную среду, но он должен быть поглощен клеткой и достичь цитозоля, где аминоацил-тРНК-синтетаза (aaRS) может связать его с ортогональной тРНК; затем он включается в POI в указанном месте (см. рис. 1)12. Таким образом, GCE позволяет сайт-специфическое включение множества биоортогональных реакционноспособных групп, таких как кетон, азид, алкин, циклооктин, трансциклоктен, тетразин, норбонен, α, β-ненасыщенный амид и бицикло [6.1.0]-нонин в POI, потенциально преодолевая ограничения традиционных методов маркировки белков 12,26,27,28.

Последние тенденции в методах визуализации сверхвысокого разрешения открыли новые возможности для исследования биологических структур на молекулярном уровне. В частности, STORM, одномолекулярный метод сверхвысокого разрешения, основанный на локализации, стал бесценным инструментом для визуализации клеточных структур с длиной волны до ~ 20-30 нм и способен исследовать биологические процессы по одной молекуле за раз, тем самым открывая роли внутриклеточных молекул, которые еще неизвестны в традиционных исследованиях, усредненных по ансамблю13 . Для одномолекулярных методов и методов сверхвысокого разрешения требуется небольшая метка с яркими, фотостабильными органическими флуорофорами для наилучшего разрешения. Недавно мы продемонстрировали, что GCE можно использовать для включения подходящих зондов для получения изображений сверхвысокого разрешения12.

Двумя лучшими вариантами мечения белков в клетках являются бицикло [6.1.0] нонинлизин (BCN) и транс-циклооктен-лизин (TCO; показан на рисунке 1), которые могут быть генетически кодированы с использованием варианта пары тРНК/синтетаза (здесь называемой тРНК Pyl/PylRS AF), гдеPyl представляет собой пирролизин, а AF представляет собой рационально разработанный двойной мутант (Y306A, Y384F), полученный из Methanosarcina mazei, который естественным образом кодирует пирролизин12. 29,30,31. В ходе реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным электронным спросом (SPIEDAC) эти аминокислоты хемоселективно реагируют с конъюгатами тетразина (рис. 1)12,30,31. Такие реакции циклоприсоединения исключительно быстры и совместимы с живыми клетками; Они также могут быть флюорогенными, если соответствующий флуорофор функционализирован с тетразиновым фрагментом12,26,32. В данной работе представлен оптимизированный протокол мониторинга динамики бактериальных эффекторов, доставляемых в клетки-хозяева с помощью GCE, с последующей субклеточной локализацией секретируемых белков в клетках HeLa с использованием dSTORM. Результаты показывают, что включение ncAA через GCE с последующей реакцией щелчка с флуорогенными тетразинсодержащими красителями представляет собой универсальный метод селективной маркировки, визуализации секретируемых белков и последующей субклеточной локализации в организме хозяина. Однако все компоненты и процедуры, описанные здесь, могут быть скорректированы или заменены таким образом, чтобы система GCE могла быть адаптирована для исследования других биологических вопросов.

протокол

1. Плазмидная конструкция

  1. Клонируйте ген, экспрессирующий POI, в экспрессионную плазмиду (например, pET28a-sseJ 10TAG), которая экспрессирует POI в E. coli BL21 (DE3). Этот шаг облегчает определение того, что мутанты функциональны.
  2. Для визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой, в клетках-хозяевах сконструируют экспрессионную плазмиду (pWSK29-sseJ-HA), которая экспрессирует целевой POI SseJ под контролем своего нативного промотора, как описано в предыдущих отчетах 7,12,24. Используя сайт-направленный мутагенез, замените кодон фенилаланина-10 янтарным кодоном (TAG) в SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), обеспечив мотив AAT-TAG-ACT 33,34.
  3. В дополнение к вышеуказанным плазмидам для генетического включения транс-циклоокт-2-ен-L-лизина (TCO*A) в POI используют другую экспрессионную плазмиду (pEVOL-PylRS-AF)31 , которая содержит эволюционировавшую пару тРНК/синтетаза (тРНКPyl/PylRSAF ) гены, кодируемые в плазмиде pEVOL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание плазмиды и протоколов клонирования описано в предыдущем отчете30,31.
  4. Используйте коммерчески доступные наборы для подготовки плазмид для получения высококачественной плазмидной ДНК. Для очищенной ДНК оптимальное соотношение 260/280 составляет ~1,8. При необходимости проверьте чистоту ДНК с помощью 1% электрофореза в агарозном геле.

2. Подготовка бактериальной культуры

  1. Получение двойных трансформантов для проверки того, что мутант функционирует в E. coli
    1. Выньте компетентные клетки BL21 из -80 °C и разморозьте на льду примерно на 20–30 минут.
    2. Смешайте 1–5 мкл каждой плазмиды (~50 нг pEVOL-PylRS-AF и pET28a-sseJ 10TAG) с 200 мкл химически компетентных клеток BL21 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Аккуратно смешайте компетентные клетки и плазмидную смесь; Инкубировать 30 мин на льду.
    3. Термический шок микроцентрифужной пробирки на водяной бане 42 °C в течение 45 с. Снова положите трубки на лед на 2 минуты.
    4. Добавьте 1 мл теплой среды LB в микроцентрифужную пробирку и быстро перелейте смесь в коническую пробирку объемом 15 мл. Инкубируют клетки при 37 °C в шейкере при 250 об/мин в течение 1 ч. Наложите некоторую часть или все трансформированные клетки на пластины с агаром LB, содержащие соответствующие антибиотики. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина использовали для выбора pEVOL-PylRS-AF и pET28a-sseJ 10TAG соответственно. На этапе преобразования оцените успешную трансформацию с помощью отрицательных и положительных элементов управления.
  2. Перенесите мутант в сальмонеллу для визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой, в клетках-хозяевах:
    1. Добавьте по 2–3 мкл pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG к 40–60 мкл электрокомпетентного штамма Salmonella Typhimurium 14028s в охлажденной микроцентрифужной пробирке. Аккуратно перемешайте смесь пипеткой.
    2. Перелейте электропорационную смесь в охлажденную (зазор между электродами 0,2 см) кювету; установите настройки электропорации на 2,5 кВ, 200 Ω, 25 мкФ. Поместите кювету внутрь электропорационной камеры. Убедитесь, что электрод камеры плотно соприкасается с кюветой микропульсатора.
    3. Нажмите и удерживайте кнопку импульса , пока не раздастся звуковой сигнал.
    4. Сразу же добавьте в кювету 1 мл теплой среды LB. Перенесите все содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл. Инкубируют клетки при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин в течение 1 ч.
    5. Нанесите часть или всю электропорационную смесь сальмонеллы на агаровую пластину LB, содержащую соответствующие антибиотики. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина использовали для отбора pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG соответственно.
  3. Подготовка культуры
    1. Инокулируют одну колонию сальмонеллы или кишечной палочки в 5 мл среды LB, содержащей соответствующие антибиотики. Выращивают в течение ночи при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин.

3. Экспрессия и флуоресцентная маркировка ncAA-содержащих белков

  1. Экспрессия ncAA-несущих белков в E. coli
    1. Перенос 100 мкл первичной культуры в 5 мл среды LB (разведение 1:50), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,4–0,6.
    2. Приготовьте 1 мМ исходного раствора TCO*A (10 мл; Таблица 1).
    3. Когда культуры достигнут OD600 = 0,4–0,6, замените среду LB свежей LB, содержащей 1 мМ TCO*A, 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно приготовить исходный раствор TCO*A, как описано на этапе 5.4.2.
    4. Индуцируют экспрессию белка в присутствии 1 мМ IPTG, 0,2% арабинозы и взбалтывают в течение ночи при 34 ° C, 250 об/мин. Собирают бактериальные клетки центрифугированием в течение 5 мин при 11 000 × г. Удалите надосадочную жидкость и заморозьте гранулы при -20 °C до дальнейшего использования.
    5. Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, но экспрессируйте ncAA-несущие белки в отсутствие ncAA. Для флуоресцентной маркировки in vitro ncAA-содержащих белков в E. coli следуйте подробной процедуре, описанной на шаге 3.3.
  2. Экспрессия ncAA-содержащих белков в сальмонеллах
    1. Перенос 100 мкл первичной культуры в 5 мл среды LB (разведение 1:50), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6.
    2. Приготовьте модифицированную среду с минимальным содержанием азота (MgM, рН 5,6), как описано в таблице 1.
    3. Заменить среду LB модифицированной N-минимальной средой (MgM) с добавлением 1 мМ TCO*A (таблица 1). Выращивайте бактерии при 34 ° C в течение 30 минут. Затем добавьте 0,2% арабинозы, 25 мг/мл хлорамфеникола и 100 мг/мл ампициллина и выращивайте клетки еще 6 часов, встряхивая при 250 об/мин.
    4. Через 6 ч бактерии промывают 4 раза с интервалом 30 мин свежими средами MgM (pH 5,6) (таблица 1) без ncAA. На этапах стирки используйте 972 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
    5. Центрифугируют бактерии, ресуспендируют в 1x буфере PBS и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° C в темноте, чтобы удалить избыток ncAA. Через 1 ч бактерии центрифугируют при 3000 × г, 4 °C в течение 15 мин и хранят для дальнейшего использования.
    6. Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, экспрессируя ncAA-несущие белки в отсутствие ncAA.
  3. Флуоресцентное мечение in vitro ncAA-содержащих белков в Salmonella Typhimurium
    1. Ресуспендирование клеток сальмонеллы , экспрессирующих SseJ-F10TCO-HA в отсутствие или присутствии TCO*A (с шага 3.2) в 1x PBS. Отрегулируйте OD600 на 4 в PBS. Инкубируют клетки с 20 мкМ Janelia Fluor 646-тетразином (JF646-Tz) или 20 мкМ BDP-Fl-тетразином (5 мМ исходных растворов в ДМСО) при 37 ° C в темноте и встряхивают в течение 1–2 ч при 250 об/мин.
    2. Гранулируют клетки, промывают 3–4 раза PBS, содержащим 5% ДМСО и 0,2% Pluronic F-127, ресуспендируют в PBS, содержащем 5% ДМСО, и инкубируют в течение ночи при 4 ° C в темноте. Снова постирайте 2 раза с 1x PBS. На этапах стирки используйте 972 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
    3. Немедленно визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа или зафиксируйте их 1,5% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 30–45 минут при комнатной температуре в темноте.
    4. Промойте фиксированные ячейки 2 раза с помощью PBS и, наконец, в 50 мМ NH4Cl в PBS в течение 15 минут, чтобы удалить избыток PFA. Ресуспендируют клетки в PBS и хранят при температуре 4 °C не более 3–4 дней. Визуализируйте бактерии с помощью конфокальной микроскопии, как описано в разделе 6.

4. Биохимическая характеристика ncAA-содержащих белков

  1. Лизис клеток
    1. Ресуспендируют клетки из секции 3.1 в буфере лизиса (таблица 1) и инкубируют при комнатной температуре более 30 мин. Охладите смесь на льду в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение буфера лизиса к массе клетки должно составлять 1:10.
    2. Обработайте ресуспендированные клетки ультразвуком, пока они еще находятся на льду. Пульсируйте в течение 30 с при настройке 7 не менее 6x, с 1-минутными промежутками, используя ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов).
    3. Отжимайте клеточный лизат при 20 500 × г, 4 ° C в течение 15 мин (поддержание 4 ° C имеет решающее значение). Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулы.
  2. Анализ SDS-PAGE
    1. Приготовьте 5-кратный загрузочный краситель SDS (таблица 1). Добавьте 5 мкл буфера загрузки геля SDS к 13 мкл клеточного лизата. Денатурируют белки с помощью буфера для образца додецилсульфата натрия (SDS) в пробирке объемом 2 мл при 95 ° C в течение 10 мин, центрифугируют смесь при 2000 × г в течение 50 с и загружают в 12% полиакриламидный гель SDS.
    2. Соберите гелевую кассету, поместите ее в аппарат для гель-электрофореза и подключите аппарат для электрофореза к источнику питания. Залейте проточный буфер, загрузите маркеры молекулярной массы и образцы белка и запустите гель при 100 В, пока бромфенол не достигнет дна рассасывающего геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приступайте к анализу, так как лизаты, хранящиеся при -20 °C, имеют тенденцию терять качество после каждого цикла замораживания-оттаивания.
    3. Испачкайте гель синим протеиновым пятном Coomassie.

5. Биоортогональная маркировка секретируемого сальмонеллой эффектора SseJ-F10TCO-HA в клетках HeLa

  1. Культивируйте и поддерживайте клетки HeLa при 37 °C, 5% CO2 и влажности 95% в модифицированной среде орла Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (4,5 г / л) с добавлением 10% (об. / об.) FBS в дополнение к пенициллину-стрептомицину (1x).
  2. Культивируют бактерии за 1 день до заражения. Инокулируют одну колонию Salmonella 14028s, содержащую pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG, в 5 мл стандартного бульона LB, содержащего антибиотики, на ночь при 37 ° C, встряхивая при 250 об/мин.
  3. Посев клеток HeLa за 1 день до заражения. Возьмите колбу для культивирования тканей (T-75), содержащую клетки HeLa при ~ 80% слиянии, что определяется микроскопическим исследованием плотности клеток. Промойте клетки теплым PBS. Отделите клетки 3 мл теплого 0,25% трипсина / ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C, 5% CO2.
    1. Погасить трипсин с помощью 2 мл DMEM (+ 10% FBS). Перенесите все содержимое колбы в пробирку объемом 15 мл после ресуспендирования клеток. Раскручивайте клетки при дозе 1000 × г в течение 5 мин. Выньте надосадочную жидкость из трубки. Ресуспендируйте гранулы клеток HeLa в предварительно подогретой питательной среде.
    2. Используйте гемоцитометр для исследования суспензии и подсчета присутствующих клеток. Приготовьте разбавленный клеточный запас из расчета 1 × 105 клеток/мл. Затравка 0,5 × 105 клеток HeLa на лунку в 500 мкл ДМЕМ + 10% питательной среды FBS в восьмилуночном предметном стекле. Хранить предметное стекло в инкубаторе при температуре 37 °C, 5% CO2, влажности 95% в течение 24 часов.
  4. Бактериальная инфекция
    1. Субкультуру Salmonella 14028s, содержащую pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG, путем разбавления 100 мкл ночной бактериальной культуры (со стадии 5.2) в 3 мл среды LB (разведение 1:30), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин в течение 5–7 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой фазы культуры достигают поздней экспоненциальной фазы, и бактерии очень инвазивны.
    2. Приготовьте исходный раствор TCO*A емкостью 100 мМ и готовую среду (таблица 1).
    3. Чтобы инициировать инфекцию клеток HeLa, выньте клетки HeLa из инкубатора и промойте клетки предварительно подогретым DPBS перед добавлением 500 мкл свежего DMEM (+10% FBS) в каждую лунку. Поместите горку камеры обратно в инкубатор CO2 до тех пор, пока не начнется инфекция.
    4. После 5–7 ч инкубации разбавьте культуру сальмонеллы до OD600 = 0,2 в 1 мл питательной среды DMEM (~ 3 × 108 КОЕ / мл). Добавьте необходимое количество инокулята сальмонеллы в каждую лунку горного стекла камеры, чтобы кратность инфекции (MOI) равнялась 100.
    5. Инкубируйте инфицированные клетки в инкубаторе CO2 в течение 30 минут. Промойте клетки 3 раза предварительно подогретым DPBS, чтобы удалить внеклеточную сальмонеллу. Установите этот момент времени на 0 ч после заражения. Добавьте 500 мкл полной среды (таблица 1), содержащей 100 мкг/мл гентамицина в течение 1 ч. Через 1 ч промойте клетки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 500 мкл готовой среды (начиная с этапа 5.4.2; Таблица 1) дополняется 0,2% арабинозой, 10 мкг/мл гентамицина в каждую лунку предметного стекла камеры.
    6. В контрольном эксперименте выполняли аналогичные инфекции клеток HeLa без TCO*A.
    7. Инкубируйте предметное стекло камеры в течение 10 ч в инкубаторе CO2 .
  5. Щелкните химическую маркировку в живых клетках
    1. Приступайте к маркировке зараженных бактериями клеток. Предварительно разогрейте всю среду без TCO*A (таблица 1).
    2. Через 10 ч после заражения замените полную среду свежей полной средой без TCO*A и промойте клетки HeLa 4 раза с интервалом 30 мин каждая предварительно подогретым DPBS, а затем свежей полной средой (без TCO*A).
    3. Приготовьте 0,5 мМ раствор красителя и тетразина в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой в клетках-хозяевах, представлены два протокола. Для протокола 1 приготовьте смесь красителей, разбавив сырье JF646-Tz в 1x PBS, содержащем 1% натриевой соли казеина из бычьего молока, чтобы конечный рабочий раствор составлял 2 мкМ. Для протокола 2 приготовьте теплую полную среду (без FBS и TCO*A) и добавьте 2 мкМ JF646-Tz. Освежайте эту смесь красителей для каждого сеанса маркировки. Работайте в темноте, если это возможно (приглушите свет в вытяжке и/или комнате).
    4. Через 12 ч после заражения аспирировать среду из клеток. Вымойте клетку предварительно разогретым DPBS 2x или 3x. В одну группу лунок добавляют 500 мкл смеси раствора красителя, описанной в протоколе 1, а в другую группу лунок того же предметного стекла камеры добавляют 500 мкл смеси раствора красителя, описанной в протоколе 2, упомянутой в шаге 5.5.3 и примечании после него. Поместите камеру обратно в инкубатор CO 2 на 1,5–2 часа.
    5. Через 13,5–14 ч после заражения промойте клетки HeLa 2 раза предварительно подогретым DPBS. Добавьте 500 мкл свежего DMEM (с добавлением FBS). Поместите горку камеры обратно в инкубатор на 30 минут. Промойте клетки предварительно подогретым DPBS, а затем свежим DMEM 4x с интервалом в 30 минут.
    6. Через 16 часов после заражения зафиксируйте клетки HeLa с помощью PFA, добавив 200 мкл 4% PFA в каждую лунку и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Аспирируйте PFA, промойте 3 раза PBS и храните ячейки в PBS при температуре 4 ° C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является высокотоксичным химическим веществом. Избегайте вдыхания, а также контакта с кожей и глазами. При обращении надевайте защитное снаряжение. Чтобы меченый образец не подвергался воздействию света, выключите свет в вытяжке клеточной культуры.
  6. Иммуноокрашивание белков, меченных ГК
    1. Отспирируйте PBS и промойте один раз в блокирующем растворе (таблица 1).
    2. Инкубируют фиксированные клетки HeLa с раствором первичных антител на основе PBS (таблица 1) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Используйте первичное антитело кролика против HA для окрашивания секретируемого SseJ (разведение 1:500).
    3. Через 1 ч аккуратно промойте клетки 2 раза 0,5 мл 0,1% Tween-20/1x PBS. Во время промывания раствором Tween/PBS инкубируйте клетки 3x с 0,5 мл 0,1% Tween20/1x PBS в течение 5 мин.
    4. Вторичное антитело развести ослику антикролик 555 1:500 в растворе вторичных антител и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    5. Через 1 ч аккуратно промойте клетки 2 раза 0,5 мл 0,1% Tween-20/1x PBS и инкубируйте 2x с 0,5 мл 0,1% Tween20/1x PBS в течение 5 мин.
    6. Промойте клетки 3 раза 0,5 мл 1x PBS и храните их при температуре 4 ° C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ячейки можно хранить в течение нескольких недель в PBS при температуре 4 °C. Иммуноокрашивание должно быть выполнено в последнюю минуту.

6. Конфокальная визуализация

  1. Используйте конфокальный микроскоп, такой как вращающийся диск (SD) или микроскоп STED.
    1. Отрегулируйте параметры получения изображений, такие как режим сканирования (XYZ), скорость сканирования (400 Гц), разрешение (512 x 512), увеличение (100x) и Z-стекирование.
    2. Используйте правильные фильтры возбуждения/излучения для тетразина DAPI, BDP-Tz и JF646.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола конфокальная визуализация была выполнена на системе микроскопа STED, оснащенной импульсным лазером белого света, позволяющим выбирать возбуждение в диапазоне 470–670 нм и УФ-диодным лазером 405 нм для возбуждения на длине волны 405 нм, 488 нм и 647 нм. Соответствующие диапазоны излучения были установлены с помощью встроенного акустооптического светоделителя в сочетании с перестраиваемым многополосным спектральным детектированием конфокальной системы на основе призмы.
    3. Получайте изображения с помощью объектива с масляным погружением 100×/1.4.

7. Визуализация сверхвысокого разрешения (dSTORM)

  1. Включите микроскоп за 3 часа до получения изображения, чтобы обеспечить тепловое равновесие (дрейф более вероятен, если визуализация начинается до этого). Охладите камеру до -70 °C.
  2. Тем временем подготовьте свежий буфер визуализации GLOX-BME (таблица 1).
  3. Поднесите клетки к микроскопу. Поместите камеру визуализации на столик микроскопа в держателе образца. В держателе убедитесь, что образец плоский и надежный. Замените среду в лунке на 0,4 мл свежеизготовленного буфера визуализации GLOX-BME.
  4. Установите правильную лазерную линию и наборы фильтров. Уменьшите мощность лазера до ~ 1 мВт, чтобы идентифицировать интересующую ячейку HeLa. Отрегулируйте фокальную плоскость и угол лазерного луча при освещении образца с низкой плотностью лазера 647 нм (в этом случае предлагается круто наклоненный угол [HILO], поскольку HILO повышает сигнал к фону [SBR]). Отрегулируйте угол освещения HILO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе изображение SseJ со сверхвысоким разрешением было получено в канале Alexa Fluor 647 с использованием инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного объективом TIRF (100-кратный масляный иммерсионный объектив Apo TIRF, NA 1.49). Флуоресценция была обнаружена с помощью камеры EMCCD, которая управлялась через μManager.
  5. Установите коэффициент усиления предусилителя на 3 и активируйте передачу кадров в μManager. Установите коэффициент усиления ЭМ на 200 для более высокой чувствительности при измерениях dSTORM, как описано в предыдущем отчете35.
  6. Перед визуализацией dSTORM сделайте контрольное изображение целевой структуры с ограниченной дифракцией. Переключите флуорофоры в темное состояние, включив лазер на максимальную мощность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные, быстро мигающие молекулы флуорофоров JF646 наблюдались, когда флуорофоры JF646 были преобразованы в преимущественно темное состояние при непрерывном освещении возбуждающим светом 647 нм, как описано ранее36.
  7. Отрегулируйте мощность лазера до подходящего уровня, при котором мигающие события разделены в пространстве и времени, установите время экспозиции на 30 мс и начните съемку. Приобретите 10 000–30 000 кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения мощности лазера должны быть сделаны для оптимизации мигания. Рассмотрите возможность увеличения интенсивности лазера, если обнаружено слишком много событий (мигающих частиц, которые перекрываются). Идеальная длина зависит от качества образца, но ~ 10 000 кадров должны показывать заметные особенности.

8. Реконструкция изображения dSTORM

  1. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ThunderSTORM, одна из многих доступных программ реконструкции изображений с открытым исходным кодом, кратко описана ниже.
  2. Откройте ImageJ и импортируйте необработанные данные. Откройте плагин ThunderSTORM и настройте параметры камеры, соответствующие устройству.
  3. Перейдите в раздел «Выполнить анализ » и установите соответствующие настройки, такие как фильтрация изображений (разница фильтров усреднения), методы локализации (локальный максимум) и субпиксельная локализация молекул (интегрированный гауссов PSF). Нажмите кнопку ОК , чтобы начать реконструкцию образа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости уже была описана подробная инструкция по настройке параметров в ThunderSTORM37.

Результаты

В этом протокольном документе описывается основанный на GCE метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки и визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой , как показано на рисунке 1. Химическая структура несущей ncAA трансциклооктеново?...

Обсуждение

Подход, описанный в настоящем описании, был использован для отслеживания точного местоположения эффекторных белков, введенных в клетку-хозяина бактериальным T3SS после инфицирования. T3SS используются внутриклеточными патогенами, такими как сальмонелла, шигелла и иерсиния

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана стартовыми фондами медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне, штат Техас, и наградой Texas STAR для L.J.K. Мы благодарим профессора Эдварда Лемке (Европейская лаборатория молекулярной биологии, Гейдельберг, Германия) за плазмиду pEVOL-PylRS-AF. Изображения на рисунке 1 были созданы с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris/Glycine SDS running bufferBIO-RAD1610732
Ammonium chlorideFischer ScientificA661-500
Ammonium sulphateFischer ScientificBP212R-1
Ampicillin SodiumSigma-AldrichA01665 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermiFischer Scientific15240096
ArabinoseSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-tetrazineLumiprobe (USA)2.14E+02
β-mercaptoethanolMillipore444203250 mL
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
CaseinSigma-AldrichC8654
CatalaseSigma-AldrichC9322
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ SpectrophotometerDeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibodyInvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
EMCCD CameraAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)Eppendorf, Hamburg, Germany30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)Fischer10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm)Fischer Scientific97203Pack of 100
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBIO-RAD1652660
GentamycinSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
Glucose oxidaseSigma-AldrichG7141-50KU
GlycerolFischer ScientificBF229-4
HeLa cellsATTCCCL-2
HEPES BufferCorning25-060-C1100 mL
Hydrocloric acidFischer ScientificA144-212
ImageJImage processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LCoomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazineTocris Bioscience7279
KanamycinSigma-Aldrich606155 g
LB BrothBD Difco244620500 g
LysozymeSigma-AldrichL6876
μManager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20860.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture FlasksThermiFischer Scientific156499
Omnipur Casamino AcidCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Electron Microscopy Sciences 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFFor plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep KitQiagen27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasicFischer ScientificP285-500
Potassium sulphateAcros Organic424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibodySigma-AldrichH6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028sRef.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sodium hydroxideFischer ScientificSS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Sonic Dismembrator Model 100Fischer Scientific24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)Leica Microsystems, Wetzlar, Germanyhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%  GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well tissue culture chamber slidesSARSTEDT94.6190.802

Ссылки

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

192SseJdSTORM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены