Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Zusammenfassung

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)

Zusammenfassung

Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SSs) ermöglichen es gramnegativen Bakterien, eine Batterie von Effektorproteinen direkt in das Zytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren. Beim Eintritt modulieren die injizierten Effektorproteine kooperativ eukaryotische Signalwege und programmieren zelluläre Funktionen um, was das Eindringen und Überleben von Bakterien ermöglicht. Die Beobachtung und Lokalisierung dieser sezernierten Effektorproteine im Kontext von Infektionen liefert einen Fußabdruck für die Definition der dynamischen Schnittstelle von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Markierung und Bildgebung bakterieller Proteine in Wirtszellen ohne Störung ihrer Struktur/Funktion ist jedoch technisch anspruchsvoll.

Die Konstruktion fluoreszierender Fusionsproteine löst dieses Problem nicht, da die Fusionsproteine den sekretorischen Apparat blockieren und somit nicht sezerniert werden. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir kürzlich eine Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung von bakteriell sezernierten Effektoren sowie anderen schwer zu markierenden Proteinen unter Verwendung der genetischen Code-Expansion (GCE) eingesetzt. Diese Arbeit bietet ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mit GCE-Ortsspezifischkeit, gefolgt von Anweisungen zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)

Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) über GCE, gefolgt von bioorthogonaler Markierung mit tetrazinhaltigen Farbstoffen, eine praktikable Technik zur selektiven Markierung und Visualisierung von bakteriell sezernierten Proteinen und anschließender Bildanalyse im Wirt ist. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein einfaches und klares Protokoll bereitzustellen, das von Forschern verwendet werden kann, die daran interessiert sind, hochauflösende Bildgebung mit GCE durchzuführen, um verschiedene biologische Prozesse in Bakterien und Viren sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Einleitung

Bakterielle Infektionen gelten seit langem als ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit. Krankheitserreger nutzen hochentwickelte, extrem leistungsfähige und komplizierte Abwehrsysteme sowie eine Vielzahl von bakteriellen Virulenzfaktoren (sogenannte Effektorproteine), um der Immunantwort des Wirts zu entgehen und Infektionen zu verursachen ^1,2. Die molekularen Mechanismen, die diesen Systemen zugrunde liegen, und die Rolle einzelner Effektorproteine sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da es an geeigneten Ansätzen mangelt, um die entscheidenden Proteinkomponenten und Effektoren in Wirtszellen während der Pathogenese direkt zu verfolgen.

Ein typisches Beispiel ist Salmonella enterica serovar Typhimurium, das eine akute Gastroenteritis verursacht. Salmonelle Typhimurium nutzt Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SS), um eine Vielzahl von Effektorproteinen direkt in Wirtszellen zu injizieren. Sobald Salmonellen in die Wirtszelle eindringen, befinden sie sich in einem sauren, membrangebundenen Kompartiment, das als Salmonellen-haltige Vakuole (SCV) bezeichnet ^wird3,4. Der saure pH-Wert des SCV aktiviert das Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodierte T3SS und transloziert eine Salve von 20 oder mehr Effektorproteinen über die vakuoläre Membran in das Wirtszytosol 5,6,7,8. Im Inneren des Wirts manipulieren diese komplexen Cocktails von Effektorproteinen koordiniert die Signalwege der Wirtszelle, was zur Bildung hochdynamischer, komplexer röhrenförmiger Membranstrukturen führt, die sich vom SCV entlang von Mikrotubuli erstrecken, die als Salmonellen-induzierte Filamente (SIFs) bezeichnet werden und es Salmonellen ermöglichen, in den Wirtszellen zu überleben und sich zu vermehren 9,10,11.

Methoden zur Visualisierung, Verfolgung und Überwachung bakterieller Effektorlokalisationen sowie zur Untersuchung ihres Transports und ihrer Interaktionen innerhalb von Wirtszellen bieten wichtige Einblicke in die Mechanismen, die der bakteriellen Pathogenese zugrunde liegen. Die Markierung und Lokalisierung von Salmonella-sezernierten T3SS-Effektorproteinen in Wirtszellen hat sich als technologische Herausforderung erwiesen ^12,13; Nichtsdestotrotz hat die Entwicklung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine unsere Fähigkeit verändert, Proteine in lebenden Systemen zu untersuchen und sichtbar zu machen. Die Größe fluoreszierender Proteine (~25-30 kDa)15 ist jedoch oft vergleichbar mit der des interessierenden Proteins (POI; z. B. ^13,65 kDa für SsaP, 37,4 kDa für SifA). Tatsächlich blockiert die fluoreszierende Proteinmarkierung von Effektoren oft die Sekretion des markierten Effektors und blockiert das T3SS¹⁴.

Darüber hinaus sind fluoreszierende Proteine weniger stabil und emittieren vor dem Photobleichen eine geringe Anzahl von Photonen, was ihre Verwendung in hochauflösenden mikroskopischen Techniken einschränkt^16,17,18, insbesondere in der Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (PALM), STORM und STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Während die photophysikalischen Eigenschaften organischer Fluoreszenzfarbstoffe denen von fluoreszierenden Proteinen überlegen sind, erfordern Methoden/Techniken wie CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 und HA-Tags^24,25 ein zusätzliches Protein- oder Peptidanhang^, das die Strukturfunktion des interessierenden Effektorproteins beeinträchtigen kann, indem es die posttranslationale Modifikation oder den Transport stört. Eine alternative Methode, die die notwendige Proteinmodifikation minimiert, ist der Einbau von ncAAs in einen POI während der Translation durch GCE. Die ncAAs sind entweder fluoreszierend oder können mittels Click-Chemie fluoreszierend gemacht werden 12,13,26,27,28.

Mit Hilfe von GCE können ncAAs mit winzigen, funktionellen, bioorthogonalen Gruppen (wie z. B. einer Azid-, Cyclopropen- oder Cyclooctingruppe) an nahezu jeder Stelle in einem Zielprotein eingeführt werden. Bei dieser Strategie wird ein natives Codon mit einem seltenen Codon, wie z.B. einem bernsteinfarbenen (TAG) Stoppcodon an einer bestimmten Position im Gen des POI ausgetauscht. Das modifizierte Protein wird anschließend zusammen mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase/tRNA-Paar in Zellen exprimiert. Das aktive Zentrum der tRNA-Synthetase ist so konzipiert, dass es nur ein bestimmtes ncAA erhält, das dann kovalent an das 3'-Ende der tRNA gebunden wird, das das Bernsteincodon erkennt. Das ncAA wird einfach in das Wachstumsmedium eingebracht, muss aber von der Zelle aufgenommen werden und das Zytosol erreichen, wo die Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) es mit der orthogonalen tRNA verknüpfen kann. es wird dann an der angegebenen Stelle in den POI eingebunden (siehe Abbildung 1)¹². Somit ermöglicht GCE den ortsspezifischen Einbau einer Vielzahl von bioorthogonalen reaktiven Gruppen wie Keton, Azid, Alkin, Cyclooctin, Transcycloocten, Tetrazin, Norboneen, α, β-ungesättigtes Amid und Bicyclo [6.1.0]-Nonin in einen POI, wodurch möglicherweise die Einschränkungen herkömmlicher Proteinmarkierungsmethoden überwunden^werden 12,26,27,28.

Die jüngsten Trends bei hochauflösenden Bildgebungsverfahren haben neue Wege zur Untersuchung biologischer Strukturen auf molekularer Ebene eröffnet. Insbesondere STORM, eine auf Lokalisierung basierende, superauflösende Einzelmolekültechnik, hat sich zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Visualisierung zellulärer Strukturen bis hinunter zu ~20-30 nm entwickelt und ist in der Lage, biologische Prozesse Molekül für Molekül zu untersuchen und dadurch die Rolle intrazellulärer Moleküle zu entdecken, die in traditionellen ensemblegemittelten Studien noch unbekannt sind¹³ . Einzelmolekül- und Super-Resolution-Techniken erfordern eine kleine Markierung mit hellen, photostabilen organischen Fluorophoren, um die beste Auflösung zu erzielen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass GCE für die Integration geeigneter Sonden für die hochauflösende Bildgebung verwendet werden kann¹².

Zwei der besten Optionen für die Proteinmarkierung in Zellen sind Bicyclo [6.1.0]nonynelysin (BCN) und trans-Cycloocten-Lysin (TCO; siehe Abbildung 1), die genetisch mit einer Variante des tRNA/Synthetase-Paares (hier als tRNA^Pyl/PylRS AF bezeichnet) kodiert werden können, wobei Pyl für Pyrrolysin steht und^AF für eine rational gestaltete Doppelmutante (Y306A, Y384F) steht, die von Methanosarcina mazei abgeleitet ist und auf natürliche Weise für Pyrrolysin¹² kodiert^. 29,30,31. Durch die dehnungsgeförderte inverse Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion (SPIEDAC) reagieren diese Aminosäuren chemoselektiv mit Tetrazin-Konjugaten (Abbildung 1)12,30,31. Solche Cycloadditionsreaktionen sind außergewöhnlich schnell und mit lebenden Zellen kompatibel; Sie können auch fluorogen sein, wenn ein geeigneter Fluorophor mit der Tetrazin-Einheit^12,26,32 funktionalisiert wird. In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der Dynamik von bakteriellen Effektoren vorgestellt, die mittels GCE in Wirtszellen eingebracht werden, gefolgt von der subzellulären Lokalisierung von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen unter Verwendung von dSTORM. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau eines ncAA über GCE, gefolgt von einer Click-Reaktion mit fluorogenen Tetrazin-haltigen Farbstoffen, eine vielseitige Methode zur selektiven Markierung, Visualisierung sezernierter Proteine und anschließender subzellulärer Lokalisation im Wirt darstellt. Alle hier beschriebenen Komponenten und Verfahren können jedoch angepasst oder ersetzt werden, so dass das GCE-System für die Untersuchung anderer biologischer Fragestellungen angepasst werden kann.

Protokoll

1. Plasmid-Konstruktion

1. Klonen Sie das Gen, das das POI exprimiert, in ein Expressionsplasmid (z. B. pET28a-sseJ 10TAG), das das POI in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Dieser Schritt erleichtert die Feststellung, ob die Mutanten funktionsfähig sind.
2. Für die Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren in Wirtszellen wird ein Expressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) konstruiert, das das Ziel-POI-SseJ unter der Kontrolle seines nativen Promotors exprimiert, wie in früheren Berichten beschrieben ^7,12,24. Mittels gezielter Mutagenese wird das Codon von Phenylalanin-10 durch ein bernsteinfarbenes Codon (TAG) in SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA) ersetzt, wodurch das AAT-TAG-ACT-Motiv^{sichergestellt wird 33,34}.
3. Zusätzlich zu den oben genannten Plasmiden wird für den genetischen Einbau von trans-Cyclooct-2-en-L-Lysin (TCO*A) in einen POI ein weiteres Expressionsplasmid (pEVOL-PylRS-AF)³¹ verwendet, das die im Plasmid pEVOL kodierten Gene des entwickelten tRNA/Synthetase-Paares (tRNA^{Pyl/PylRS AF} ) enthält.
   ANMERKUNG: Detaillierte Beschreibungen des Plasmids und der Klonierungsprotokolle sind im vorherigen Bericht^30,31 beschrieben.
4. Verwenden Sie handelsübliche Plasmidpräparationskits, um hochwertige Plasmid-DNA zu erhalten. Für gereinigte DNA beträgt das optimale 260/280-Verhältnis ~1,8. Überprüfen Sie die DNA-Reinheit ggf. mit einer 1%igen Agarose-Gelelektrophorese.

2. Vorbereitung der Bakterienkultur

1. Gewinnung von Doppeltransformanten, um zu testen, ob die Mutante in E. coli funktionsfähig ist
   1. Entnehmen Sie BL21-kompetente Zellen aus -80 °C und tauen Sie sie etwa 20–30 Minuten lang auf Eis auf.
   2. Mischen Sie 1–5 μl jedes Plasmids (~50 ng pEVOL-PylRS-AF und pET28a-sseJ 10TAG) mit 200 μl chemisch kompetenten BL21-Zellen in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die kompetente Zell- und Plasmidmischung vorsichtig; 30 Minuten auf Eis inkubieren.
   3. Hitzeschock des Mikrozentrifugenröhrchens in einem 42 °C warmen Wasserbad für 45 s. Legen Sie die Röhrchen wieder für 2 Minuten auf Eis.
   4. Geben Sie 1 ml warmes LB-Medium in das Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie die Mischung schnell in ein konisches 15-ml-Röhrchen um. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Schüttler bei 250 U/min für 1 h. Legen Sie einen Teil oder alle transformierten Zellen auf LB-Agarplatten, die geeignete Antibiotika enthalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 35 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Kanamycin für die Auswahl von pEVOL-PylRS-AF bzw. pET28a-sseJ 10TAG verwendet. Bewerten Sie im Transformationsschritt die erfolgreiche Transformation anhand von Negativ- und Positivkontrollen.
2. Transfer der Mutante auf Salmonella zur Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren in Wirtszellen:
   1. Jeweils 2–3 μl pEVOL-PylRS-AF und pWSK29-sseJ 10TAG zu 40–60 μl elektrokompetentem Salmonella Typhimurium-Stamm 14028s in ein gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen geben. Mischen Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette.
   2. Das Elektroporationsgemisch wird in eine gekühlte Küvette (0,2 cm Elektrodenabstand) überführt. Stellen Sie die Elektroporationseinstellungen auf 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF ein. Platzieren Sie die Küvette in der Elektroporationskammer. Achten Sie darauf, dass die Kammerelektrode festen Kontakt mit der Mikropulserküvette hat.
   3. Halten Sie die Impulstaste gedrückt, bis ein Piepton ertönt.
   4. Sofort 1 ml warmes LB-Medium in die Küvette geben. Übertragen Sie den gesamten Inhalt in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min für 1 h.
   5. Legen Sie einen Teil oder die gesamte Elektroporationsmischung von Salmonellen auf eine LB-Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 35 μg/ml Chloramphenicol und 100 μg/ml Ampicillin für die Auswahl von pEVOL-PylRS-AF bzw. pWSK29-sseJ 10TAG verwendet.
3. Vorbereitung der Kultur
   1. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie von Salmonellen oder E. coli in 5 ml LB-Medium, das geeignete Antibiotika enthält. Über Nacht bei 37 °C anbauen und bei 250 U/min schütteln.

3. Expression und Fluoreszenzmarkierung von ncAA-tragenden Proteinen

1. Expression von ncAA-tragenden Proteinen in E. coli
   1. Überführen Sie 100 μl der Primärkultur in 5 ml LB-Medium (1:50 Verdünnung) mit 35 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Kanamycin, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min, bis OD₆₀₀ 0,4–0,6 erreicht.
   2. Bereiten Sie 1 mM TCO*A-Stammlösung (10 ml; Tabelle 1).
   3. Wenn die Kulturen OD₆₀₀ = 0,4–0,6 erreichen, ersetzen Sie das LB-Medium durch frisches LB mit 1 mM TCO*A, 35 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Kanamycin.
      HINWEIS: Alternativ kann die TCO*A-Stammlösung wie in Schritt 5.4.2 beschrieben hergestellt werden.
   4. Induzieren Sie die Proteinexpression in Gegenwart von 1 mM IPTG, 0,2 % Arabinose und schütteln Sie es über Nacht bei 34 °C, 250 U/min. Ernte der Bakterienzellen durch Zentrifugation für 5 min bei 11.000 × g. Entfernen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C ein.
   5. Für ein Kontrollexperiment wiederholen Sie das gleiche Experiment, aber exprimieren Sie die ncAA-tragenden Proteine in Abwesenheit des ncAA. Für die In-vitro-Fluoreszenzmarkierung von ncAA-tragenden Proteinen in E. coli ist das in Schritt 3.3 beschriebene Verfahren zu befolgen.
2. Expression von ncAA-tragenden Proteinen in Salmonellen
   1. 100 μl Primärkultur werden in 5 ml LB-Medium (1:50 Verdünnung) mit 35 μg/ml Chloramphenicol und 100 μg/ml Ampicillin überführt, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min, bis OD₆₀₀ 0,6 erreicht.
   2. Modifiziertes N-Minimalmedium (MgM, pH 5,6) wie in Tabelle 1 beschrieben herstellen.
   3. Das LB-Medium wird durch ein modifiziertes N-Minimalmedium (MgM) ersetzt, das mit 1 mM TCO*A ergänzt wird (Tabelle 1). Züchten Sie die Bakterien 30 Minuten lang bei 34 °C. Fügen Sie dann 0,2 % Arabinose, 25 mg/ml Chloramphenicol und 100 mg/ml Ampicillin hinzu und lassen Sie die Zellen weitere 6 Stunden lang bei 250 U/min züchten.
   4. Waschen Sie die Bakterien nach 6 h 4x im Abstand von 30 min mit frischem MgM-Medium (pH 5,6) (Tabelle 1) ohne ncAA. In den Waschschritten 972 × g für 15 min bei Raumtemperatur verwenden.
   5. Zentrifugieren Sie die Bakterien, resuspendieren Sie sie in 1x PBS-Puffer und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 4 °C im Dunkeln, um überschüssige ncAAs zu entfernen. Nach 1 h zentrifugieren Sie die Bakterien bei 3.000 × g, 4 °C für 15 min und lagern Sie sie für die weitere Verwendung.
   6. Für ein Kontrollexperiment wiederholen Sie das gleiche Experiment, indem Sie ncAA-tragende Proteine in Abwesenheit von ncAA exprimieren.
3. In vitro Fluoreszenzmarkierung von ncAA-tragenden Proteinen in Salmonella Typhimurium
   1. Resuspendieren von Salmonellenzellen , die SseJ-F10TCO-HA exprimieren, in Abwesenheit oder Vorhandensein von TCO*A (ab Schritt 3.2) in 1x PBS. Stellen Sie den Außendurchmesser₆₀₀ auf 4 in PBS ein. Die Zellen werden mit 20 μM Janelia Fluor 646-Tetrazin (JF646-Tz) oder 20 μM BDP-Fl-Tetrazin (5 mM Stammlösungen in DMSO) bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und 1–2 h bei 250 U/min geschüttelt.
   2. Die Zellen pelletieren, 3–4x mit PBS mit 5 % DMSO und 0,2 % Pluronic F-127 waschen, in PBS mit 5 % DMSO resuspendieren und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. 2x nochmals mit 1x PBS waschen. Verwenden Sie in den Waschschritten 972 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Nehmen Sie die Zellen sofort mit einem konfokalen Mikroskop auf oder fixieren Sie sie mit 1,5 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30–45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   4. Waschen Sie die fixierten Zellen 2x mit PBS und schließlich in 50 mM NH₄Cl in PBS für 15 min, um überschüssiges PFA zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS und lagern Sie sie nicht länger als 3–4 Tage bei 4 °C. Bilde die Bakterien mit konfokaler Mikroskopie ab, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

4. Biochemische Charakterisierung von ncAA-tragenden Proteinen

1. Zelllyse
   1. Die Zellen aus Abschnitt 3.1 werden in Lysepuffer (Tabelle 1) resuspendiert und bei Raumtemperatur für mehr als 30 min inkubiert. Die Mischung 15 Minuten auf Eis kalt stellen.
      Anmerkungen: Halten Sie das Verhältnis von Lysepuffer zu Zellgewicht bei 1:10.
   2. Beschallen Sie die resuspendierten Zellen, während Sie sich noch auf Eis befinden. Pulsieren Sie 30 s lang bei Einstellung 7 mindestens 6x, mit Pausen von 1 min, mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialtabelle).
   3. Schleudern Sie das Zelllysat bei 20.500 × g, 4 °C für 15 Minuten herunter (die Aufrechterhaltung von 4 °C ist entscheidend). Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
2. SDS-PAGE-Analyse
   1. Bereiten Sie 5x SDS-Ladefarbstoff vor (Tabelle 1). Fügen Sie 5 μl SDS-Gelladepuffer zu 13 μl Zelllysat hinzu. Die Proteine werden mit Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer in einem 2-ml-Röhrchen bei 95 °C für 10 Minuten denaturiert, die Mischung 50 s lang bei 2.000 × g zentrifugiert und auf ein 12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel geladen.
   2. Bauen Sie die Gelkassette zusammen, legen Sie sie in ein Gelelektrophoresegerät und schließen Sie das Elektrophoresegerät an eine Stromversorgung an. Gießen Sie den Laufpuffer ein, laden Sie die Molekulargewichtsmarker und Proteinproben und lassen Sie das Gel bei 100 V laufen, bis das Bromphenol den Boden des auflösenden Gels erreicht.
      Anmerkungen: Beginnen Sie sofort mit der Analyse, da Lysate, die bei -20 °C gelagert werden, nach jedem Gefrier-Auftau-Zyklus an Qualität verlieren.
   3. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue Protein Stain.

5. Bio-orthogonale Markierung des Salmonella-sezernierten Effektors SseJ-F10TCO-HA in HeLa-Zellen

1. Kultivieren und pflegen Sie HeLa-Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/l), ergänzt mit 10 % (v/v) FBS zusätzlich zu Penicillin-Streptomycin (1x).
2. Kultivieren Sie Bakterien 1 Tag vor der Infektion. Eine einzelne Kolonie von Salmonella 14028 mit pEVOL-PylRS-AF und pWSK29-sseJ 10TAG wird über Nacht bei 37 °C in 5 ml antibiotikahaltiger Standard-LB-Brühe geimpft und mit 250 U/min geschüttelt.
3. Säen Sie HeLa-Zellen 1 Tag vor der Infektion. Nehmen Sie einen Gewebekulturkolben (T-75) mit HeLa-Zellen bei ~80% Konfluenz, wie durch mikroskopische Untersuchung der Zelldichte bestimmt. Waschen Sie die Zellen mit warmem PBS. Die Zellen werden mit 3 ml warmem 0,25%igem Trypsin/EDTA für 5 min bei 37 °C, 5% CO₂ abgelöst.
   1. Quenzieren Sie das Trypsin mit 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Kolbens in ein 15-ml-Röhrchen, nachdem die Zellen resuspendiert wurden. Schleudern Sie die Zellen bei 1.000 × g für 5 Minuten herunter. Nehmen Sie den Überstand aus der Röhre. Resuspendieren Sie das HeLa-Zellpellet in vorgewärmtem Nährmedium.
   2. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Suspension zu untersuchen und die vorhandenen Zellen zu zählen. Bereiten Sie einen verdünnten Zellbestand bei 1 × 10^{5 Zellen/} ml vor. Seed 0,5 × 10⁵ HeLa-Zellen pro Well in 500 μL DMEM + 10% FBS-Nährmedium in einem Acht-Well-Kammerobjektträger. Bewahren Sie den Kammerschlitten 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO_{2 und} 95 % Luftfeuchtigkeit auf.
4. Bakterielle Infektion
   1. Subkultur Salmonella 14028 mit pEVOL-PylRS-AF und pWSK29-sseJ 10TAG durch Verdünnung von 100 μl Bakterienkultur über Nacht (ab Schritt 5.2) in 3 ml LB-Medium (1:30 Verdünnung) mit 35 μg/ml Chloramphenicol und 100 μg/ml Ampicillin, gefolgt von Inkubation bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min für 5–7 h.
      HINWEIS: In dieser Phase erreichen die Kulturen die späte exponentielle Phase, und die Bakterien sind hochinvasiv.
   2. Bereiten Sie 100 mM TCO*A-Stammlösung und vollständige Medien vor (Tabelle 1).
   3. Um die HeLa-Zellinfektion einzuleiten, nehmen Sie die HeLa-Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem DPBS, bevor Sie 500 μl frisches DMEM (+10% FBS) in jede Vertiefung geben. Legen Sie den Kammerschieber wieder in den CO₂ -Inkubator, bis die Infektion beginnt.
   4. Nach 5–7 h Inkubation wird die Salmonellenkultur auf OD₆₀₀ = 0,2 in 1 ml DMEM-Nährmedium (~3 × 10⁸ KBE/ml) verdünnt. Geben Sie die erforderlichen Mengen des Salmonella-Inokulums in jede Vertiefung des Kammerträgers, so dass die Infektionsmultiplizität (MOI) 100 beträgt.
   5. Inkubieren Sie die infizierten Zellen in einem CO₂ -Inkubator für 30 min. Waschen Sie die Zellen 3x mit vorgewärmtem DPBS, um extrazelluläre Salmonellen zu entfernen. Setzen Sie diesen Zeitpunkt auf 0 Stunden nach der Infektion. 500 μl komplettes Medium (Tabelle 1) mit 100 μg/ml Gentamicin für 1 h zugeben. Nach 1 h waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Fügen Sie 500 μL des gesamten Mediums hinzu (ab Schritt 5.4.2; Tabelle 1) ergänzt mit 0,2 % Arabinose, 10 μg/ml Gentamicin in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers.
   6. Führen Sie in einem Kontrollexperiment ähnliche Infektionen von HeLa-Zellen ohne TCO*A durch.
   7. Inkubieren Sie den Kammerobjektträger für 10 h im CO₂ -Inkubator.
5. Click-Chemie-basierte Markierung in lebenden Zellen
   1. Fahren Sie mit der Markierung der mit Bakterien infizierten Zellen fort. Das komplette Medium ohne TCO*A vorwärmen (Tabelle 1).
   2. Ersetzen Sie nach 10 h nach der Infektion das komplette Medium durch frisches Komplettmedium ohne TCO*A und waschen Sie die HeLa-Zellen 4x im Abstand von jeweils 30 min mit vorgewärmtem DPBS, gefolgt von frischem Komplettmedium (ohne TCO*A).
   3. Bereiten Sie eine 0,5 mM Farbstoff-Tetrazin-Stammlösung in DMSO vor.
      HINWEIS: Für die Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren in Wirtszellen werden zwei Protokolle vorgestellt. Für Protokoll 1 wird die Farbstoffmischung hergestellt, indem JF646-Tz-Stamm in 1x PBS mit 1 % Kasein-Natriumsalz aus Rindermilch verdünnt wird, so dass die endgültige Arbeitslösung 2 μM beträgt. Für Protokoll 2 bereiten Sie warmes Komplettmedium (ohne FBS und TCO*A) vor und fügen 2 μM JF646-Tz hinzu. Arbeiten Sie nach Möglichkeit im Dunkeln (dimmen Sie das Licht in der Dunstabzugshaube und/oder im Raum).
   4. Nach 12 Stunden nach der Infektion wird das Medium von den Zellen abgesaugt. Waschen Sie die Zelle 2x oder 3x mit vorgewärmtem DPBS. In einer Gruppe von Vertiefungen werden 500 μl der in Protokoll 1 beschriebenen Farbstofflösungsmischung und in einer anderen Gruppe von Vertiefungen desselben Kammerschiebers 500 μl der in Protokoll 2 beschriebenen Farbstofflösungsmischung in Schritt 5.5.3 und der folgenden Anmerkung zugegeben. Legen Sie die Kammerobjektträger für 1,5–2 h zurück in den CO_{2 -} Inkubator.
   5. Nach 13,5–14 h nach der Infektion werden die HeLa-Zellen 2x mit vorgewärmtem DPBS gespült. Fügen Sie 500 μL frisches DMEM (ergänzt mit FBS) hinzu. Legen Sie den Kammerschieber für 30 Minuten wieder in den Inkubator. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem DPBS, gefolgt von frischem DMEM 4x in einem Intervall von 30 Minuten.
   6. 16 Stunden nach der Infektion fixieren Sie die HeLa-Zellen mit PFA, indem Sie 200 μl 4% PFA in jede Vertiefung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Saugen Sie das PFA ab, spülen Sie 3x mit PBS und lagern Sie die Zellen in PBS bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: PFA ist eine hochgiftige Chemikalie. Vermeiden Sie das Einatmen sowie Haut- und Augenkontakt. Tragen Sie bei der Handhabung Schutzausrüstung. Um zu vermeiden, dass die markierte Probe Licht ausgesetzt wird, schalten Sie das Licht in der Zellkulturhaube aus.
6. Immunfärbung von HA-markierten Proteinen
   1. Das PBS wird abgesaugt und einmal in Sperrlösung gespült (Tabelle 1).
   2. Inkubieren Sie die fixierten HeLa-Zellen mit einer PBS-basierten primären Antikörperlösung (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Verwenden Sie einen Kaninchen-Anti-HA-Primärantikörper, um sezerniertes SseJ zu färben (1:500 Verdünnung).
   3. Waschen Sie die Zellen nach 1 Stunde 2x vorsichtig mit 0,5 ml 0,1 % Tween-20/1x PBS. Während der Waschungen mit Tween/PBS-Lösung werden die Zellen 3x mit 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS für 5 min inkubiert.
   4. Sekundärer Antikörper Esel Anti-Kaninchen 555 1:500 in sekundärer Antikörperlösung verdünnen und 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   5. Nach 1 h werden die Zellen 2x mit 0,5 mL 0,1 % Tween-20/1x PBS vorsichtig gewaschen und 2x mit 0,5 mL 0,1 % Tween20/1x PBS für 5 min inkubiert.
   6. Waschen Sie die Zellen 3x mit 0,5 mL 1x PBS und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Fixierte Zellen können einige Wochen in PBS bei 4 °C gelagert werden. Die Immunfärbung sollte in letzter Minute durchgeführt werden.

6. Konfokale Bildgebung

1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, z. B. ein Spinning-Disc-Mikroskop (SD) oder ein STED-Mikroskop.
   1. Passen Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme an, z. B. Scanmodus (XYZ), Scangeschwindigkeit (400 Hz), Auflösung (512 x 512), Vergrößerung (100x) und Z-Stacking.
   2. Verwenden Sie die richtigen Anregungs-/Emissionsfilter für DAPI-, BDP-Tz- und JF646-Tetrazin.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde die konfokale Bildgebung auf einem STED-Mikroskopsystem durchgeführt, das mit einem gepulsten Weißlichtlaser ausgestattet ist, der die Auswahl der Anregung im Bereich von 470–670 nm und einem UV-Diodenlaser mit 405 nm für die Anregung bei 405 nm, 488 nm und 647 nm ermöglicht. Die entsprechenden Emissionsbereiche wurden mit Hilfe des eingebauten akusto-optischen Strahlteilers in Kombination mit einer prismenbasierten durchstimmbaren Multiband-Spektraldetektion des konfokalen Systems eingestellt.
   3. Nehmen Sie die Bilder mit einem 100×/1,4-Ölimmersionsobjektiv auf.

7. Super-Resolution-Bildgebung (dSTORM)

1. Schalten Sie das Mikroskop 3 Stunden vor der Bildgebung ein, um ein thermisches Gleichgewicht zu ermöglichen (Drift ist wahrscheinlicher, wenn die Bildgebung vorher beginnt). Kühlen Sie die Kamera auf -70 °C.
2. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen neuen GLOX-BME-Bildgebungspuffer vor (Tabelle 1).
3. Bringen Sie die Zellen zum Mikroskop. Platzieren Sie die Bildgebungskammer auf dem Mikroskoptisch im Probenhalter. Stellen Sie sicher, dass die Probe im Halter flach und sicher ist. Wechseln Sie das Medium in der Vertiefung mit 0,4 ml des frisch hergestellten GLOX-BME-Bildverarbeitungspuffers.
4. Stellen Sie die richtigen Laserlinien- und Filtersätze ein. Verringern Sie die Laserleistung auf ~1 mW, um eine HeLa-Zelle von Interesse zu identifizieren. Passen Sie die Fokusebene und den Laserstrahlwinkel an, während Sie die Probe mit niedrigen Laserdichten von 647 nm beleuchten (in diesem Fall wird ein steil geneigter Winkel [HILO] vorgeschlagen, da HILO das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis [SBR] erhöht). Passen Sie den HILO-Beleuchtungswinkel an.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die hochauflösende Bildgebung von SseJ im Alexa Fluor 647-Kanal mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) aufgenommen, das mit einem TIRF-Objektiv (100x Apo TIRF-Ölimmersionsobjektiv, NA 1.49) ausgestattet ist. Die Fluoreszenz wurde mit einer EMCCD-Kamera detektiert, die über den μManager gesteuert wurde.
5. Stellen Sie die Vorverstärkerverstärkung auf 3 und aktivieren Sie die Bildübertragung im μManager. Stellen Sie die EM-Verstärkung auf 200 ein, um eine höhere Empfindlichkeit bei dSTORM-Messungen zu erzielen, wie in einem früheren Bericht³⁵ beschrieben.
6. Nehmen Sie vor der dSTORM-Bildgebung ein beugungsbegrenztes Referenzbild der Zielstruktur auf. Schalten Sie die Fluorophore in den dunklen Zustand, indem Sie den Laser auf seine maximale Leistung einschalten.
   ANMERKUNG: Einzelne, schnell blinkende Moleküle von JF646-Fluorophoren wurden beobachtet, wenn JF646-Fluorophore durch kontinuierliche Beleuchtung von 647 nm Anregungslicht, wie zuvor beschrieben, in einen überwiegend dunklen Zustand überführt wurden³⁶.
7. Stellen Sie die Laserstärke auf ein geeignetes Niveau ein, bei dem die Blinkereignisse räumlich und zeitlich getrennt sind, stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 ms ein und beginnen Sie mit der Erfassung. Erwerben Sie 10.000 bis 30.000 Bilder.
   Anmerkungen: Änderungen in der Laserstärke sollten vorgenommen werden, um das Blinken zu optimieren. Erwägen Sie, die Laserintensität zu erhöhen, wenn zu viele Ereignisse (blinkende Partikel, die sich überlappen) erkannt werden. Die ideale Länge hängt von der Qualität des Samples ab, aber ~10.000 Bilder sollten erkennbare Merkmale aufweisen.

8. Bildrekonstruktion von dSTORM

1. Verwenden Sie eine geeignete Software für die Bildanalyse.
   HINWEIS: ThunderSTORM, eines von vielen verfügbaren Open-Source-Programmen zur Bildrekonstruktion, wird im Folgenden kurz beschrieben.
2. Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie die Rohdaten. Öffnen Sie das ThunderSTORM-Plugin und konfigurieren Sie die Kameraeinstellung, die dem Gerät entspricht.
3. Gehen Sie zu Analyse ausführen und legen Sie die entsprechenden Einstellungen fest, z. B. Bildfilterung (Differenz der Mittelwertfilter), Lokalisierungsmethoden (lokales Maximum) und Subpixel-Lokalisierung von Molekülen (integrierte Gaußsche PSF). Klicken Sie auf OK , um die Bildrekonstruktion zu starten.
   HINWEIS: Falls erforderlich, wurde bereits eine detaillierte Anleitung zum Einrichten der Parameter in ThunderSTORM beschrieben³⁷.

Ergebnisse

Dieses Protokollpapier beschreibt eine GCE-basierte Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung und Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die chemische Struktur der ncAA-tragenden trans-Cycloocten-Bioorthogonalgruppe (TCO) und des Fluoreszenzfarbstoffs ist in Abbildung 1A dargestellt. Die SseJ-Markierung wurde durch genetischen Einbau von bioorthogonalen ncAAs an ei...

Diskussion

Der hier beschriebene Ansatz wurde verwendet, um die genaue Position von Effektorproteinen zu verfolgen, die nach der Infektion vom bakteriellen T3SS in die Wirtszelle injiziert werden. T3SSs werden von intrazellulären Krankheitserregern wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien eingesetzt, um Virulenzkomponenten in den Wirt zu transportieren. Die Entwicklung von hochauflösenden Bildgebungstechnologien hat es möglich gemacht, Virulenzfaktoren mit einer bisher unvorstellbaren Auflösung sichtb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802