Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Resumo

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)

Resumo

Os sistemas de secreção tipo três (T3SSs) permitem que bactérias gram-negativas injetem uma bateria de proteínas efetoras diretamente no citosol de células hospedeiras eucarióticas. Após a entrada, as proteínas efetoras injetadas modulam cooperativamente as vias de sinalização eucarióticas e reprogramam as funções celulares, permitindo a entrada e a sobrevivência bacteriana. O monitoramento e a localização dessas proteínas efetoras secretadas no contexto de infecções fornecem uma pegada para definir a interface dinâmica das interações patógeno-hospedeiro. No entanto, marcar e criar imagens de proteínas bacterianas em células hospedeiras sem interromper sua estrutura/função é tecnicamente desafiador.

A construção de proteínas de fusão fluorescente não resolve esse problema, porque as proteínas de fusão obstruem o aparelho secretor e, portanto, não são secretadas. Para superar esses obstáculos, recentemente empregamos um método para marcação fluorescente sítio-específica de efetores secretados por bactérias, bem como outras proteínas difíceis de rotular, usando expansão de código genético (GCE). Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo completo para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio GCE, seguido de instruções para obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)

Descobertas recentes sugerem que a incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) via GCE, seguida de marcação bio-ortogonal com corantes contendo tetrazina, é uma técnica viável para marcação seletiva e visualização de proteínas secretadas por bactérias e posterior análise de imagens no hospedeiro. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser empregado por investigadores interessados em conduzir imagens de super-resolução usando GCE para estudar vários processos biológicos em bactérias e vírus, bem como interações patógeno-hospedeiro.

Introdução

As infecções bacterianas têm sido consideradas como um sério perigo para a saúde humana. Os patógenos utilizam sistemas de defesa altamente evoluídos, extremamente poderosos e intrincados, bem como uma variedade de fatores de virulência bacteriana (referidos como proteínas efetoras) para escapar das respostas imunes do hospedeiro e estabelecer infecções ^1,2. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esses sistemas e o papel de proteínas efetoras individuais ainda são amplamente desconhecidos devido à escassez de abordagens adequadas para seguir diretamente os componentes e efetores cruciais da proteína nas células hospedeiras durante a patogênese.

Um exemplo típico é o sorovar Typhimurium de Salmonella enterica, que causa gastroenterite aguda. Salmonella Typhimurium usa sistemas de secreção tipo três (T3SS) para injetar uma variedade de proteínas efetoras diretamente nas células hospedeiras. Assim que a Salmonella entra na célula hospedeira, ela reside em um compartimento ácido ligado à membrana, denominado vacúolo contendo Salmonella (SCV)^3,4. O pH ácido do SCV ativa a T3SS codificada pela ilha de patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2) e transloca uma quantidade de 20 ou mais proteínas efetoras através da membrana vacuolar para o citosol do hospedeiro 5,6,7,8. No interior do hospedeiro, esses coquetéis complexos de proteínas efetoras manipulam coordenadamente as vias de sinalização da célula hospedeira, resultando na formação de estruturas tubulares complexas e altamente dinâmicas estendidas a partir do SCV ao longo de microtúbulos, denominados filamentos induzidos por Salmonella (SIFs), que permitem que a Salmonella sobreviva e se replique dentro das células hospedeiras^9,10,11.

Métodos para visualizar, rastrear e monitorar localizações de efetores bacterianos, e examinar seu tráfego e interações dentro das células hospedeiras, fornecem informações críticas sobre os mecanismos subjacentes à patogênese bacteriana. A marcação e localização de proteínas efetoras de T3SS secretadas por Salmonella dentro das células do hospedeiro tem se mostrado um desafio tecnológico^12,13; No entanto, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, transformou nossa capacidade de estudar e visualizar proteínas dentro de sistemas vivos. No entanto, o tamanho das proteínas fluorescentes (~25-30 kDa)15 é frequentemente comparável ou até maior do que o da proteína de interesse (POI; por exemplo, ^13,65 kDa para SsaP, 37,4 kDa para SifA). De fato, a marcação de proteínas fluorescentes dos efetores frequentemente bloqueia a secreção do efetor marcado e obstrui o T3SS¹⁴.

Além disso, as proteínas fluorescentes são menos estáveis e emitem um baixo número de fótons antes do fotoclareamento, limitando seu uso em técnicas microscópicas de super-resolução^16,17,18, particularmente em microscopia de localização por fotoativação (PALM), STORM e microscopia de depleção de emissão estimulada (STED). Embora as propriedades fotofísicas dos corantes fluorescentes orgânicos sejam superiores às das proteínas fluorescentes, métodos/técnicas como CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 e HA-Tags^24,25 requerem uma proteína adicional ou apêndice peptídico que pode prejudicar a função-estrutura da proteína efetora de interesse^, interferindo com a modificação ou tráfico pós-traducional. Um método alternativo que minimiza a modificação proteica necessária envolve a incorporação de ncAAs em um POI durante a tradução através de GCE. Os ncAAs são fluorescentes ou podem ser tornados fluorescentes via click chemistry 12,13,26,27,28.

Usando GCE, ncAAs com grupos bio-ortogonais minúsculos, funcionais (como um grupo azida, ciclopropeno ou ciclooctyne) podem ser introduzidos em quase qualquer local em uma proteína-alvo. Nessa estratégia, um códon nativo é trocado por um códon raro, como um códon de parada âmbar (TAG) em uma posição especificada no gene do POI. A proteína modificada é subsequentemente expressa em células ao lado de um par ortogonal aminoacil-tRNA sintetase/tRNA. O sítio ativo da tRNA sintetase é projetado para receber apenas um ncAA particular, que é então ligado covalentemente à extremidade 3' do tRNA que reconhece o códon âmbar. A ncAA é simplesmente introduzida no meio de crescimento, mas deve ser absorvida pela célula e chegar ao citosol, onde a aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) pode ligá-la ao RNAt ortogonal; em seguida, é incorporado ao POI no local especificado (ver Figura 1)¹². Assim, a ECG permite a incorporação sítio-específica de uma infinidade de grupos reativos bio-ortogonais como cetona, azida, alquina, ciclooctila, transcicloocteno, tetrazina, norboneno, α, amida β-insaturada e biciclo[6.1.0]-nonina em um POI, potencialmente superando as limitações dos métodos convencionais de marcação de proteínas 12,26,27,28.

Tendências recentes emergentes em técnicas de imagem de super-resolução abriram novos caminhos para investigar estruturas biológicas em nível molecular. Em particular, o STORM, uma técnica de super-resolução baseada em localização e molécula única, tornou-se uma ferramenta inestimável para visualizar estruturas celulares até ~20-30 nm e é capaz de investigar processos biológicos uma molécula de cada vez, descobrindo assim os papéis de moléculas intracelulares que ainda são desconhecidos em estudos tradicionais de média de conjunto¹³ . Técnicas de molécula única e super-resolução requerem uma pequena etiqueta com fluoróforos orgânicos brilhantes e fotoestáveis para a melhor resolução. Recentemente, demonstramos que a ECG pode ser usada para incorporar sondas adequadas para imagens de super-resolução¹².

Duas das melhores escolhas para marcação de proteínas em células são a biciclo[6.1.0] nonilisina (BCN) e a transciclooctena-lisina (TCO; mostrada na Figura 1), que podem ser codificadas geneticamente usando uma variante do par tRNA/sintetase (aqui denominado tRNA Pyl/PylRS AF), onde^Pyl representa pirrolisina, e^AF representa um mutante duplo racionalmente projetado (Y306A, Y384F) derivado de Methanosarcina mazei que codifica naturalmente pirrolisina ^12, 29,30,31. Através da reação de Diels-Alder (SPIEDAC) de demanda eletrônica inversa promovida por deformação, esses aminoácidos reagem quimoseletivamente com conjugados de tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tais reações de cicloadição são excepcionalmente rápidas e compatíveis com células vivas; Também podem ser fluorogênicos, se um fluoróforo apropriado for funcionalizado com a porção tetrazina^12,26,32. Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para monitorar a dinâmica de efetores bacterianos entregues em células hospedeiras usando GCE, seguido de localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando dSTORM. Os resultados indicam que a incorporação de uma ncAA via GCE, seguida por uma reação de clique com corantes fluorogênicos portadores de tetrazina, representa um método versátil para marcação seletiva, visualização de proteínas secretadas e subsequente localização subcelular no hospedeiro. Todos os componentes e procedimentos aqui detalhados, no entanto, podem ser ajustados ou substituídos para que o sistema GCE possa ser adaptado para investigar outras questões biológicas.

Protocolo

1. Construção do plasmídeo

1. Clone o gene que expressa o POI em um plasmídeo de expressão (por exemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expressa o POI em E. coli BL21 (DE3). Essa etapa facilita na determinação de que os mutantes são funcionais.
2. Para a visualização de efetores secretados por Salmonella em células hospedeiras, construir-se um plasmídeo de expressão (pWSK29-sseJ-HA) que expresse o alvo POI SseJ sob o controle de seu promotor nativo, como descrito em relatos anteriores 7,12,24. Usando mutagênese sítio-dirigida, substitua o códon de fenilalanina-10 por um códon âmbar (TAG) em SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), garantindo o motivo AAT-TAG-ACT ^33,34.
3. Além dos plasmídeos acima, para a incorporação genética de trans-ciclooct-2-en-L-lisina (TCO*A) em um POI, utiliza-se outro plasmídeo de expressão (pEVOL-PylRS-AF)³¹ que contém os genes evoluídos do par tRNA/sintetase (tRNA^Pyl/^{PylRS AF} ) codificados no plasmídeo pEVOL.
   NOTA: Descrições detalhadas do plasmídeo e dos protocolos de clonagem estão descritos no relato anterior^30,31.
4. Use kits de preparação de plasmídeos disponíveis comercialmente para obter DNA plasmidial de alta qualidade. Para DNA purificado, a proporção ideal de 260/280 é de ~1,8. Verifique a pureza do DNA usando eletroforese em gel de agarose a 1%, se necessário.

2. Preparação da cultura bacteriana

1. Obtenção de transformantes duplos para testar se o mutante é funcional em E. coli
   1. Tire as células competentes do BL21 de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 a 30 min.
   2. Misturar 1–5 μL de cada plasmídeo (~50 ng de pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG) com 200 μL de células BL21 quimicamente competentes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Misture as células competentes e a mistura de plasmídeos suavemente; incubar por 30 min no gelo.
   3. Choque térmico do tubo de microcentrífuga em banho-maria a 42 °C durante 45 s. Coloque os tubos novamente no gelo por 2 min.
   4. Adicionar 1 mL de meio LB quente ao tubo de microcentrífuga e transferir rapidamente a mistura para um tubo cônico de 15 mL. Incubar as células a 37 °C num agitador a 250 rpm durante 1 h. Plaquear alguma porção ou todas as células transformadas em placas de ágar LB contendo antibióticos apropriados. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Neste protocolo, 35 μg/mL de cloranfenicol e 50 μg/mL de canamicina foram usados para selecionar pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG, respectivamente. Na etapa de transformação, avalie a transformação bem-sucedida usando controles negativos e positivos.
2. Transferir o mutante para Salmonella para a visualização dos efetores secretados por Salmonella nas células hospedeiras:
   1. Adicionar 2–3 μL cada de pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG a 40–60 μL de Salmonella Typhimurium eletrocompetente cepa 14028s em um tubo de microcentrífuga refrigerado. Misture a mistura suavemente com uma pipeta.
   2. Transferir a mistura de eletroporação para uma cubeta resfriada (0,2 cm de intervalo de eletrodos); ajuste as configurações de eletroporação para 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Coloque a cubeta dentro da câmara de eletroporação. Certifique-se de que o eletrodo da câmara faça contato firme com a cubeta micro pulser.
   3. Mantenha pressionado o botão de pulso até que ele emita um sinal sonoro.
   4. Adicione imediatamente 1 mL de meio LB morno na cubeta. Transfira todo o conteúdo para um tubo cônico de 15 mL. Incubar as células a 37 °C com agitação a 250 rpm durante 1 h.
   5. Colocar em placa alguma porção ou toda a mistura de eletroporação de Salmonella em uma placa de ágar LB contendo antibióticos apropriados. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
      OBS: Neste protocolo, 35μg/mL de cloranfenicol e 100μg/mL de ampicilina foram utilizados para a seleção de pEVOL-PylRS-AFe pWSK29-sseJ 10TAG, respectivamente.
3. Preparação da cultura
   1. Inocular uma única colônia de Salmonella ou E. coli em 5 mL de meio LB contendo antibióticos apropriados. Crescer durante a noite a 37 °C, agitando a 250 rpm.

3. Expressão e marcação fluorescente de proteínas portadoras de ncAA

1. Expressão de proteínas portadoras de ncAA em E. coli
   1. Transferir 100 μL de cultura primária para 5 mL de meio LB (diluição 1:50) contendo 35 μg/mL de cloranfenicol e 50 μg/mL de canamicina, seguido de incubação a 37 °C com agitação a 250 rpm até que OD₆₀₀ atinja 0,4–0,6.
   2. Preparar 1 mM de solução-mãe de TCO*A (10 ml; Tabela 1).
   3. Quando as culturas atingirem OD₆₀₀ = 0,4–0,6, substituir o meio LB por LB fresco contendo 1 mM TCO*A, 35 μg/mL de cloranfenicol e 50 μg/mL de canamicina.
      NOTA: Alternativamente, a solução-mãe TCO*A pode ser preparada conforme descrito na etapa 5.4.2.
   4. Induzir a expressão proteica na presença de 1 mM IPTG, 0,2% de arabinose e agitar durante a noite a 34 °C, 250 rpm. Colher as células bacterianas por centrifugação por 5 min a 11.000 × g. Retire o sobrenadante e congele o pellet a -20 °C até nova utilização.
   5. Para um experimento controle, repita o mesmo experimento, mas expresse as proteínas portadoras de ncAA na ausência do ncAA. Para a marcação fluorescente in vitro de proteínas portadoras de ncAA em E. coli, siga o procedimento detalhado descrito na etapa 3.3.
2. Expressão de proteínas portadoras de ncAA em Salmonella
   1. Transferir 100 μL de cultura primária para 5 mL de meio LB (diluição 1:50) contendo 35 μg/mL de cloranfenicol e 100 μg/mL de ampicilina, seguido de incubação a 37 °C com agitação a 250 rpm até que OD₆₀₀ atinja 0,6.
   2. Preparar meio N-mínimo modificado (MgM, pH 5,6) conforme descrito na Tabela 1.
   3. Substitua o meio LB por meio N-mínimo modificado (MgM) suplementado com 1 mM TCO*A (Tabela 1). Cultivar as bactérias a 34 °C durante 30 min. Em seguida, adicionar arabinose a 0,2%, cloranfenicol 25 mg/mL e ampicilina 100 mg/mL e cultivar as células por mais 6 h, agitando a 250 rpm.
   4. Após 6 h, lavar as bactérias 4x em um intervalo de 30 min, com meio fresco de MgM (pH 5,6) (Tabela 1) sem ncAA. Nas etapas de lavagem, use 972 × g por 15 min à temperatura ambiente.
   5. Centrifugar as bactérias, ressuspender em tampão PBS 1x e incubar por 1 h a 4 °C no escuro para remover o excesso de ncAAs. Após 1 h, centrifugar as bactérias a 3.000 × g, 4 °C por 15 min e armazenar para uso posterior.
   6. Para um experimento controle, repita o mesmo experimento expressando proteínas portadoras de ncAA na ausência de ncAA.
3. Marcação por fluorescência in vitro de proteínas portadoras de ncAA em Salmonella Typhimurium
   1. Ressuspender células de Salmonella expressando SseJ-F10TCO-HA na ausência ou presença de TCO*A (a partir da etapa 3.2) em 1x PBS. Ajuste o OD₆₀₀ para 4 no PBS. Incubar as células com 20 μM de Janelia Fluor 646-tetrazina (JF646-Tz) ou 20 μM de BDP-Fl-tetrazina (5 mM de soluções-mãe em DMSO) a 37 °C no escuro e agitar durante 1–2 h a 250 rpm.
   2. Pellet as células, lavar 3–4x com PBS contendo 5% de DMSO e 0,2% Pluronic F-127, ressuspender em PBS contendo 5% de DMSO e incubar durante a noite a 4 °C no escuro. Lave 2x novamente com 1x PBS. Nas etapas de lavagem, use 972 × g, por 15 min à temperatura ambiente.
   3. Fotografe as células imediatamente usando um microscópio confocal ou fixe-as com paraformaldeído (PFA) a 1,5% em PBS por 30–45 min à temperatura ambiente no escuro.
   4. Lave as células fixas 2x com PBS e, finalmente, em 50 mM NH₄Cl em PBS por 15 min para remover o excesso de PFA. Ressuspenda as células em PBS e armazene a 4 °C por no máximo 3 a 4 dias. Imagem das bactérias usando microscopia confocal, conforme descrito na seção 6.

4. Caracterização bioquímica de proteínas portadoras de ncAA

1. Lise celular
   1. Ressuspender as células do ponto 3.1 em tampão de lise (Tabela 1) e incubar à temperatura ambiente durante mais de 30 minutos. Resfriar a mistura no gelo por 15 min.
      NOTA: Mantenha a proporção de tampão de lise para peso celular usado para 1:10.
   2. Sonicate as células ressuspensas ainda no gelo. Pulse por 30 s na configuração 7 pelo menos 6x, com intervalos de 1 min, usando um sonicator (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Gire o lisado celular a 20.500 × g, 4 °C por 15 min (manter 4 °C é fundamental). Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e descarte o pellet.
2. Análise SDS-PAGE
   1. Preparar corante de carregamento SDS 5x (Tabela 1). Adicionar 5 μL de tampão de carga de gel SDS a 13 μL de lisado celular. Desnaturar as proteínas com tampão de amostra dodecil sulfato de sódio (SDS) em um tubo de 2 mL a 95 °C por 10 min, centrifugar a mistura a 2.000 × g por 50 s e carregar em um gel de poliacrilamida SDS a 12%.
   2. Monte o de gel, coloque-o em um aparelho de eletroforese em gel e conecte o aparelho de eletroforese a uma fonte de alimentação elétrica. Despeje o tampão de corrida, carregue os marcadores de peso molecular e amostras de proteína e passe o gel a 100 V, até que o bromofenol atinja o fundo do gel de resolução.
      NOTA: Inicie a análise imediatamente, pois os lisados armazenados a -20 °C tendem a perder qualidade após cada ciclo de congelamento-descongelamento.
   3. Manchar o gel com a coloração de proteína azul de Coomassie.

5. Marcação bio-ortogonal do efetor secretado por Salmonella SseJ-F10TCO-HA em células HeLa

1. Cultivar e manter células HeLa a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose (4,5 g/L), suplementado com FBS a 10% (v/v), além de Penicilina-Estreptomicina (1x).
2. Bactérias de cultura 1 dia antes da infecção. Inocular uma única colônia de Salmonella 14028s contendo pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG em 5 mL de caldo LB padrão contendo antibiótico durante a noite a 37 °C, agitando a 250 rpm.
3. Semear células HeLa 1 dia antes da infecção. Tomar um frasco de cultura de tecidos (T-75) contendo células HeLa a ~80% de confluência, conforme determinado pelo exame microscópico da densidade celular. Lave as células com PBS quente. Separar as células com 3 mL de tripsina a 0,25% quente/EDTA por 5 min a 37 °C, 5% CO₂.
   1. Eliminar a tripsina usando 2 mL de DMEM (+ 10% FBS). Transferir todo o conteúdo do balão para um tubo de 15 mL após ressuspensão das células. Gire as células a 1.000 × g por 5 min. Retire o sobrenadante do tubo. Ressuspender o pellet de células HeLa em meio de crescimento pré-aquecido.
   2. Use um hemocitômetro para examinar a suspensão e contar as células presentes. Preparar um estoque de células diluídas a 1 × 10⁵ células/mL. Sementes 0,5 × 10⁵ células HeLa por poço em 500 μL de DMEM + 10% de meio de crescimento FBS em lâmina de câmara de oito poços. Manter a lâmina da câmara em uma incubadora a 37 °C, 5% CO₂, 95% de umidade por 24 h.
4. Infecção bacteriana
   1. Subcultura de Salmonella 14028s contendo pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, diluindo 100 μL de cultura bacteriana noturna (a partir da etapa 5.2) em 3 mL de meio LB (diluição 1:30) contendo 35 μg/mL de cloranfenicol e 100 μg/mL de ampicilina, seguido de incubação a 37 °C com agitação a 250 rpm por 5–7 h.
      NOTA: Durante esta fase, as culturas atingem a fase exponencial tardia, e as bactérias são altamente invasivas.
   2. Preparar solução estoque TCO*A de 100 mM e mídia completa (Tabela 1).
   3. Para iniciar a infecção celular HeLa, retire as células HeLa da incubadora e lave as células com DPBS pré-aquecido antes de adicionar 500 μL de DMEM fresco (+10% FBS) a cada poço. Coloque a lâmina da câmara de volta na incubadora CO₂ até que a infecção comece.
   4. Após 5–7 h de incubação, diluir a cultura de Salmonella para OD₆₀₀ = 0,2 em 1 mL de meio de crescimento DMEM (~3 × 10⁸ ufc/mL). Adicione as quantidades necessárias do inóculo de Salmonella em cada poço da lâmina da câmara para que a multiplicidade de infecção (MOI) seja de 100.
   5. Incubar as células infectadas em uma incubadora de CO₂ por 30 min. Lave as células 3x com DPBS pré-aquecido para remover Salmonella extracelular. Defina este ponto de tempo para 0 h após a infecção. Adicionar 500 μL de meio completo (Tabela 1) contendo 100 μg/mL de gentamicina por 1 h. Após 1 h, lavar as células 3x com DPBS. Adicionar 500 μL do meio completo (a partir do passo 5.4.2; Tabela 1) suplementado com arabinose a 0,2%, gentamicina 10 μg/mL para cada poço da lâmina da câmara.
   6. Em um experimento controle, realizar infecções semelhantes de células HeLa sem TCO*A.
   7. Incubar a lâmina da câmara por 10 h na incubadora CO₂ .
5. Clique em rotulagem baseada em química em células vivas
   1. Prossiga para rotular as células infectadas por bactérias. Pré-aquecer o meio completo sem TCO*A (Tabela 1).
   2. Após 10 h após a infecção, substitua o meio completo por meio completo fresco sem TCO*A e lave as células HeLa 4x em um intervalo de 30 min cada com DPBS pré-aquecido, seguido por meio completo fresco (sem TCO*A).
   3. Preparar uma solução de corante-tetrazina 0,5 mM em DMSO.
      NOTA: Para a marcação de efetores secretados por Salmonella em células hospedeiras, dois protocolos são apresentados. Para o protocolo 1, preparar a mistura de corante diluindo o estoque JF646-Tz em 1x PBS contendo 1% de sal de caseína sódica do leite bovino, de modo que a solução final de trabalho seja de 2 μM. Para o protocolo 2, preparar meio completo morno (sem FBS e TCO*A) e adicionar 2 μM JF646-Tz. Faça esta mistura de corantes fresca para cada sessão de rotulagem. Trabalhe no escuro, se possível (diminua as luzes do capô e/ou da sala).
   4. Após 12 h após a infecção, aspirar o meio das células. Lave a célula com DPBS pré-aquecido 2x ou 3x. Em um grupo de poços, adicionar 500 μL da mistura de solução corante descrita no protocolo 1, e em outro grupo de poços da mesma lâmina de câmara, adicionar 500 μL da mistura de solução corante descrita no protocolo 2 mencionado na etapa 5.5.3 e na nota após. Coloque a câmara desliza de volta para a incubadora de CO 2 por 1,5 a₂ h.
   5. Após 13,5–14 h após a infecção, lave as células HeLa 2x com DPBS pré-aquecido. Adicionar 500 μL de DMEM fresco (suplementado com FBS). Coloque a lâmina da câmara de volta na incubadora por 30 min. Lave as células com DPBS pré-aquecido seguido de DMEM fresco 4x durante um intervalo de 30 min.
   6. Em 16 h após a infecção, fixar as células HeLa com PFA adicionando 200 μL de PFA a 4% em cada poço e incubando por 10 min à temperatura ambiente no escuro. Aspirar o PFA, enxaguar 3x com PBS e armazenar as células em PBS a 4 °C no escuro.
      NOTA: PFA é um produto químico altamente tóxico. Evite a inalação, bem como o contato com a pele e os olhos. Use equipamentos de proteção ao manusear. Para evitar que a amostra marcada seja exposta à luz, apague a luz na capa de cultura celular.
6. Imunomarcação de proteínas marcadas com AH
   1. Aspirar o PBS e enxaguar uma vez em solução de bloqueio (Tabela 1).
   2. Incubar as células HeLa fixas com uma solução de anticorpos primários à base de PBS (Tabela 1) por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Use um anticorpo primário anti-HA de coelho para corar SseJ secretado (diluição de 1:500).
   3. Após 1 h, lavar suavemente as células 2x com 0,5 mL de Tween-20/1x PBS 0,1%. Durante as lavagens com solução de Tween/PBS, incubar as células 3x com 0,5 mL de Tween20/1x PBS a 0,1% por 5 min.
   4. Diluir o anticorpo secundário burro anti-coelho 555 1:500 em solução de anticorpos secundários e incubar durante 1 h à temperatura ambiente no escuro.
   5. Após 1 h, lavar suavemente as células 2x com 0,5 mL de Tween-20/1x PBS a 0,1% e incubar 2x com 0,5 mL de Tween20/1x PBS 0,1% por 5 min.
   6. Lavar as células 3x com 0,5 mL de PBS 1x e armazená-las a 4 °C no escuro.
      NOTA: As células fixas podem ser armazenadas durante algumas semanas em PBS a 4 °C. A imunomarcação deve ser realizada de última hora.

6. Imagem confocal

1. Use um microscópio confocal, como disco giratório (SD) ou microscópio STED.
   1. Ajuste as configurações de aquisição de imagem, como modo de digitalização (XYZ), velocidade de digitalização (400 Hz), resolução (512 x 512), ampliação (100x) e empilhamento Z.
   2. Use os filtros de excitação/emissão corretos para DAPI, BDP-Tz e tetrazina JF646.
      NOTA: Para este protocolo, imagens confocais foram realizadas em um sistema de microscópio STED equipado com um laser de luz branca pulsada, permitindo a seleção de excitação na faixa de 470-670 nm e um laser de diodo UV 405 nm para excitação em 405 nm, 488 nm e 647 nm. As faixas de emissão apropriadas foram estabelecidas usando o divisor de feixe óptico acusto-óptico embutido em combinação com uma detecção espectral multibanda ajustável baseada em prisma do sistema confocal.
   3. Adquira as imagens usando uma objetiva de imersão em óleo 100×/1.4.

7. Imagem de super-resolução (dSTORM)

1. Ligue o microscópio 3 h antes da aquisição de imagens para permitir o equilíbrio térmico (a deriva é mais provável de ocorrer se a imagem começar antes disso). Resfriar a câmera a -70 °C.
2. Enquanto isso, prepare um novo tampão de imagem GLOX-BME (Tabela 1).
3. Leve as células ao microscópio. Coloque a câmara de imagem no estágio do microscópio no porta-amostras. No suporte, certifique-se de que a amostra é plana e segura. Troque o meio no poço com 0,4 mL do tampão de imagem GLOX-BME recém-fabricado.
4. Defina a linha de laser e os conjuntos de filtros corretos. Diminua a potência do laser para ~1 mW para identificar uma célula HeLa de interesse. Ajuste o plano focal e o ângulo do feixe de laser enquanto ilumina a amostra com baixas densidades de laser de 647 nm (neste caso, um ângulo inclinado acentuado [HILO] é sugerido, uma vez que o HILO eleva o sinal-fundo [SBR]). Ajuste o ângulo de iluminação HILO.
   NOTA: Neste protocolo, imagens de super-resolução do SseJ foram adquiridas no canal Alexa Fluor 647 usando um microscópio de epifluorescência invertido (veja a Tabela de Materiais), equipado com uma objetiva TIRF (objetiva de imersão em óleo 100x Apo TIRF, NA 1.49). A fluorescência foi detectada com uma câmera EMCCD, que foi controlada através do μManager.
5. Ajuste o ganho do pré-amplificador para 3 e ative a transferência de quadros no μManager. Defina o ganho de EM como 200 para maior sensibilidade em medições de dSTORM, conforme descrito em um relatório anterior³⁵.
6. Antes da geração de imagens do dSTORM, capture uma imagem limitada por difração de referência da estrutura alvo. Troque os fluoróforos para o estado escuro ligando o laser até sua potência máxima.
   NOTA: Moléculas individuais de fluoróforos JF646 piscando rapidamente foram observadas quando fluoróforos JF646 foram transformados em um estado predominantemente escuro por iluminação contínua de luz de excitação de 647 nm, como descrito anteriormente³⁶.
7. Ajuste a intensidade do laser para um nível adequado onde os eventos de piscamento são separados no espaço e no tempo, defina o tempo de exposição para 30 ms e inicie a aquisição. Adquira de 10.000 a 30.000 quadros.
   NOTA: Mudanças na força do laser devem ser feitas para otimizar o piscar. Considere aumentar a intensidade do laser se houver muitos eventos (partículas piscando que se sobrepõem) detectados. O comprimento ideal depende da qualidade da amostra, mas ~10.000 quadros devem mostrar características discerníveis.

8. Reconstrução de imagem do dSTORM

1. Utilizar software apropriado para análise de imagens.
   NOTA: ThunderSTORM, um dos muitos programas de reconstrução de imagem de código aberto disponíveis, é brevemente descrito abaixo.
2. Abra o ImageJ e importe os dados brutos. Abra o plugin ThunderSTORM e configure a configuração da câmera correspondente ao dispositivo.
3. Vá para Executar análise e defina as configurações apropriadas, como filtragem de imagem (diferença de filtros médios), métodos de localização (máximo local) e localização subpixel de moléculas (PSF gaussiano integrado). Clique em OK para iniciar a reconstrução da imagem.
   NOTA: Se necessário, instruções detalhadas para configurar os parâmetros no ThunderSTORM já foram descritas³⁷.

Resultados

Este artigo de protocolo descreve um método baseado em GCE para marcação fluorescente sítio-específica e visualização de efetores secretados por Salmonella, como mostrado na Figura 1. A estrutura química do grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) e do corante fluorescente ncAA é mostrada na Figura 1A. A marcação de SseJ foi obtida pela incorporação genética de ncAAs bioortogonais em um códon de parada â...

Discussão

A abordagem aqui descrita foi utilizada para rastrear a localização precisa das proteínas efetoras injetadas na célula hospedeira pela bactéria T3SS após a infecção. T3SSs são empregados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella e Yersinia para transportar componentes de virulência para o hospedeiro. O desenvolvimento de tecnologias de imagem de super-resolução possibilitou a visualização de fatores de virulência com resolução antes inimaginável12,13,24.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802