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要約

本プロトコルは、ウイルスタンパク質(Fgレベル)を正確に検出するための有用なナノシステムに基づく低コストのバイオセンシングプロトタイプの製作について説明する。このような小さなセンサープラットフォームにより、遠隔医療の目標を達成するために、医療モノのインターネット(IoMT)と統合できるポイントオブケアアプリケーションが可能になります。

要約

このセンシングプロトタイプモデルには、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2ウイルス(SARS-CoV-2)を特異的かつ迅速に検出するための、再利用可能な2重酸化グラフェン(GrO)ガラス二重デジタル化静電容量式(DIDC)検出チップの開発が含まれます。作製したDIDCは、酸化グラフェン(GrO)を艶出ししたTi/Pt含有ガラス基板をEDC-NHSでさらに化学修飾し、ウイルスのスパイク(S1)タンパク質をベースにSARS-CoV-2に敵対する抗体(Abs)を固定化します。洞察に満ちた調査の結果、GrOはAb固定化に理想的な工学的表面を提供し、静電容量を強化してより高い感度と低い検出限界を可能にすることを示しました。これらの調整可能なエレメントは、広い検出範囲(1.0 mg/mL から 1.0 fg/mL)、最小検出限界 1 fg/mL、18.56 nF/g の高い応答性と良好な直線性、および 3 秒の高速反応時間を達成するのに役立ちました。さらに、経済的に実行可能なポイントオブケア(POC)テストフレームワークを開発するという点では、この研究でのGrO-DIDCバイオチップの再利用性は良好です。重要なことに、このバイオチップは血液中の抗原に対して特異的であり、5°Cで最大10日間安定しています。 この小型バイオセンサーは、そのコンパクトさから、COVID-19感染のPOC診断に利用できる可能性を秘めています。このシステムは、他の重篤なウイルス性疾患も検出できますが、他のウイルスの例を利用した承認ステップが開発中です。

概要

2019年末に中国武漢市で、後に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)2(以下、主にウイルスと呼ぶ)と名付けられた新しいベータコロナウイルス1(すなわち、2019-nCoV)によって引き起こされたウイルスパンデミックが、肺クラスターと重度の急性呼吸困難を伴うものとして発生しました3.その世界的なヒトからヒトへの感染の速さ、高い感染率、高い死亡率、および生命を脅かす深刻な悪影響4のために、パンデミックの間、ウイルス学研究5は急速に進化し、ウイルスのゲノム組織と構造5,6を特定しました。COVID-19の症状7,8には、高熱、乾いた咳、全身性の痛みなどがあります9。重要なことに、ウイルスの血清型が異なると、疾患の重症度も異なります10。さらに、無症候性のキャリアはウイルスを広める可能性があります。通常、顕微鏡下では、COVID-19ウイルス粒子はスパイクタンパク質によって形成されたこん棒状の突起を示す11。したがって、この新しい病原体の蔓延を制御するには、症例の検出をタイムリーかつ効率的に行う必要があります。したがって、ウイルス感染の初期段階でウイルスを超高感度、迅速、かつ選択的に検出することが重要になっています2,11。ウイルスの感染を避けるためには、社会的/物理的な距離が必要です12。保健機関は、スマート診断ツールとナノシステムの開発を強調しています13。実際、保健機関が提案しているように、対象を絞った大規模な検査14,15が必要であり、現在も需要があります。

原則として、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のような進行中の生物学的診断法は、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)16やSARS-CoV-1と同様に、SARS-CoV-2の大量同定のための最良の手段である17。この文脈では、SARS-CoV-2汚染の現在の標準的な同定は、感染特異的特性の強化に依存する18,19。さらに、SARS-CoV-2の感染は、地域、年齢、人種、性別によって異なることも考慮に入れる必要があります。命を救うという究極の目標を掲げる上で、ポイントオブケア(POC)20,21を使用するための迅速な診断ツールを構築することが重要です。

これに関連して、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、タンパク質免疫吸着剤検査(ELISA)、マイクロスフェアベースの方法、電気化学検査、MRI、PET、NIRFOI22などの通常の戦略は、低ウイルスレベル、低選択性、および低再利用能力に対する感度が低くなっています。さらに、そのような手順は、高価なバイオセンシング診断システム、再利用不可能な試薬、および高度に熟練した労働力23の要件を含む欠点を有する。したがって、これらの洞察に満ちた手法は、迅速、合理的、非常に特異的、または感度の高いPOC法と見なすことはできません24,25。注目すべきは、化合物、容量、および電気技術を利用するさまざまな種類のDNAおよび免疫化装置ベースのバイオセンサーがあることである18,26,27,28。一例として、エボラ出血熱31、ジカ熱、MERS-CoV、SARS-CoV32,33,34の検出のために、応答性が高く、簡単に縮小でき、調整可能な電気DNAバイオセンサーが製造されています。同様に、グラフェンガラスデバイスに固定化された特定の抗体(モノクローナル)を利用してウイルスのスパイクタンパク質を検出するための電界インパクト半導体(FET)バイオセンサーが効果的に作成されました35,36。それにもかかわらず、この新しい戦略はRT-PCRよりも感度が低くなります。さらに、最近では、エアロゾルジェットナノ粒子減少酸化グラフェン(GrO)で覆われたウイルスの3D端末ベースの検出フレームワークが開発されました。これは、同定の限界が低くなっています(2.8 × 10-15 M)。いずれにせよ、提案された複合バイオセンサ構造35は、POCの使用に関して試験され、ウイルス35,37,38の検出に利用される他の既存のバイオセンサ戦略と比較されている。

この研究では、他のバイオセンサーで上記のような制限なしにウイルスのスパイクタンパク質を特定するための、縮小された再利用可能なGrOベースのDIDCバイオセンサーを設計および製造しました。このバイオセンサーは、応答時間から3秒18,27以内にフェムトグラム(fg)レベルでの検出を可能にします。この研究を達成するために、GrOナノフレークは、中咽頭または鼻咽頭スワブからのウイルス抗原タンパク質の低濃度を検出できる、より優れた応答性と選択性のために選択されました。GrOは、バイオセンシングアプリケーション2,39,40,41に有益に利用できる、適切で、合成的に信頼性が高く、一貫性があり、導電性の材料です。さらに、モノクローナルIgG抗体のラベルフリーハイブリダイゼーションアプローチが利用され、ウイルスのスパイクS1タンパク質に焦点を当てました。作製したSARS-CoV-2-GrO-DIDC バイオセンサーは、高度な処理とピラニア溶液による洗浄後に再利用できます。この超高速、高感度、選択的、ラベルフリー、再利用可能なバイオセンサーは、臨床サンプルのバイオセンシングやパーソナライズされたヘルスケアアプリケーション26,42,43,44に利用できます。

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プロトコル

1. DIDC センシングチップのクリーニング

  1. 実験の開始時に、DIDCチップ表面26をピラニア溶液(H2SO4:H2O23:1の比率)で洗浄し、80°Cのホットプレートに15分間置きます。次に、ピペットを使用して蒸留水でセンサー表面を一滴ずつすすぎ、洗浄試薬を完全に除去します。試薬を完全に除去するために、4〜5滴のエチルアルコールで表面をすすぎます。
    注:DICCチップは、以前に公開されたレポート26に従って製造されました。
  2. 次に、センサー表面を室温で乾燥させて試薬を完全に除去し、親水性のセンサー表面を取得します。このチップは、チップ上の酸化グラフェン層をさらに製造するために使用できます(ステップ2)。
  3. クリーンセンサーチップ電極パッドをポリイミドテープで覆います。

2. DIDCセンシングチップ上への酸化グラフェン薄膜の作製

  1. チップをスピンコーティング機の中央の水平位置に置き、市販の単層酸化グラフェン(GO)( 材料表を参照)の水溶液4μLをチップ表面に加えます。その後、スピンコーティングチャンバーを閉じ、1,300rpmで2分間運転します。
  2. 作製したGOチップのアニーリングのために、チップをホットプレート上に水平に80°Cで40分間保持します。

3. GOガラス型DICCセンシングチップの架橋と機能化

  1. N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)およびNHydroxysuccinimide(NHS)と薄膜GOチップとの架橋を行います。
    1. 4 μL(それぞれ0.4 Mおよび0.1 M)のEDC-NHS(材料表を参照)を薄膜GOチップに添加し、アミド結合形成26を介してアミン基とカルボン酸基の共有結合を生成します。

4. タンパク質センシングのための抗体調製とチップ上の固定化

  1. 官能基化したGO-DICCチップを抗体と結合させるためには、希釈バッファー(0.1% BSA[ウシ血清アルブミン]および0.86% NaClを含む0.01 M PBS)を用いて、市販の抗SARS-CoV-2 Abs(ウサギmAb抗S1タンパク質によって再現、 材料表を参照)を溶解する。
    1. 精製した抗体1 μgに、希釈したPBS1 mLを加えます。次に、4 μLの抗体溶液を架橋活性化GO-DICCチップにドロップキャストします。チップを密閉チャンバーに2時間放置して、室温でAbsを官能基化されたチップ表面に結合させます。
      注:AbsのFab領域は、通常、その極性26のために豊富な反応性アミンおよびカルボン酸基からなる。したがって、その後の特異的固定化は、頑健な共有結合の「テールオン」Ab特異的配向をもたらす。
  2. センサー表面への抗体の固定化が完了したら、4 μLのウシ血清アルブミン(BSA)をチップにドロップキャストして、免疫容量性センシングチップの非特異的部位をブロックします。チップを密閉チャンバーに水平に置き、室温で20分間待ちます。
  3. 免疫容量性センシングチップを脱イオン水で洗浄し、室温で乾燥を続けます。
    注:乾燥後、DISCベースの静電容量式免疫センサー(SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC)は、ウイルススパイク抗原の連続検出を行う準備ができています。
  4. ウイルスのスパイクタンパク質をさらに検出するには、1.0 mgから1.0 fgまでのさまざまな濃度を調製して、広い検出限界を得ます。

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結果

ここでは、酸化グラフェンガラスの二重デジタル化容量性(DIDC)センシングチップを使用してSARS-CoV-2ウイルスのS1タンパク質をセンシングするためのプロトコルが提示されます。 図1 は、非常に感度が高くリサイクル可能な酸化グラフェン修飾二重インターディジテッド静電容量式(DIDC)センシングチップの概略図(回路レイアウトを使用した製造)?...

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ディスカッション

生産性の高いDIDCチップベースのバイオセンサを作るためには、DIDCの電荷分布、導電率、誘電率が非常に重要です。重要なことに、これらの検出境界の改善は、DIDC 18,26,27の容量性リアクタンスに関連しています。本研究では、ウイルスAbsに敵対し、酸化グラフェン-DICCベースのSiO2基板

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、韓国教育部が後援する韓国国立研究財団(NRF)による基礎科学研究プログラム(NRF)が助成金2018R1D1A1A1A09083353および助成金2018R1A6A1A03025242、GCSグループ協会(株)がやや、韓国環境省(MOE)大学院が統合汚染防止管理プロジェクトに多大なエネルギーを投入し、2022年に光雲大学の研究助成金によってある程度支持されました。

E.M.は、National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering(5T32EB009035)からの支援に感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

参考文献

  1. Boldog, P. Risk assessment of novel coronavirus COVID-19 outbreaks outside China. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 571-583 (2020).
  2. Seo, G., et al. Rapid detection of COVID-19 causative virus (SARS-CoV-2) in human nasopharyngeal swab specimens using field-effect transistor-based biosensor. ACS Nano. 14 (4), 5135-5142 (2020).
  3. Panda, P. K. Structure-based drug designing and immunoinformatics approach for SARS-CoV-2. Science Advances. 6, 5135-5142 (2020).
  4. Li, R., et al. Substantial undocumented infection facilitates the rapid dissemination of novel coronavirus (SARS-CoV-2). Science Advances. 368, 489-493 (2020).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Hui, D. S. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health - The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China. Journal of Infectious Diseases. 91, 264-266 (2020).
  7. Chen, I. Y., et al. Upregulation of the chemokine (C-C motif) ligand 2 via a severe acute respiratory syndrome coronavirus spike-ACE2 signaling pathway. Journal of Virology. 84 (15), 7703-7712 (2010).
  8. Fung, T. S., Huang, M., Liu, D. X. Coronavirus-induced ER stress response and its involvement in regulation of coronavirus-host interactions. Virus Research. 194, 110-123 (2014).
  9. Park, S. E. Epidemiology, virology, and clinical features of severe acute respiratory syndrome -coronavirus-2 (SARS-CoV-2: Coronavirus Disease-19). Korean Journal of Pediatrics. 63 (4), 119-124 (2020).
  10. Fajnzylber, J., et al. SARS-CoV-2 viral load is associated with increased disease severity and mortality. Nature Communications. 11 (1), 5493(2020).
  11. Rao, K., et al. Review on newly identified coronavirus and its genomic organization. SSR Institute of International Journal of Life Sciences. 6 (2), 2509(2020).
  12. Mujawar, M. A., et al. Nano-enabled biosensing systems for intelligent healthcare: Towards COVID-19 management. Materials Today Chemistry. 17, 100306(2020).
  13. Manickam, P., et al. Artificial intelligence (AI) and internet of medical things (IoMT) assisted biomedical systems for intelligent healthcare. Biosensors. 12 (8), 562-591 (2022).
  14. Kaushik, A. K., et al. Electrochemical SARS-CoV-2 sensing at point-of-care and artificial intelligence for intelligent COVID-19 management. ACS Applied Bio Materials. 3 (11), 7306-7325 (2020).
  15. Lee, D., Lee, J. Testing on the move: South Korea's rapid response to the COVID-19 pandemic. Transportation Research Interdisciplinary Perspectives. 5, 100111(2020).
  16. Emery, S. L., et al. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay for SARS-associated coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 10 (2), 311-316 (2004).
  17. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 52 (1), 67-75 (2014).
  18. Mishra, S., et al. Tailored biofunctionalized biosensor for the label-free sensing of prostate-specific antigen. ACS Applied Bio Materials. 3 (11), 7821-7830 (2020).
  19. Wang, Y. L., et al. Detection of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus nucleocapsid protein using AlGaN/GaN high electron mobility transistors. ECS Transactions. 50 (6), 239-243 (2013).
  20. Ravi, N., Cortade, D. L., Ng, E., Wang, S. X. Diagnostics for SARS-CoV-2 detection: A comprehensive review of the FDA-EUA COVID-19 testing landscape. Biosensors and Bioelectronics. 165, 112454(2020).
  21. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323, 2249-2251 (2020).
  22. Timmer, W. C., Villalobos, J. M. Chemistry Education. 70 (4), 273-280 (1993).
  23. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (5), 368-373 (2006).
  24. Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21, 1192-1199 (2003).
  25. Singhal, C., Khanuja, M., Chaudhary, N., Pundir, C. S., Narang, J. Detection of chikungunya virus DNA using two-dimensional MoS2 nanosheets based disposable biosensor. Scientific Reports. 8, 7734(2018).
  26. Sharma, P. K., et al. Ultrasensitive and reusable graphene oxide-modified double-interdigitated capacitive (DIDC) sensing chip for detecting SARS-CoV-2. ACS Sensors. 6 (9), 3468-3476 (2021).
  27. Sharma, P. K., et al. Ultrasensitive probeless capacitive biosensor for amyloid beta (Ab) detection in human plasma using interdigitated electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 212, 114365(2022).
  28. Wang, L., et al. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 87, 646-653 (2017).
  29. Brasil, P., et al. Zika virus infection in pregnant women in Rio de Janeiro. The New England Journal of Medicine. 375 (24), 2321-2334 (2016).
  30. Kong, J., et al. Molecular wires as chemical sensors. Science. 287 (5453), 622-625 (2000).
  31. Wang, J. Carbon-nanotube based electrochemical biosensors: A review. Electroanalysis. 17 (1), 7-14 (2005).
  32. Layqah, L. A., Eissa, S. An electrochemical immunosensor for the coronavirus associated with the Middle East respiratory syndrome using an array of gold nanoparticle-modified carbon electrodes. Microchimica Acta. 186 (4), 224-234 (2019).
  33. Vermisoglou, E., et al. Human virus detection with graphene-based materials. Biosensors and Bioelectronics. 166, 112436(2020).
  34. Mostafavi, E., Dubey, A. K., Teodori, L., Ramakrishna, S., Kaushik, A. SARS-CoV-2 Oomicron variant: A next phase of the COVID-19 pandemic and a call to arms for system sciences and precision medicine. MedComm. 3 (1), 119(2022).
  35. Ali, M. A., et al. Sensing of COVID-19 antibodies in seconds via aerosol jet printed three dimensional electrodes. Advanced Materials. 33 (7), 2006647(2020).
  36. Ganbold, E., Sharma, P. K., Kim, E. -S., Lee, D. -N., Kim, N. -Y. Capacitive humidity sensor with a rapid response time on a GO-doped P(VDF-TrFE)/LiCl composite for noncontact sensing applications. Chemosensors. 11 (2), 122(2023).
  37. Shivani, T., et al. Antibacterial and antiviral high-performance nanosystems to mitigate new SARS-CoV-2 variants of concern. Current Opinion in Biomedical Engineering. 21, 100363(2022).
  38. Kujawska, M., Mostafavi, E., Kaushik, A. SARS-CoV-2 getting into the brain; Neurological phenotype of COVID-19, and management by nano-biotechnology. Neural Regeneration Research. 18 (3), 519-520 (2022).
  39. Kang, P., Wang, M. C., Nam, S. Bioelectronics with two-dimensional materials. Microelectronic Engineering. 161, 18-35 (2016).
  40. Syama, S., Mohanan, P. V. Comprehensive application of graphene: Emphasis on biomedical concerns. Nano-Micro Letters. 11, 6(2019).
  41. Chaudhary, V., Kaushik, A., Furukawa, H., Khosla, A. Review-Towards 5th generation AI and IoT driven sustainable intelligent sensors based on 2D MXenes and borophene. ECS Sensors Plus. 1, 013601(2022).
  42. Sharma, P. K., et al. Perspectives on 2D-borophene flatland for smart bio-sensing. Materials Letters. 308, https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012818154600010X 131089(2022).
  43. Sharma, P. K., et al. Nanotechnology and its application: A review. Nanotechnology in Cancer Management. Precise Diagnostics Toward Personalized Health Care. Khondakar, K. R., Kaushik, A. K. 1 (1), Elsevier Science. 1-33 (2021).
  44. Rawat, P., et al. Emergence of high-performing and ultra-fast 2D-graphene nano-biosensing system. Materials Letters. 308, 131241(2022).
  45. Ganbold, E., et al. Highly sensitive interdigitated capacitive humidity sensors based on sponge-like nanoporous PVDF/LiCl composite for real-time monitoring. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (3), 4559-4568 (2023).
  46. Feng, J., Guo, Z. Wettability of graphene: From influencing factors and reversible conversions to potential applications. Nanoscale Horizons. 4, 339-364 (2019).
  47. Flynn, S. P., et al. qua-Art: A demonstration of hydrophilic and hydrophobic surfaces fabricated by plasma enhanced chemical vapor deposition. Chemical Education. 94 (2), 221-225 (2017).
  48. Bhardwaj, S. K., Yadav, P., Ghosh, S., Basu, T., Mahapatro, A. K. Biosensing test-bed using electrochemically deposited reduced graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (37), 24350-24360 (2016).
  49. Reddicherla, U., Seyed, M. G., Sonwal, S., Gokana, M. R., Yun, S. H. Portable electrochemical sensing methodologies for on-site detection of pesticide residues in fruits and vegetables. Coordination Chemistry Reviews. 453, 214305(2022).
  50. Reddicherla, U., et al. Colorimetric based on-site sensing strategies for the rapid detection of pesticides in agricultural foods: New horizons, perspectives, and challenges. Coordination Chemistry Reviews. 446, 214061(2021).

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