用于 SARS-CoV-2 检测的高性能石墨烯改性传感芯片

摘要

本协议描述了基于有用的纳米系统的低成本生物传感原型的制造，用于准确检测病毒蛋白（在 Fg 水平）。这种微型传感器平台允许与医疗物联网 （IoMT） 集成的护理点应用程序，以满足远程医疗目标。

摘要

该传感原型模型涉及开发一种可重复使用的双重氧化石墨烯 （GrO） 双数字间电容 （DIDC） 检测芯片，用于特异性和快速地检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 病毒 （SARS-CoV-2）。制造的 DIDC 包括一个含 Ti/Pt 的玻璃基板，上面有氧化石墨烯 （GrO） 釉料，该玻璃基板进一步用 EDC-NHS 进行化学修饰，以固定基于病毒刺突 （S1） 蛋白的对 SARS-CoV-2 敌对的抗体 （Abs）。深入的研究结果表明，GrO 为 Ab 固定提供了理想的工程表面，并增强了电容以实现更高的灵敏度和较低的感应限值。这些可调谐元件有助于实现宽感应范围（1.0 mg/mL 至 1.0 fg/mL）、1 fg/mL 的最小感应限、18.56 nF/g 的高响应性和良好的线性度，以及 3 秒的快速反应时间。此外，在开发经济上可行的即时 （POC） 检测框架方面，本研究中 GrO-DIDC 生物芯片的可重用性很好。值得注意的是，该生物芯片对血源性抗原具有特异性，在 5 °C 下可稳定保存长达 10 天。 由于其紧凑性，这种缩小的生物传感器有可能用于 COVID-19 感染的 POC 诊断。该系统还可以检测其他严重的病毒性疾病，尽管利用其他病毒示例的审批步骤正在开发中。

引言

2019 年底，中国武汉市出现了由新型 β 冠状病毒¹（即 2019-nCoV）引起的病毒大流行，后来被命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2）²（以下简称病毒），涉及肺炎聚集性和严重急性呼吸窘迫³.由于其全球人际传播速度快、感染率高、死亡率高以及危及生命的严重不良反应⁴，在大流行期间，病毒学研究⁵ 迅速发展，以确定病毒的基因组组织和结构 ^5,6。COVID-19 ^7,8 的症状包括高烧、干咳和全身疼痛⁹。重要的是，病毒的不同血清型导致不同的疾病严重程度¹⁰。此外，无症状携带者可能会传播病毒。通常，在显微镜下，COVID-19 病毒颗粒显示出由刺突蛋白形成的棒状突起¹¹。因此，为了控制这种新病原体的传播，必须及时有效地发现病例。因此，在病毒感染的早期阶段对病毒进行超灵敏、快速和选择性的检测变得至关重要 ^2,11。需要保持社交/身体距离以避免病毒传播¹²。卫生机构正在强调智能诊断工具和纳米系统的开发¹³.事实上，正如卫生机构所建议的那样，需要对^14,15 进行有针对性的大规模检测，并且仍然有需求。

原则上，与中东呼吸综合征相关冠状病毒 （MERS-CoV） ¹⁶ 和 SARS-CoV-1 一样，逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 等正在进行的生物诊断方法是大规模鉴定 SARS-CoV-2 的最佳方法¹⁷。在这种情况下，目前 SARS-CoV-2 污染的标准鉴定取决于感染特异性特征的增强^18,19。此外，应考虑 SARS-CoV-2 感染根据地区、年龄、种族和性别的变化。为了挽救生命的最终目标，构建用于即时护理 （POC） 的快速诊断工具^{至关重要20,21}。

在这种情况下，荧光原位杂交 （FISH）、蛋白质免疫吸附检查 （ELISA）、基于微球的方法、电化学测试以及 MRI、PET 和 NIRFOI²² 等常规策略对低病毒水平、低选择性和低重用容量具有低敏感性;此外，此类程序也有缺点，包括昂贵的生物传感诊断系统、不可重复使用的试剂以及需要高技能的劳动力²³。因此，这些有洞察力的技术不能被视为快速、合理、异常特异性或敏感的 POC 方法^24,25。值得注意的是，有不同种类的基于 DNA 和免疫器的生物传感器，它们利用化合物、电容和电技术 18,26,27,28。例如，已经生产了具有高响应性、可以简单地按比例缩小且可调的 ^29,30 的电 DNA 生物传感器，用于检测埃博拉³¹、寨卡病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和 SARS-CoV 32,33,34。同样，已经有效地创建了一种场效应半导体 （FET） 生物传感器，用于利用固定在石墨烯玻璃设备上的某些抗体（单克隆）来检测病毒的刺突蛋白^35,36。尽管如此，这种新策略的灵敏度低于 RT-PCR。此外，最近，已经开发了一种气溶胶射流纳米颗粒减少氧化石墨烯 （GrO） 覆盖的基于病毒的 3D 终端检测框架，其鉴定限较低（2.8 × ^10-15 M）;无论如何，所提出的复杂生物传感器结构³⁵ 已经针对 POC 的使用进行了测试，并与用于检测病毒 35,37,38 的其他现有生物传感器策略进行了比较。

在这项研究中，我们设计和制造了一个缩小且可重复使用的基于 GrO 的 DIDC 生物传感器，用于识别病毒刺突蛋白，而没有上述其他生物传感器的限制。该生物传感器允许在响应时间的 3 秒^18,27 内进行飞克 （fg） 级检测。为了完成这项研究，选择了 GrO 纳米薄片以获得更好的响应性和选择性，这意味着可以检测到来自口咽或鼻咽拭子的低浓度病毒抗原蛋白。GrO 是一种合适的、合成可靠的、一致的导电材料，可以有益地用于生物传感应用 2,39,40,41。此外，还使用了单克隆 IgG 抗体无标记杂交方法，专注于病毒刺突 S1 蛋白。制造的 SARS-CoV-2-GrO-DIDC 生物传感器在用食人鱼溶液进行深度处理和清洁后可重复使用。这种超快、灵敏、选择性、无标记和可重复使用的生物传感器可用于临床样本生物传感和个性化医疗保健应用 26,42,43,44。

研究方案

1. DIDC 传感芯片的清洁

1. 实验开始时，用食人鱼溶液（H₂SO₄：H₂O₂以 3：1 的比例）清洁 DIDC 芯片表面²⁶，并将其放在 80 °C 的热板上 15 分钟。接下来，使用移液管用蒸馏水逐滴冲洗传感器表面，以完全去除清洁试剂。为确保完全去除试剂，请用 4 到 5 滴乙醇冲洗表面。
   注意：DIDC 芯片是根据先前发布的报告²⁶ 制造的。
2. 然后，在室温下干燥传感器表面，以完全去除试剂，以获得亲水性传感器表面。该芯片可用于在芯片上进一步制造氧化石墨烯层（步骤 2）。
3. 用聚酰亚胺胶带覆盖干净的传感器芯片电极垫。

2. 在 DIDC 传感芯片上制造薄层氧化石墨烯

1. 将芯片水平放置在旋涂机的中心，并在芯片表面添加 4 μL 市售单层氧化石墨烯 （GO） 的水溶液（参见 材料表）。然后，关闭旋涂室，并以 1,300 rpm 的速度运行 2 分钟。
2. 对于制造的GO芯片的退火，将芯片在热板上水平放置40分钟，温度为80°C。

3. GO 玻璃 DIDC 传感芯片的交联和功能化

1. 用薄膜 GO 芯片对 N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC） 和 NHydroxysuccinimide （NHS） 进行交联。
   1. 向薄膜 GO 芯片中加入 4 μL（分别为 0.4 M 和 0.1 M）EDC-NHS（参见 材料表），以 通过 酰胺键形成产生胺和羧基的共价共轭²⁶。

4. 抗体制备和芯片固定化，用于蛋白质传感

1. 为了将功能化的 GO-DIDC 芯片与抗体结合，使用稀释缓冲液（含有 0.1% BSA [牛血清白蛋白] 和 0.86% NaCl 的 0.01 M PBS）溶解市售的抗 SARS-CoV-2 抗体（由兔单克隆抗体抗 S1 蛋白复制，参见 材料表）。
   1. 向 1 μg 纯化抗体中加入 1 mL 稀释的 PBS。然后，将 4 μL 抗体溶液滴注到交联活化的 GO-DIDC 芯片上。将芯片在密闭腔室中放置 2 小时，以在室温下将 Abs 结合到功能化的芯片表面。
      注：由于其极性，Abs 的 Fab 区通常由丰富的反应性胺和羧基组成²⁶;因此，随后的特异性固定会导致稳健的共价“尾部”Ab 特异性方向。
2. 在传感器表面完成抗体固定后，将 4 μL 牛血清白蛋白 （BSA） 滴注到芯片上，以阻断免疫电容传感芯片的非特异性位点。将芯片在室温下水平放置在密闭腔室中 20 分钟。
3. 用去离子水清洗免疫电容传感芯片，然后在室温下继续干燥。
   注：干燥后，基于 DIDC 的电容免疫传感器 （SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs） 即可进行病毒刺突抗原的连续检测。
4. 为了进一步感应病毒刺突蛋白，制备 1.0 mg 至 1.0 fg 的不同浓度以获得较宽的检测限。

结果

这里提出了一种使用氧化石墨烯釉面双叉指电容 （DIDC） 传感芯片传感 SARS-CoV-2 病毒的 S1 蛋白的方案。 图 1 显示了极其敏感且可回收的氧化石墨烯改性双叉指电容 （DIDC） 传感芯片的示意图（采用电路布局制造）。详细的逐步制造过程如图 2 所示。 图 3 显示了通过原子力显微镜 （AFM） 进行的 表...

讨论

为了打造基于芯片的高效 DIDC 生物传感器，DIDC 的电荷分布、电导率和介电常数非常重要。值得注意的是，这些检测边界的改进与 DIDC 18,26,27 的电容电抗有关。在这项研究中，制造了一种对病毒 Abs 敌对并通过 EDC-NHS 耦合在基于氧化石墨烯的 SiO₂衬底上功能化的电容免疫传感器²⁷

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amyloid β1-42 Protein	Merck (Sigma-Aldrich)	107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody	SinoBiological	40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]	Thermo Fisher Scientific	A35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)	Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tape			polyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)	Thermo Fisher Scientific	A39269
PBS
Prostate-specific antigen	Sigma-Aldrich	P3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant protein	SinoBiological	40591-V08H
Single layer Graphene Oxide	Graphene Supermarket
Spin Coater	High Precision Spin Coater (Spin Coating System)		ACE-200
Sulfuric acid (H2SO4)