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요약

현재 프로토콜은 바이러스 단백질(Fg 수준에서)을 정확하게 검출하기 위한 유용한 나노 시스템을 기반으로 하는 저비용 바이오센싱 프로토타입의 제작을 설명합니다. 이러한 소형 센서 플랫폼을 통해 IoMT(Internet of Medical Things)와 통합할 수 있는 현장 진료 애플리케이션을 통해 원격 의료 목표를 달성할 수 있습니다.

초록

이 감지 프로토타입 모델에는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 바이러스(SARS-CoV-2)를 특이적이고 신속하게 검출하기 위한 재사용 가능한 2중 산화그래핀(GrO) 유약 이중 디지털 정전식(DIDC) 검출 칩의 개발이 포함됩니다. 제작된 DIDC는 산화그래핀(GrO)으로 유약을 바른 Ti/Pt 함유 유리 기판으로 구성되며, 이는 EDC-NHS로 추가로 화학적으로 변형되어 바이러스의 스파이크(S1) 단백질을 기반으로 SARS-CoV-2에 적대적인 항체(Abs)를 고정시킵니다. 통찰력 있는 조사의 결과는 GrO가 Ab 고정을 위한 이상적인 엔지니어링 표면을 제공하고 커패시턴스를 향상시켜 더 높은 감도와 낮은 감지 한계를 허용한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 조정 가능한 소자는 넓은 감지 범위(1.0 mg/mL - 1.0 fg/mL), 1 fg/mL의 최소 감지 한계, 18.56 nF/g의 높은 응답성 및 우수한 선형성, 3초의 빠른 반응 시간을 달성하는 데 도움이 되었습니다. 또한, 재정적으로 실행 가능한 POC(Point-of-Care) 테스트 프레임워크 개발 측면에서 이 연구에서 GrO-DIDC 바이오칩의 재사용성은 우수합니다. 중요한 것은 바이오칩이 혈액 매개 항원에 특이적이며 5°C에서 최대 10일 동안 안정적이라는 것입니다. 이 축소된 바이오센서는 크기가 작기 때문에 COVID-19 감염에 대한 POC 진단에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 시스템은 다른 심각한 바이러스성 질병도 검출할 수 있지만, 다른 바이러스 사례를 활용하는 승인 단계가 개발 중입니다.

서문

2019년 말 중국 우한시에서 폐렴 클러스터와 중증 급성 호흡 곤란을 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)2(이하 주로 바이러스로 명명됨)로 명명된 새로운 베타 코로나바이러스1(즉, 2019-nCoV)에 의해 유발된 바이러스 대유행이 3. 전 세계적으로 빠른 인간 대 인간 전염, 높은 감염률, 높은 사망률, 생명을 위협하는 심각한 부작용4으로 인해 팬데믹 기간 동안 바이러스학 연구5는 바이러스의 게놈 조직과 구조를 규명하기 위해 빠르게 발전했습니다 5,6. 코로나19 7,8의 증상으로는 고열, 마른 기침, 전신 통증9 등이 있다. 중요한 것은 바이러스의 혈청형이 다르면 질병의 중증도가 달라진다는 것이다10. 또한 무증상 보균자는 잠재적으로 바이러스를 퍼뜨릴 수 있습니다. 일반적으로 현미경으로 보면 코로나19 바이러스 입자는 스파이크 단백질11에 의해 형성된 곤봉 모양의 돌기를 보여줍니다. 따라서 이 새로운 병원체의 확산을 통제하려면 사례를 적시에 효율적으로 감지해야 합니다. 따라서 바이러스 감염의 초기 단계에서 바이러스를 매우 민감하고 신속하며 선택적으로 검출하는 것이 매우 중요해졌습니다 2,11. 바이러스의 전염12을 피하기 위해 사회적/물리적 거리두기가 필요합니다. 보건 당국은 스마트 진단 도구와 나노 시스템의 개발을 강조하고 있다13. 실제로, 보건 당국이 제안한 바와 같이,14,15 건의 표적 및 대량 검사가 필요하며 여전히 수요가 있습니다.

원칙적으로, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)과 같은 지속적인 생물학적 진단 방법은 중동호흡기증후군 관련 코로나바이러스(MERS-CoV)16 및 SARS-CoV-117과 마찬가지로 SARS-CoV-2의 대량 식별을 위한 최선의 수단입니다. 이러한 맥락에서 SARS-CoV-2 오염의 현재 표준 식별은 감염 특이적 특성의 향상에 달려 있습니다18,19. 또한 지역, 연령, 인종 및 성별에 따른 SARS-CoV-2 감염의 다양성을 고려해야 합니다. 생명을 구하는 것을 궁극적인 목표로 하기 위해서는 현장 진료(POC)20,21 사용을 위한 빠른 진단 도구를 구축하는 것이 중요합니다.

이러한 맥락에서 FISH(Fluorescence in situ hybridization), ELISA(protein immunosorbent examination), 미세구 기반 방법, 전기화학 검사, MRI, PET, NIRFOI22와 같은 일반 전략은 낮은 바이러스 수준에 대한 민감도가 낮고 선택성이 낮으며 재사용 용량이 낮습니다. 또한, 이러한 절차는 비용이 많이 드는 바이오센싱 진단 시스템, 재사용이 불가능한 시약, 고도로 숙련된 인력에 대한 요구 사항 등의 단점이 있습니다23. 따라서 이러한 통찰력 있는 기법은 빠르거나, 합리적이거나, 매우 특이적이거나, 민감한 POC 방법으로 간주될 수 없습니다24,25. 참고로, 화합물, 정전 용량 및 전기 기술을 활용하는 다양한 종류의 DNA 및 면역 기반 바이오 센서가 있습니다18 , 26 , 27 , 28 . 예를 들어, 에볼라31, 지카, MERS-CoV 및 SARS-CoV 32,33,34의 검출을 위해 높은 반응성을 가지고 있으며 간단하게 축소할 수 있고 조정 가능한 29,30개의 전기 DNA 바이오센서가 생산되었습니다. 유사하게, 그래핀 유약 장치에 고정된 특정 항체(단클론)를 사용하여 바이러스의 스파이크 단백질을 검출하기 위한 전계 충격 반도체(FET) 바이오센서가 효과적으로 생성되었습니다35,36. 그럼에도 불구하고 이 새로운 전략은 RT-PCR보다 덜 민감합니다. 또한, 최근에는 바이러스에 대한 온에어로졸 제트 나노 입자 감소 산화 그래핀(GrO)으로 덮인 3D 터미널 기반 검출 프레임워크가 개발되었으며, 이는 식별 한계가 낮습니다(2.8 × 10-15M). 어쨌든, 제안된 복합 바이오센서 구조체(35)는 POC 사용과 관련하여 테스트되었으며 바이러스(35,37,38)의 검출을 위해 활용되는 다른 기존 바이오센서 전략과 비교되었습니다.

이 연구에서는 다른 바이오센서에 대해 위에서 설명한 제한 없이 바이러스 스파이크 단백질을 식별하기 위해 축소 및 재사용 가능한 GrO 기반 DIDC 바이오센서를 설계하고 제작했습니다. 이 바이오센서는 반응 시간의 3초18,27초 이내에 펨토그램(fg) 수준에서 검출할 수 있습니다. 이 연구를 수행하기 위해 GrO 나노플레이크를 선택하여 반응성과 선택성을 개선했으며, 이는 구인두 또는 비인두 면봉에서 바이러스 항원 단백질의 저농도를 검출할 수 있음을 의미합니다. GrO는 바이오센싱 응용 분야에 유용하게 활용될 수 있는 적절하고 합성적으로 신뢰할 수 있으며 일관되고 전도성이 높은 물질입니다 2,39,40,41. 또한 바이러스 스파이크 S1 단백질에 초점을 맞춘 단클론 IgG 항체 무표지 혼성화 접근법이 활용되었습니다. 제작된 SARS-CoV-2-GrO-DIDC 바이오센서는 피라냐 용액으로 고급 처리 및 세척 후 재사용할 수 있습니다. 이 초고속, 민감성, 선택적, 무표지 및 재사용 가능한 바이오센서는 임상 샘플 바이오센싱 및 맞춤형 의료 애플리케이션 26,42,43,44에 활용될 수 있습니다.

프로토콜

1. DIDC 센싱 칩 세척

  1. 실험 시작 시 DIDC 칩 표면26을 피라냐 용액(H2SO4:H2O23:1 비율)으로 세척하고 80°C의 핫 플레이트에 15분 동안 놓습니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 센서 표면을 증류수로 한 방울 한 방울 헹구어 세척 시약을 완전히 제거합니다. 시약이 완전히 제거되도록 하려면 에틸 알코올 4-5방울로 표면을 헹굽니다.
    참고: DIDC 칩은 이전에 발표된 보고서26에 따라 제작되었습니다.
  2. 그런 다음 시약을 완전히 제거하여 친수성 센서 표면을 얻기 위해 실온에서 센서 표면을 건조시킵니다. 이 칩은 칩에 그래핀 산화물 층을 추가로 제조하는 데 사용할 수 있습니다(단계 2).
  3. 깨끗한 센서 칩 전극 패드를 폴리이미드 테이프로 덮습니다.

2. DIDC 감지 칩에 산화 그래핀의 얇은 층 제작

  1. 스핀 코팅 기계의 중앙에 있는 칩을 수평 위치에 놓고 시판되는 단층 산화 그래핀(GO) 수용액 4μL( 재료 표 참조)를 칩 표면에 추가합니다. 그런 다음 스핀 코팅 챔버를 닫고 1,300rpm에서 2분 동안 실행합니다.
  2. 제작된 GO 칩의 어닐링을 위해 칩을 80°C에서 40분 동안 열판에 수평으로 유지하십시오.

3. GO-유약 DIDC 감지 칩의 가교 및 기능화

  1. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC) 및 NHydroxysuccinimide(NHS)를 박막 GO 칩과 가교합니다.
    1. 4μL(각각 0.4M 및 0.1M)의 EDC-NHS(재료 표 참조)를 박막 GO 칩에 추가하여 아미드 결합 형성26통해 아민 및 카르복실기의 공유 접합을 생성합니다.

4. 단백질 감지를 위한 칩에 항체 준비 및 고정화

  1. 기능화된 GO-DIDC 칩을 항체와 결합하기 위해 희석 완충액(0.1% BSA[소 혈청 알부민] 및 0.86% NaCl을 함유하는 0.01M PBS)을 사용하여 시판되는 항-SARS-CoV-2 Abs(토끼 mAb 항-S1 단백질에 의해 재현됨, 재료 표 참조)를 용해시킵니다.
    1. 정제된 항체 1μg에 희석된 PBS 1mL를 첨가합니다. 그런 다음 4μL의 항체 용액을 가교 결합된 활성화 GO-DIDC 칩에 떨어뜨립니다. 실온에서 기능화된 칩 표면에 Abs를 결합하기 위해 칩을 밀폐된 챔버에 2시간 동안 방치합니다.
      참고: Abs의 Fab 영역은 극성 특성으로 인해 일반적으로 풍부한 반응성 아민 및 카르복실기로 구성됩니다26; 그러므로, 후속 특이적 고정화는 강력한 공유 결합 "테일 온(tail-on)" Ab 특이적 배향으로 이어집니다.
  2. 센서 표면의 항체 고정화가 완료되면 4μL의 소 혈청 알부민(BSA)을 칩에 드롭캐스트하여 면역 용량성 감지 칩의 비특이적 부위를 차단합니다. 실온에서 20분 동안 밀폐된 챔버에 칩을 수평으로 놓습니다.
  3. 면역 정전식 감지 칩을 DI 워터로 세척한 다음 실온에서 계속 건조합니다.
    참고: 건조 후 DIDC 기반 정전식 면역 센서(SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDC)는 바이러스 스파이크 항원의 연속 검출을 수행할 준비가 되었습니다.
  4. 바이러스 스파이크 단백질을 추가로 감지하려면 1.0mg에서 1.0fg까지 다양한 농도를 준비하여 넓은 검출 한계를 얻습니다.

결과

여기에서는 그래핀 산화물 유약 DIDC(Double Inter-Digitated Capacitive) 감지 칩을 사용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 S1 단백질을 감지하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 그림 1 은 매우 민감하고 재활용 가능한 산화 그래핀 수정 DIDC(Double Interdigitated Capacitive) 감지 칩의 개략도(회로 레이아웃으로 제작)를 보여줍니다. 자세한 단계적 제조 공정은 그?...

토론

생산적인 DIDC 칩 기반 바이오센서를 만들기 위해서는 DIDC의 전하 분포, 전도도 및 유전 상수가 매우 중요합니다. 의미심장하게도, 이러한 검출 경계의 개선은 DIDC 18,26,27의 용량성 리액턴스와 관련이 있습니다. 본 연구에서는 바이러스 Abs에 적대적이고 그래핀 산화물-DIDC 기반SiO2기판(

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

본 연구는 교육부 후원으로 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구프로그램(2018R1D1A1A09083353)과 2018R1A6A1A03025242보조금, GCS그룹협회(GCS Group Association Ltd.), 2022년 한국환경부 대학원이 통합오염방지통제사업에 막대한 에너지를 투자하고 광운대학교 연구보조금을 지원받아 어느 정도 뒷받침되었다.

E.M.은 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering(5T32EB009035)의 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

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