JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает изготовление недорогих прототипов биосенсоров на основе полезных наносистем для точного обнаружения вирусных белков (на уровне Fg). Такая крошечная сенсорная платформа позволяет создавать приложения на местах оказания медицинской помощи, которые могут быть интегрированы с Интернетом медицинских вещей (IoMT) для решения задач телемедицины.

Аннотация

Эта модель сенсорного прототипа включает в себя разработку многоразового двухкомпонентного двузначного емкостного чипа (DIDC), покрытого оксидом графена (GrO), для специфического и быстрого обнаружения вируса коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2). Изготовленный DIDC состоит из содержащей Ti/Pt стеклянной подложки, покрытой оксидом графена (GrO), который далее химически модифицирован с помощью EDC-NHS для иммобилизации антител (Abs), враждебных SARS-CoV-2, на основе спайкового белка (S1) вируса. Результаты глубоких исследований показали, что GrO обеспечивает идеальную поверхность для иммобилизации Ab и увеличивает емкость, обеспечивая более высокую чувствительность и низкие пределы срабатывания. Эти перестраиваемые элементы помогли достичь широкого диапазона чувствительности (от 1,0 мг/мл до 1,0 фг/мл), минимального предела чувствительности 1 фг/мл, высокой чувствительности и хорошей линейности 18,56 нФ/г, а также короткого времени реакции 3 с. Кроме того, с точки зрения разработки финансово жизнеспособных структур тестирования в местах оказания медицинской помощи (POC), возможность повторного использования биочипа GrO-DIDC в этом исследовании хороша. Важно отметить, что биочип специфичен к антигенам, переносимым через кровь, и стабилен до 10 дней при 5 °C. Благодаря своей компактности, этот уменьшенный биосенсор обладает потенциалом для POC-диагностики инфекции COVID-19. Эта система может выявлять и другие тяжелые вирусные заболевания, хотя в настоящее время разрабатывается этап утверждения с использованием других примеров вирусов.

Введение

В конце 2019 года в городе Ухань, Китай, возникла вирусная пандемия, вызванная новым бета-коронавирусом1 (т.е. 2019-nCoV), который позже был назван коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)2 (далее преимущественно именуемым вирусом), включающая в себя легочный кластер и тяжелый острый респираторный дистресс3. В связи с быстрой передачей вируса от человека к человеку по всему миру, высоким уровнем инфицирования, высоким уровнем смертности и серьезными опасными для жизни побочными эффектами4 во время пандемии вирусологические исследования5 быстро развивались для определения геномной организации и структуры вируса 5,6. Симптомы COVID-19 7,8 включают высокую температуру, сухой кашель и генерализованную боль9. Важно отметить, что различные серотипы вируса приводят к различной степени тяжести заболевания10. Более того, бессимптомные носители потенциально могут распространять вирус. Обычно под микроскопом частицы вируса COVID-19 демонстрируют булавовидные выступы, образованные шиповидными белками11. Поэтому для контроля за распространением этого нового патогена выявление случаев заболевания должно быть своевременным и эффективным. Таким образом, сверхчувствительное, быстрое и избирательное выявление вируса на ранних стадиях вирусной инфекции приобрело решающее значение 2,11. Необходимо социальное/физическое дистанцирование, чтобы избежать передачи вируса12. Учреждения здравоохранения уделяют особое внимание разработке интеллектуальных диагностических средств и наносистем13. Действительно, как предлагают органы здравоохранения, целевое и массовое тестирование14,15 является обязательным и до сих пор востребованным.

В принципе, современные методы биологической диагностики, такие как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), являются наилучшими средствами массовой идентификации SARS-CoV-2, как в случае с коронавирусом, связанным с ближневосточным респираторным синдромом (MERS-CoV)16 и SARS-CoV-117. В этом контексте текущая стандартная идентификация заражения SARS-CoV-2 зависит от улучшения специфических для инфекции характеристик18,19. Кроме того, следует учитывать вариации инфекции SARS-CoV-2 в зависимости от региона, возраста, расы и пола. С конечной целью спасения жизней крайне важно создать инструменты быстрой диагностики для использования в местах оказания медицинской помощи (POC)20,21.

В этом контексте обычные стратегии, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), исследование белкового иммуносорбента (ИФА), методы на основе микросфер, электрохимические тесты, а также МРТ, ПЭТ и NIRFOI22, имеют низкую чувствительность к низким уровням вируса, низкую селективность и низкую способность к повторному использованию; Кроме того, такие процедуры имеют недостатки, в том числе дорогостоящие диагностические системы с биосенсорным управлением, реагенты, не подлежащие повторному использованию, и потребность в высококвалифицированной рабочей силе. Таким образом, эти проницательные методы нельзя рассматривать как быстрые, разумные, исключительно специфичные или чувствительные методы POC24,25. Следует отметить, что существуют различные виды биосенсоров на основе ДНК и иммунизаторов, в которых используются составные, емкостные и электрические методы 18,26,27,28. Например, электрические биосенсоры ДНК, которые обладают высокой отзывчивостью, могут быть легко уменьшены и могут быть перестраиваемы29,30, были созданы для обнаружения вирусов Эбола31, Зика, MERS-CoV и SARS-CoV32,33,34. Аналогичным образом, был эффективно создан полевой полупроводниковый (FET) биосенсор для обнаружения шиповидного белка вируса с использованием определенных антител (моноклональных), иммобилизованных на устройствах, покрытых графеновой глазурью35,36. Тем не менее, эта новая стратегия менее чувствительна, чем ОТ-ПЦР. Кроме того, совсем недавно была разработана покрытая аэрозольными струями наночастицами оксида графена (GrO) 3D-терминальная структура детектирования вируса, которая имеет низкий предел идентификации (2,8 × 10−15 М); В любом случае, предложенная сложная структура биосенсора35 была протестирована с точки зрения использования POC и сравнена с другими существующими биосенсорными стратегиями, которые используются для обнаружения вируса 35,37,38.

В этом исследовании мы разработали и изготовили уменьшенный и многоразовый биосенсор DIDC на основе GrO для идентификации шиповидного белка вируса без ограничений, описанных выше для других биосенсоров. Этот биосенсор позволяет проводить детектирование на уровне фемтограммы (fg) в течение 3 с18,27 времени отклика. Для проведения этого исследования были выбраны нанохлопья GrO из-за лучшей чувствительности и селективности, что означает, что могут быть обнаружены низкие концентрации белка антигена вируса из мазков из ротоглотки или носоглотки. GrO является подходящим, синтетически надежным, стабильным и проводящим материалом, который может быть с выгодой использован для биосенсорных приложений 2,39,40,41. Кроме того, был использован подход к гибридизации моноклональных антител IgG без меток, при этом основное внимание уделялось белку S1 вирусного шипа. Изготовленный биосенсор SARS-CoV-2-GrO-DIDC можно использовать повторно после расширенной обработки и очистки раствором пираньи. Этот сверхбыстрый, чувствительный, селективный, не требующий меток и многоразовый биосенсор может быть использован для биосенсоризации клинических образцов и персонализированных приложений в здравоохранении 26,42,43,44.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Очистка чувствительного чипа DIDC

  1. В начале эксперимента очистите поверхность чипа26 DIDC раствором пираньи (H2SO4:H2O2в соотношении 3:1) и поместите ее на горячую плиту при температуре 80 °C на 15 минут. Затем промойте поверхность датчика дистиллированной водой по капле с помощью пипетки, чтобы полностью удалить чистящие реагенты. Чтобы обеспечить полное удаление реагента, промойте поверхность четырьмя-пятью каплями этилового спирта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микросхема DIDC была изготовлена в соответствии с ранее опубликованным отчетом26.
  2. Затем высушите поверхность сенсора при комнатной температуре для полного удаления реагентов и получения гидрофильной поверхности сенсора. Этот чип может быть использован для дальнейшего изготовления слоя оксида графена на чипе (шаг 2).
  3. Накройте чистые электродные прокладки чипа датчика полиимидной лентой.

2. Изготовление тонкого слоя оксида графена на сенсорной микросхеме DIDC

  1. Поместите чип в центр машины для нанесения покрытий в горизонтальном положении и добавьте 4 мкл водного раствора коммерчески доступного однослойного оксида графена (GO) (см. Таблицу материалов) на поверхность чипа. Затем закройте камеру отжима покрытия и работайте в течение 2 минут со скоростью 1 300 об/мин.
  2. Для отжига изготовленной стружки GO держите стружку на горячей плите горизонтально в течение 40 минут при температуре 80 °C.

3. Сшивание и функционализация сенсорного чипа GO-глазурованного DIDC

  1. Выполните сшивание N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорида (EDC) и NHydroxysuccinimide (NHS) с помощью тонкопленочного чипа GO.
    1. Добавьте 4 мкл (0,4 М и 0,1 М, соответственно) EDC-NHS (см. Таблицу материалов) в тонкопленочный чип GO для получения ковалентного сопряжения аминных и карбоновых групп путем образования амидных связей26.

4. Получение антител и иммобилизация на чипе для чувствительности к белку

  1. Для связывания функционализированного чипа GO-DIDC с антителом растворяют коммерчески доступные анти-SARS-CoV-2 Abs (воспроизводимые кроличьим белком mAb anti-S1, см. Таблицу материалов) с помощью разбавляющего буфера (0,01 M PBS, содержащего 0,1% BSA [бычьего сывороточного альбумина] и 0,86% NaCl).
    1. К 1 мкг очищенного антитела добавьте 1 мл разведенного PBS. Затем капните 4 мкл раствора антитела на сшитый активированный чип GO-DIDC. Оставьте чип в закрытой камере на 2 часа, чтобы привязать Abs к функционализированной поверхности чипа при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Область Fab Abs обычно состоит из большого количества реакционноспособных аминных и карбоксильных групп из-за своей полярной природы26; таким образом, последующая специфическая иммобилизация приводит к устойчивой ковалентной «хвостовой» Ab-специфической ориентации.
  2. После того, как иммобилизация антител на поверхности сенсора завершена, капните 4 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) на чип, чтобы блокировать неспецифические участки иммуноемкостного чувствительного чипа. Поместите чип горизонтально в закрытую камеру на 20 минут при комнатной температуре.
  3. Промойте иммуноемкостный сенсорный чип деионизионной водой, а затем продолжайте сушить при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сушки емкостный иммуносенсор на основе DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs) готов к выполнению серийного обнаружения спайкового антигена вируса.
  4. Для дальнейшего зондирования спайкового белка вируса готовят различные концентрации от 1,0 мг до 1,0 fg для получения широкого предела обнаружения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В данной работе представлен протокол для зондирования белка S1 вируса SARS-CoV-2 с помощью двойного интердигитального емкостного сенсорного чипа (DIDC), покрытого оксидом графена. На рисунке 1 показано схематическое изображение (изготовление с компоновкой с?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Для создания производительного биосенсора на основе чипа DIDC чрезвычайно важны распределение заряда, проводимость и диэлектрическая проницаемость DIDC. Важно отметить, что улучшения в этих границах детектирования связаны с емкостным реактивным сопротивлением DIDC 18,26,27...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была в некоторой степени поддержана Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), спонсируемой Министерством образования в рамках гранта 2018R1D1A1A09083353 и гранта 2018R1A6A1A03025242, в некоторой степени Ассоциацией GCS Group Ltd., а также Высшей школой Министерства окружающей среды Кореи (MOE) в 2022 году она вложила огромные усилия в проект комплексного предотвращения и контроля загрязнения и исследовательский грант Университета Квангун.

Э.М. выражает благодарность за поддержку со стороны Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии (5T32EB009035).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid β1-42 ProteinMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) monoclonal IgG antibody SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride]Thermo Fisher ScientificA35391
Ethyl alcohol (C2H5OH)Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide (H2O2)
Kapton tapepolyimide tape
NHS (NHydroxysuccinimide, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS
Prostate-specific antigen Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His recombinant proteinSinoBiological40591-V08H
Single layer Graphene OxideGraphene Supermarket
Spin CoaterHigh Precision Spin Coater (Spin Coating System)ACE-200 
Sulfuric acid (H2SO4)

Ссылки

  1. Boldog, P. Risk assessment of novel coronavirus COVID-19 outbreaks outside China. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 571-583 (2020).
  2. Seo, G., et al. Rapid detection of COVID-19 causative virus (SARS-CoV-2) in human nasopharyngeal swab specimens using field-effect transistor-based biosensor. ACS Nano. 14 (4), 5135-5142 (2020).
  3. Panda, P. K. Structure-based drug designing and immunoinformatics approach for SARS-CoV-2. Science Advances. 6, 5135-5142 (2020).
  4. Li, R., et al. Substantial undocumented infection facilitates the rapid dissemination of novel coronavirus (SARS-CoV-2). Science Advances. 368, 489-493 (2020).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Hui, D. S. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health - The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China. Journal of Infectious Diseases. 91, 264-266 (2020).
  7. Chen, I. Y., et al. Upregulation of the chemokine (C-C motif) ligand 2 via a severe acute respiratory syndrome coronavirus spike-ACE2 signaling pathway. Journal of Virology. 84 (15), 7703-7712 (2010).
  8. Fung, T. S., Huang, M., Liu, D. X. Coronavirus-induced ER stress response and its involvement in regulation of coronavirus-host interactions. Virus Research. 194, 110-123 (2014).
  9. Park, S. E. Epidemiology, virology, and clinical features of severe acute respiratory syndrome -coronavirus-2 (SARS-CoV-2: Coronavirus Disease-19). Korean Journal of Pediatrics. 63 (4), 119-124 (2020).
  10. Fajnzylber, J., et al. SARS-CoV-2 viral load is associated with increased disease severity and mortality. Nature Communications. 11 (1), 5493(2020).
  11. Rao, K., et al. Review on newly identified coronavirus and its genomic organization. SSR Institute of International Journal of Life Sciences. 6 (2), 2509(2020).
  12. Mujawar, M. A., et al. Nano-enabled biosensing systems for intelligent healthcare: Towards COVID-19 management. Materials Today Chemistry. 17, 100306(2020).
  13. Manickam, P., et al. Artificial intelligence (AI) and internet of medical things (IoMT) assisted biomedical systems for intelligent healthcare. Biosensors. 12 (8), 562-591 (2022).
  14. Kaushik, A. K., et al. Electrochemical SARS-CoV-2 sensing at point-of-care and artificial intelligence for intelligent COVID-19 management. ACS Applied Bio Materials. 3 (11), 7306-7325 (2020).
  15. Lee, D., Lee, J. Testing on the move: South Korea's rapid response to the COVID-19 pandemic. Transportation Research Interdisciplinary Perspectives. 5, 100111(2020).
  16. Emery, S. L., et al. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay for SARS-associated coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 10 (2), 311-316 (2004).
  17. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 52 (1), 67-75 (2014).
  18. Mishra, S., et al. Tailored biofunctionalized biosensor for the label-free sensing of prostate-specific antigen. ACS Applied Bio Materials. 3 (11), 7821-7830 (2020).
  19. Wang, Y. L., et al. Detection of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus nucleocapsid protein using AlGaN/GaN high electron mobility transistors. ECS Transactions. 50 (6), 239-243 (2013).
  20. Ravi, N., Cortade, D. L., Ng, E., Wang, S. X. Diagnostics for SARS-CoV-2 detection: A comprehensive review of the FDA-EUA COVID-19 testing landscape. Biosensors and Bioelectronics. 165, 112454(2020).
  21. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323, 2249-2251 (2020).
  22. Timmer, W. C., Villalobos, J. M. Chemistry Education. 70 (4), 273-280 (1993).
  23. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (5), 368-373 (2006).
  24. Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21, 1192-1199 (2003).
  25. Singhal, C., Khanuja, M., Chaudhary, N., Pundir, C. S., Narang, J. Detection of chikungunya virus DNA using two-dimensional MoS2 nanosheets based disposable biosensor. Scientific Reports. 8, 7734(2018).
  26. Sharma, P. K., et al. Ultrasensitive and reusable graphene oxide-modified double-interdigitated capacitive (DIDC) sensing chip for detecting SARS-CoV-2. ACS Sensors. 6 (9), 3468-3476 (2021).
  27. Sharma, P. K., et al. Ultrasensitive probeless capacitive biosensor for amyloid beta (Ab) detection in human plasma using interdigitated electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 212, 114365(2022).
  28. Wang, L., et al. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 87, 646-653 (2017).
  29. Brasil, P., et al. Zika virus infection in pregnant women in Rio de Janeiro. The New England Journal of Medicine. 375 (24), 2321-2334 (2016).
  30. Kong, J., et al. Molecular wires as chemical sensors. Science. 287 (5453), 622-625 (2000).
  31. Wang, J. Carbon-nanotube based electrochemical biosensors: A review. Electroanalysis. 17 (1), 7-14 (2005).
  32. Layqah, L. A., Eissa, S. An electrochemical immunosensor for the coronavirus associated with the Middle East respiratory syndrome using an array of gold nanoparticle-modified carbon electrodes. Microchimica Acta. 186 (4), 224-234 (2019).
  33. Vermisoglou, E., et al. Human virus detection with graphene-based materials. Biosensors and Bioelectronics. 166, 112436(2020).
  34. Mostafavi, E., Dubey, A. K., Teodori, L., Ramakrishna, S., Kaushik, A. SARS-CoV-2 Oomicron variant: A next phase of the COVID-19 pandemic and a call to arms for system sciences and precision medicine. MedComm. 3 (1), 119(2022).
  35. Ali, M. A., et al. Sensing of COVID-19 antibodies in seconds via aerosol jet printed three dimensional electrodes. Advanced Materials. 33 (7), 2006647(2020).
  36. Ganbold, E., Sharma, P. K., Kim, E. -S., Lee, D. -N., Kim, N. -Y. Capacitive humidity sensor with a rapid response time on a GO-doped P(VDF-TrFE)/LiCl composite for noncontact sensing applications. Chemosensors. 11 (2), 122(2023).
  37. Shivani, T., et al. Antibacterial and antiviral high-performance nanosystems to mitigate new SARS-CoV-2 variants of concern. Current Opinion in Biomedical Engineering. 21, 100363(2022).
  38. Kujawska, M., Mostafavi, E., Kaushik, A. SARS-CoV-2 getting into the brain; Neurological phenotype of COVID-19, and management by nano-biotechnology. Neural Regeneration Research. 18 (3), 519-520 (2022).
  39. Kang, P., Wang, M. C., Nam, S. Bioelectronics with two-dimensional materials. Microelectronic Engineering. 161, 18-35 (2016).
  40. Syama, S., Mohanan, P. V. Comprehensive application of graphene: Emphasis on biomedical concerns. Nano-Micro Letters. 11, 6(2019).
  41. Chaudhary, V., Kaushik, A., Furukawa, H., Khosla, A. Review-Towards 5th generation AI and IoT driven sustainable intelligent sensors based on 2D MXenes and borophene. ECS Sensors Plus. 1, 013601(2022).
  42. Sharma, P. K., et al. Perspectives on 2D-borophene flatland for smart bio-sensing. Materials Letters. 308, https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012818154600010X 131089(2022).
  43. Sharma, P. K., et al. Nanotechnology and its application: A review. Nanotechnology in Cancer Management. Precise Diagnostics Toward Personalized Health Care. Khondakar, K. R., Kaushik, A. K. 1 (1), Elsevier Science. 1-33 (2021).
  44. Rawat, P., et al. Emergence of high-performing and ultra-fast 2D-graphene nano-biosensing system. Materials Letters. 308, 131241(2022).
  45. Ganbold, E., et al. Highly sensitive interdigitated capacitive humidity sensors based on sponge-like nanoporous PVDF/LiCl composite for real-time monitoring. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (3), 4559-4568 (2023).
  46. Feng, J., Guo, Z. Wettability of graphene: From influencing factors and reversible conversions to potential applications. Nanoscale Horizons. 4, 339-364 (2019).
  47. Flynn, S. P., et al. qua-Art: A demonstration of hydrophilic and hydrophobic surfaces fabricated by plasma enhanced chemical vapor deposition. Chemical Education. 94 (2), 221-225 (2017).
  48. Bhardwaj, S. K., Yadav, P., Ghosh, S., Basu, T., Mahapatro, A. K. Biosensing test-bed using electrochemically deposited reduced graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (37), 24350-24360 (2016).
  49. Reddicherla, U., Seyed, M. G., Sonwal, S., Gokana, M. R., Yun, S. H. Portable electrochemical sensing methodologies for on-site detection of pesticide residues in fruits and vegetables. Coordination Chemistry Reviews. 453, 214305(2022).
  50. Reddicherla, U., et al. Colorimetric based on-site sensing strategies for the rapid detection of pesticides in agricultural foods: New horizons, perspectives, and challenges. Coordination Chemistry Reviews. 446, 214061(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

SARS CoV 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены