中枢神経系および末梢神経系マウスの全解剖

要約

ここでは、マウスの中枢神経系と末梢神経系の解剖を完了するためのプロトコルを紹介します。解剖された組織は、肉眼的写真の撮影や組織学などの下流アプリケーションでさらに分析されます。

要約

動物モデルは、神経科学分野の主力製品です。それにもかかわらず、今日では、完全なげっ歯類の神経系を解剖するための段階的なプロトコルはまだなく、自由に利用できるそれを表す完全な概略図もありません。脳、脊髄、特定の後根神経節、および坐骨神経(別々に)を採取する方法のみが利用可能です。ここでは、マウスの中枢神経系と末梢神経系の詳細な写真と概略図を提供します。さらに重要なことは、その解剖を実行するための堅牢な手順を概説することです。30分間の解剖前ステップにより、内臓や皮膚のない筋肉で椎骨内の無傷の神経系を分離することができます。その後、2〜4時間の解剖を顕微鏡顕微鏡で行い、脊髄と胸部神経を露出させ、最後に中枢神経系と末梢神経系全体を死体から剥がします。このプロトコルは、世界中の神経系の解剖学と病態生理学を研究する上で大きな前進を表しています。例えば、神経線維腫症I型マウスモデルから解剖された後根神経節は、腫瘍進行の変化を解明するための組織学のためにさらに処理することができる。

概要

この方法の全体的な目標は、マウスの中枢神経系と末梢神経系を一体に分離することです。現在、げっ歯類の神経系全体を解剖して地球規模で研究するプロトコルはありません。神経科学者は通常、坐骨神経を任意の末梢神経1の代理として用い、L3からL5の神経節²を任意の神経節の代理として用いる。これらの方法を使用しても、結果が特定の神経/神経節に特異的であるかどうかを結論付けることは不可能です。少なくともいくつかの神経病理がすべての神経と神経^{節に等しく}影響を与えるわけではないことが知られているため^3,4,5、¹つは、それをグローバルに研究するために完全なげっ歯類の神経系の分離を可能にする技術を開発する必要があります。

長年にわたり、私たちはマウスの中枢神経系と末梢神経系を完全に解剖する方法を開発し、改良してきました。最初のステップは、基本的に、顕微鏡解剖顕微鏡下でのマイクロ解剖ステップに備えて、マウスの肉眼的解剖です。ステップ2から4では、脊髄と胸神経を露出させ、脳を解剖し、死体から脊髄全体と末梢神経を剥がします。

この方法は、イメージングまたは組織学と組み合わせて、巨視的または微視的な変化6,7,8,9を記録すると強力です。地球規模の変化を調査したり、仮説に基づかない実験を行ったりすることに関心のある神経科学者は、この方法を使用して地球の神経系を調査する必要があります。

プロトコル

この研究で使用されたプロトコルは、カナダの動物ケア評議会の認定機関である Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke によって承認されています。

1. マイクロダイセクションの準備(プレダイセクション)

1. 5%イソフルランで麻酔を行い、続いて2%イソフルランと10psiのCO₂ でバイタルサインがなくなるまで安楽死を行います。
   注:頸椎脱臼は、脊髄と頸神経節を損傷するため、行わないでください。
2. 安楽死させたマウスを上向き(正面図)にして解剖パッドに置き、毛皮に70%エタノールをスプレーします。
3. 次に、解剖中にマウスを所定の位置に保持するために、4つの小径ピンを使用して上肢と下肢を固定します。
4. 手術用ハサミを使用して、下腹部から喉にかけて皮膚を切り開きます。
5. 皮膚を剥がして内臓を露出させ、腹腔を露出させながら両側の皮膚を維持するために追加のピンを使用します。
6. 胸郭を切開して、心臓と肺を露出させます。
7. 標準的な解剖学的鉗子のペアを使用して、食道と気管をつかみ、鉗子のすぐ上をカットします。
8. 次に、頭蓋から尾へのアプローチですべての内臓を剥がし始めます。これを行うには、脊柱に沿って横隔膜を切断して、すべての内臓を1つに取り外します。
9. マウスのピンを外し、シンクで腹腔から余分なマウスの血液を洗い流します。
10. マウスを下向きに置きます(背面図)。上肢と下肢をピンで固定し、解剖中にマウスを所定の位置に保持するために4本のピンを使用します。
11. 手術用ハサミを使用して、頭から後肢までの皮膚をはがします。
12. 左の坐骨神経(下肢)を露出させます。
    1. 左下肢の下部の筋肉を切り開きます。
    2. 坐骨神経の周りの筋肉を取り除くことにより、坐骨神経を見つけて露出させます。
    3. 坐骨神経を顎骨神経、脛骨神経、腓骨神経の枝分かれ部で慎重に切断し、血管を温存します。
    4. 標準的な解剖学的鉗子と極細のボンハサミを使用して、脊柱と平行になり、約2cmの自由神経が残るまで、坐骨神経を分離し続けます。
    5. 手術用ハサミを脊髄と平行に挿入し、股関節をカットします。
    6. 指を使って仙骨と大腿骨を引き離して股関節を脱臼します。
       注:このプロセス中に、混乱を避けるために、鉗子を使用して坐骨神経を優しく引っ張るために頻繁に停止する必要があります。
    7. 最後に、マウスの死骸から後肢を繊細に引き裂き、長さ約4cmの坐骨神経を残します。
       注:このプロセスでは、L2神経の位置を特定し、L2の損傷を避けるために後肢からそれを引き出します。右側について手順1.12を繰り返します。
13. 上腕神経(上肢)を露出させます。
    1. マウスの死骸を平らな面(解剖パッド)ではなく、手で操作します。
    2. 左脇の下の脂肪と筋肉をからかって、左腕神経叢を特定します。
    3. 位置を特定したら、主要な腕神経叢の枝分かれ (放射状、腋窩、肩甲骨上) と尺骨の周りのそれらの副枝分かれを極細のボンハサミで切断し、約 1.5 cm の自由神経を残します。左上肢から神経叢をそっと剥がします。
    4. 左上肢を脱臼します。神経がないことを確認してください。右側について手順1.13を繰り返します。
14. 脳を露出させます。
    1. 次に、マウスを上に向けて置きます(正面図)
    2. 極細のボンハサミの刃を1枚口に挿入し、下顎骨を喉に切り込みます。
    3. 頬から喉にかけてさらに切開して下顎骨を取り除きます。
    4. 次に、片方の耳からもう片方の耳に通る頭蓋骨を切断します。
       注:深く入り込みすぎて脳に損傷を与えないように注意してください。
    5. 口蓋骨と鼻骨を切って取り除き、頭蓋骨を開きます。
    6. 頭蓋骨の基部でC1椎骨を切断し、小脳と脊髄の始まりを解放します。
    7. 最後に、頭蓋骨を目まで横方向に切り取り、頭蓋骨の破片を取り除き、脳を露出させます。
       注:神経が剥がれるまで、脳を空洞に保持します。
15. 枝肉から余分な脂肪や筋肉を取り除きます。死体を10%ホルマリンに室温(RT)で15分間置き、続いて固定臭がなくなるまで1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を短時間洗浄し、次のステップに進みます。
    注:今後2週間以内に神経系を解剖する場合は、PBSで4°Cで保存してください。それ以外の場合は、10%ホルマリンで無期限に保管してください。ホルマリンを操作するときは、常にケミカルフードを使用してください。

2. 脊髄への露出

1. 脊髄を露出させるには、頭蓋から尾へのアプローチを使用します。各椎骨とその上の筋肉層を取り除くには、Vannasスプリングハサミを使用して、腹側の10時位置と2時位置でカットします。デュモンミニ鉗子を使用して椎骨を削り取ります。このプロセスを頸椎と胸椎を通して続けます。
2. 腰椎部分については、椎骨の両側の横突起をカットします。次に、2時位置と10時位置で、ヴァンナスのスプリングハサミの刃を脊柱管に挿入してカットします。骨に付着している神経に注意を払いながら、組織を取り除きます。
3. 尾側についても同様に進めます。

3. 胸神経への曝露

1. 死体を解剖顕微鏡の下に置き、前面を視覚化します。
2. Vannasスプリングハサミを使用して、各肋骨(胸骨から下肢まで)に沿って切り込み、末梢神経を露出させます。
3. 次に、神経節の両側(横方向)の椎骨を切開して、神経節を露出させます。

4. 末梢神経の剥離

1. 脊髄を剥がし、さらに末梢神経を抜くには、デュモンミニ鉗子を使って脊髄を優しく転がし、脊髄の尾側部分から神経を1つずつ引き出します。
   注:剥がす前に、RTで10%ホルマリンで15分間追加の固定を行い、その後、ステップ1.15で行ったように、固定臭がなくなるまで1x PBS洗浄を短時間行うことができます。
2. 胸部は、神経を90°の角度(脊髄に対して垂直)に引っ張ります。
3. 腕神経叢の場合は、神経の隣の椎骨を切って、神経のためのスペースを確保します。
   注:腕神経叢は、胸部のように椎骨の下を通過することはできません。
4. 余分な筋肉を取り除き、神経をすっきりさせます。
5. PBSで4°Cで最大2週間、またはRTで10%ホルマリンで無期限に保管してください。

結果

げっ歯類は、神経系の生物学と病態生理学の理解に役立ってきました¹⁰。興味深いことに、げっ歯類の中枢神経系と末梢神経系を完全に解剖して、リアルタイムモデル^1,2,11の解剖学的および病理学的変動を評価する方法はありません。図1は、ステップ1から?...

ディスカッション

筋肉や神経が乾燥するのを防ぐために、死骸は10分ごとにPBSに浸す必要があります。下肢を脱臼するとき(ステップ1.12.6)、坐骨神経叢とL2を常に視界に入れて、損傷や引き裂きを防ぐことが重要です。脳を解剖するとき(ステップ1.14.4)、脳を傷つけないように深く入りすぎないようにすることが重要です。一般的に後根神経節と末梢神経を解剖するときは、神経構造の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124