Dissezione dei topi dell'intero sistema nervoso centrale e periferico

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per completare la dissezione del sistema nervoso centrale e periferico dei topi. I tessuti sezionati vengono ulteriormente analizzati in applicazioni a valle, come scattare foto grossolane o istologia.

Abstract

I modelli animali rappresentano il cavallo di battaglia nel campo delle neuroscienze. Nonostante ciò, oggi, non esiste ancora un protocollo passo-passo per sezionare un sistema nervoso completo di roditori, né esiste uno schema completo che lo rappresenti che sia liberamente disponibile. Sono disponibili solo metodi per prelevare il cervello, il midollo spinale, uno specifico ganglio della radice dorsale e il nervo sciatico (separatamente). Qui forniamo immagini dettagliate e uno schema del sistema nervoso murino centrale e periferico. Ancora più importante, delineiamo una procedura robusta per eseguire la sua dissezione. La fase di pre-dissezione di 30 minuti consente di isolare il sistema nervoso intatto all'interno della vertebra con i muscoli liberi da visceri e pelle. Segue una dissezione di 2-4 ore al microscopio per microdissezione per esporre il midollo spinale e i nervi toracici e infine staccare l'intero sistema nervoso centrale e periferico dalla carcassa. Questo protocollo rappresenta un significativo passo avanti nello studio dell'anatomia e della fisiopatologia del sistema nervoso a livello globale. Ad esempio, i gangli della radice dorsale sezionati da un modello di topi di neurofibromatosi di tipo I possono essere ulteriormente elaborati per l'istologia per svelare i cambiamenti nella progressione del tumore.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare il sistema nervoso centrale e periferico di un topo in un unico pezzo. Attualmente non esiste un protocollo per sezionare l'intero sistema nervoso di un roditore per studiarlo a livello globale. I neuroscienziati in genere usano il nervo sciatico come surrogato di qualsiasi nervo periferico¹ e i gangli da L3 a L5² come surrogato di qualsiasi ganglio. Utilizzando questi metodi, è impossibile concludere se i risultati sono specifici per il particolare nervo/ganglio. Poiché è noto che almeno alcune patologie nervose non colpiscono tutti i nervi e i gangli allo stesso modo ^3,4,5, è necessario sviluppare una tecnica che consenta l'isolamento dell'intero sistema nervoso dei roditori per studiarlo globalmente.

Nel corso degli anni, abbiamo sviluppato e perfezionato un metodo per sezionare l'intero sistema nervoso centrale e periferico dei topi. La prima fase è essenzialmente una dissezione grossolana dei topi in preparazione per le fasi di micro-dissezione al microscopio di dissezione. Nelle fasi da 2 a 4, il midollo spinale e i nervi toracici vengono esposti, il cervello viene sezionato e l'intero midollo spinale e i nervi periferici vengono staccati dalla carcassa.

Questo metodo è potente se accoppiato all'imaging o all'istologia per documentare qualsiasi cambiamento macroscopico o microscopico 6,7,8,9. I neuroscienziati interessati a esaminare il cambiamento globale o a condurre esperimenti non basati su ipotesi dovrebbero utilizzare questo metodo per esaminare il sistema nervoso globale.

Protocollo

I protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dal Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, un istituto certificato dal Canadian Council on animal care.

1. Preparazione per la micro-dissezione (pre-dissezione)

1. Eseguire l'anestesia con isoflurano al 5%, seguita dall'eutanasia con isoflurano al 2% e 10 psi di CO₂ fino a quando non ci sono segni vitali.
   NOTA: Non eseguire la lussazione cervicale, poiché ciò danneggia il midollo spinale e i gangli cervicali.
2. Posiziona il topo soppresso rivolto verso l'alto (vista anteriore) su un tampone di dissezione e spruzza la pelliccia con etanolo al 70%.
3. Quindi, appunta gli arti superiori e inferiori, utilizzando quattro perni di piccolo diametro per tenere il mouse in posizione durante la dissezione.
4. Usando le forbici chirurgiche, taglia la pelle dal basso addome alla gola.
5. Staccare la pelle per esporre gli organi interni e utilizzare spilli aggiuntivi per mantenere la pelle su ciascun lato mentre si espone la cavità addominale.
6. Tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore e i polmoni.
7. Usando un paio di pinze anatomiche standard, afferra l'esofago e la trachea e taglia appena sopra la pinza.
8. Quindi, inizia a staccare tutti gli organi interni in un approccio craniale a caudale. Per fare ciò, tagliare il diaframma lungo la colonna vertebrale per rimuovere tutti gli organi interni in un unico pezzo.
9. Sganciare il topo e sciacquare il sangue di topo in eccesso dalla cavità addominale in un lavandino.
10. Posizionare il mouse a faccia in giù (vista posteriore). Bloccare gli arti superiori e inferiori, utilizzando quattro perni per tenere il mouse in posizione durante la dissezione.
11. Usando le forbici chirurgiche, staccare la pelle dalla testa agli arti posteriori.
12. Esporre il nervo sciatico sinistro (arto inferiore).
    1. Taglia i muscoli aperti nella parte inferiore dell'arto inferiore sinistro.
    2. Individua ed esponi il nervo sciatico rimuovendo il muscolo attorno ad esso.
    3. Tagliare con cura il nervo sciatico in corrispondenza delle ramificazioni del nervo surale, tibiale e peroneo e risparmiare i vasi sanguigni.
    4. Continuare ad isolare il nervo sciatico utilizzando pinze anatomiche standard e forbici di Bonn extra fini, fino a quando non diventa parallelo alla colonna vertebrale, lasciando un nervo libero di circa 2 cm.
    5. Inserire le forbici chirurgiche parallelamente al midollo spinale e tagliare l'anca.
    6. Lussare l'anca separando l'osso sacro e il femore con le dita.
       NOTA: Durante questo processo, è necessario fermarsi frequentemente per tirare delicatamente il nervo sciatico usando una pinza per evitare interruzioni.
    7. Alla fine, strappare delicatamente l'arto posteriore dalla carcassa del topo, lasciando un nervo sciatico di circa 4 cm di lunghezza.
       NOTA: Durante questo processo, individuare il nervo L2 e tirarlo fuori dall'arto posteriore per evitare danni all'L2. Ripetere il passaggio 1.12 per il lato destro.
13. Esporre i nervi brachiali (arti superiori).
    1. Manipolare la carcassa del mouse con le mani, piuttosto che su una superficie piana (tampone di dissezione).
    2. Individua il plesso brachiale sinistro separando il grasso e i muscoli dell'ascella sinistra.
    3. Una volta localizzate, tagliare le principali ramificazioni del plesso brachiale (radialmente, ascellare, soprascapolare) e le loro sotto-ramificazioni attorno all'ulna con forbici Bonn extra fini, lasciando liberi i nervi di circa 1,5 cm. Staccare delicatamente il plesso dall'arto superiore sinistro.
    4. Lussare l'arto superiore sinistro; Assicurati che sia privo di nervi. Ripetere il passaggio 1.13 per il lato destro.
14. Esporre il cervello.
    1. Ora, posiziona il mouse a faccia in su (vista anteriore)
    2. Inserisci una lama delle forbici Bonn extra fini in bocca e taglia la mandibola attraverso la gola.
    3. Rimuovere la mandibola tagliando ulteriormente dalle guance alla gola.
    4. Quindi, tagliare l'osso del cranio passando da un orecchio all'altro.
       NOTA: Fai attenzione a non andare troppo in profondità e danneggiare il cervello.
    5. Tagliare e rimuovere il palato e le ossa nasali per aprire il cranio.
    6. Taglia la vertebra C1 alla base del cranio, rilasciando il cervelletto e l'inizio del midollo spinale.
    7. Infine, taglia il cranio trasversalmente fino all'occhio e rimuovi i pezzi del cranio per esporre il cervello.
       NOTA: Mantieni il cervello nella sua cavità fino a quando i nervi non vengono staccati.
15. Rimuovere il grasso o i muscoli in eccesso dalla carcassa. Mettere la carcassa in formalina al 10% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT), seguita da brevi lavaggi con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) fino a quando non c'è più odore fissativo e procedere con la fase successiva.
    NOTA: Se il sistema nervoso viene sezionato nelle prossime 2 settimane, conservarlo a 4 °C in PBS. In caso contrario, conservarlo in formalina al 10% a tempo indeterminato. Utilizzare sempre una cappa chimica quando si manipola la formalina.

2. Esposizione al midollo spinale

1. Per esporre il midollo spinale, utilizzare un approccio cranio-caudale. Per rimuovere ogni vertebra e il loro strato muscolare soprastante, tagliare a ore dieci e a ore due sul lato ventrale, utilizzando le forbici a molla di Vannas. Sminuzzare la vertebra utilizzando le mini-pinze Dumont. Continua questo processo attraverso le vertebre cervicali e toraciche.
2. Per la sezione lombare, tagliare il processo trasversale su ciascun lato della vertebra. Quindi, tagliare a ore due e dieci inserendo la lama di un paio di forbici a molla Vannas nel canale vertebrale. Rimuovere i tessuti, prestando attenzione ai nervi che a volte sono attaccati alle ossa.
3. Procedere in modo analogo per la parte caudale.

3. Esposizione al nervo toracico

1. Metti la carcassa al microscopio da dissezione per visualizzare il lato anteriore.
2. Usando le forbici a molla Vannas, taglia lungo ogni costola (dallo sterno agli arti inferiori) per esporre i nervi periferici.
3. Quindi, taglia la vertebra su entrambi i lati (lateralmente) del ganglio per esporre il ganglione.

4. Distacco del nervo periferico

1. Per staccare il midollo spinale e rimuovere ulteriormente i nervi periferici, utilizzare le mini-pinze Dumont per arrotolare delicatamente il midollo spinale ed estrarre i nervi uno per uno, iniziando dalla parte caudale del midollo spinale.
   NOTA: Prima del peeling, è possibile eseguire un'ulteriore fissazione in formalina al 10% per 15 minuti a RT, seguita da brevi lavaggi 1x PBS fino a quando non c'è più odore fissativo, come eseguito al punto 1.15.
2. Per la parte toracica, tirare il nervo con un angolo di 90° (perpendicolare al midollo spinale).
3. Per il plesso brachiale, tagliare la vertebra vicino al nervo, per fare spazio al nervo.
   NOTA: Il plesso brachiale non può essere fatto passare sotto la vertebra, come nella regione toracica.
4. Rimuovi i muscoli in eccesso per liberare i nervi.
5. Conservare in PBS a 4 °C per un massimo di 2 settimane o a tempo indeterminato in formalina al 10% a RT.

Risultati

I roditori sono stati fondamentali per la nostra comprensione della biologia del sistema nervoso e della fisiopatologia¹⁰. Curiosamente, nessun metodo presenta la dissezione completa del sistema nervoso centrale e periferico di un roditore per valutare l'anatomia e la variazione patologica in un modello in tempo reale ^1,2,11. La Figura 1 pres...

Discussione

Per evitare che i muscoli e i nervi si secchino, la carcassa deve essere immersa in PBS ogni 10 minuti. Quando si lussano gli arti inferiori (passaggio 1.12.6), è importante avere sempre in vista il plesso del nervo sciatico e L2 per evitare di danneggiarlo/strapparlo. Quando si seziona il cervello (passaggio 1.14.4), è fondamentale evitare di andare troppo in profondità per non danneggiare il cervello. Quando si sezionano i gangli della radice dorsale e i nervi periferici in generale...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124