Dissektion von Mäusen des gesamten zentralen und peripheren Nervensystems

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Dissektion des zentralen und peripheren Nervensystems von Mäusen abzuschließen. Die präparierten Gewebe werden in nachgelagerten Anwendungen, wie z.B. der Aufnahme von Bruttobildern oder der Histologie, weiter analysiert.

Zusammenfassung

Tiermodelle stellen das Arbeitspferd der Neurowissenschaften dar. Trotzdem gibt es heute immer noch kein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Sezierung eines kompletten Nervensystems von Nagetieren, noch gibt es ein vollständiges Schema, das es frei verfügbar darstellt. Es stehen nur Methoden zur Entnahme des Gehirns, des Rückenmarks, eines bestimmten Spinalganglion und des Ischiasnervs (separat) zur Verfügung. Hier finden Sie detaillierte Bilder und ein Schema des zentralen und peripheren murinen Nervensystems. Noch wichtiger ist, dass wir ein robustes Verfahren zur Durchführung der Dissektion skizzieren. Der 30-minütige Vordissektionsschritt ermöglicht die Isolierung des intakten Nervensystems innerhalb des Wirbels mit Muskeln, die von Eingeweiden und Haut befreit sind. Es folgt eine 2-4-stündige Dissektion unter einem Mikrodissektionsmikroskop, um das Rückenmark und die Thoraxnerven freizulegen und schließlich das gesamte zentrale und periphere Nervensystem vom Kadaver zu schälen. Dieses Protokoll stellt einen bedeutenden Schritt vorwärts bei der Erforschung der Anatomie und Pathophysiologie des Nervensystems weltweit dar. So können beispielsweise die präparierten Spinalganglien aus einem Neurofibromatose-Typ-I-Mausmodell für die Histologie weiterverarbeitet werden, um Veränderungen in der Tumorprogression zu entschlüsseln.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das zentrale und periphere Nervensystem einer Maus in einem Stück zu isolieren. Derzeit gibt es kein Protokoll, um das gesamte Nervensystem eines Nagetiers zu sezieren, um es auf globaler Ebene zu untersuchen. Neurowissenschaftler verwenden typischerweise den Ischiasnerv als Surrogat für jeden peripheren Nerv¹ und die Ganglien L3 bis L5² als Surrogat für alle Ganglien. Mit diesen Methoden ist es unmöglich zu schließen, ob die Ergebnisse spezifisch für den jeweiligen Nerv/Ganglion sind. Da bekannt ist, dass zumindest einige Nervenpathologien nicht alle Nerven und Ganglien gleichermaßen betreffen ^3,4,5, muss man eine Technik entwickeln, die die Isolierung des gesamten Nervensystems von Nagetieren ermöglicht, um es global zu untersuchen.

Im Laufe der Jahre haben wir eine Methode entwickelt und verfeinert, mit der das gesamte zentrale und periphere Nervensystem von Mäusen analysiert werden kann. Der erste Schritt ist im Wesentlichen eine grobe Dissektion der Mäuse zur Vorbereitung auf die Mikrodissektionsschritte unter dem Dissektionsmikroskop. In den Schritten 2 bis 4 werden das Rückenmark und die Thoraxnerven freigelegt, das Gehirn präpariert und das gesamte Rückenmark und die peripheren Nerven vom Kadaver abgezogen.

Diese Methode ist leistungsfähig, wenn sie mit der Bildgebung oder Histologie gekoppelt wird, um makroskopische oder mikroskopische Veränderungen zu dokumentieren 6,7,8,9. Neurowissenschaftler, die daran interessiert sind, den globalen Wandel zu untersuchen oder nicht-hypothesengetriebene Experimente durchzuführen, sollten diese Methode nutzen, um das globale Nervensystem zu untersuchen.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden vom Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, einer vom Canadian Council on Animal Care zertifizierten Einrichtung, genehmigt.

1. Vorbereitung für die Mikrodissektion (Pre-Dissektion)

1. Führen Sie eine Anästhesie mit 5 % Isofluran durch, gefolgt von einer Euthanasie mit 2 % Isofluran und 10 psi CO₂ , bis keine Vitalfunktionen mehr vorhanden sind.
   HINWEIS: Führen Sie keine Gebärmutterhalsluxation durch, da diese das Rückenmark und die Halsganglien schädigt.
2. Legen Sie die euthanasierte Maus mit dem Gesicht nach oben (Vorderansicht) auf ein Sezierpad und besprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol.
3. Stecken Sie dann die oberen und unteren Gliedmaßen mit vier Stiften mit kleinem Durchmesser fest, um die Maus während der Dissektion in Position zu halten.
4. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Haut vom Unterbauch bis zum Hals auf.
5. Ziehen Sie die Haut ab, um die inneren Organe freizulegen, und verwenden Sie zusätzliche Stifte, um die Haut auf jeder Seite zu erhalten, während die Bauchhöhle freigelegt wird.
6. Schneide den Brustkorb auf, um Herz und Lunge freizulegen.
7. Fassen Sie mit einer anatomischen Standardzange die Speiseröhre und die Luftröhre und schneiden Sie direkt über der Pinzette.
8. Beginnen Sie dann, alle inneren Organe in einem kranialen bis kaudalen Ansatz abzuziehen. Schneide dazu das Zwerchfell entlang der Wirbelsäule durch, um alle inneren Organe in einem Stück zu entfernen.
9. Lösen Sie die Maus und spülen Sie überschüssiges Mäuseblut aus der Bauchhöhle in einem Waschbecken ab.
10. Platzieren Sie die Maus mit der Vorderseite nach unten (hintere Ansicht). Stecke die oberen und unteren Gliedmaßen fest, indem du die Maus während der Dissektion mit vier Stiften in Position hältst.
11. Ziehen Sie mit einer chirurgischen Schere die Haut vom Kopf bis zu den hinteren Gliedmaßen ab.
12. Legen Sie den linken Ischiasnerv (untere Extremität) frei.
    1. Schneiden Sie die Muskeln im unteren Teil der linken unteren Extremität auf.
    2. Lokalisieren und legen Sie den Ischiasnerv frei, indem Sie den Muskel um ihn herum entfernen.
    3. Schneiden Sie den Ischiasnerv vorsichtig an der Verzweigung des Nervus sural, tibialis und peroneus ab und schonen Sie die Blutgefäße.
    4. Fahren Sie mit der Isolierung des Ischiasnervs mit einer anatomischen Standardzange und einer extra feinen Bonner Schere fort, bis er parallel zur Wirbelsäule verläuft und einen freien Nerv von etwa 2 cm übrig lässt.
    5. Führen Sie die chirurgische Schere parallel zum Rückenmark ein und schneiden Sie die Hüfte.
    6. Verrenken Sie die Hüfte, indem Sie das Kreuzbein und den Oberschenkelknochen mit den Fingern auseinanderziehen.
       HINWEIS: Während dieses Vorgangs ist es erforderlich, häufig anzuhalten, um den Ischiasnerv vorsichtig mit einer Pinzette zu ziehen, um eine Unterbrechung zu vermeiden.
    7. Reißen Sie am Ende das Hinterglied vorsichtig vom Mauskadaver ab, so dass ein etwa 4 cm langer Ischiasnerv übrig bleibt.
       HINWEIS: Lokalisieren Sie während dieses Vorgangs den L2-Nerv und ziehen Sie ihn aus der hinteren Gliedmaße heraus, um eine Beschädigung des L2 zu vermeiden. Wiederholen Sie Schritt 1.12 für die rechte Seite.
13. Legen Sie die Nervus brachialis (obere Gliedmaßen) frei.
    1. Manipulieren Sie den Mauskadaver in den Händen und nicht auf einer ebenen Fläche (Sezierkissen).
    2. Lokalisieren Sie den linken Plexus brachialis, indem Sie das Fett und die Muskeln in der linken Achselhöhle auseinander ziehen.
    3. Sobald sie lokalisiert sind, schneiden Sie die Verästelungen des Plexus brachialis (radial, axillär, suprascapular) und ihre Unterverästelungen um die Elle herum mit einer extra feinen Bonner Schere ab, so dass etwa 1,5 cm freie Nerven übrig bleiben. Ziehen Sie den Plexus vorsichtig aus der oberen linken Extremität ab.
    4. Luxieren Sie die obere linke Extremität; Stellen Sie sicher, dass es nervenfrei ist. Wiederholen Sie Schritt 1.13 für die rechte Seite.
14. Lege das Gehirn frei.
    1. Platzieren Sie nun die Maus mit der Vorderseite nach oben (Vorderansicht)
    2. Führen Sie eine Klinge der extrafeinen Bonner Schere in den Mund ein und schneiden Sie den Unterkiefer durch den Hals.
    3. Entfernen Sie den Unterkiefer, indem Sie von den Wangen bis zum Hals weiter schneiden.
    4. Schneiden Sie dann den Schädelknochen ab, der von einem Ohr zum anderen führt.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu tief zu gehen und das Gehirn zu schädigen.
    5. Schneide den Gaumen und die Nasenknochen ab und entferne sie, um den Schädel zu öffnen.
    6. Schneiden Sie den C1-Wirbel an der Schädelbasis durch, wodurch das Kleinhirn und der Anfang des Rückenmarks freigegeben werden.
    7. Zum Schluss schneidest du den Schädel quer bis zum Auge und entfernst die Schädelstücke, um das Gehirn freizulegen.
       HINWEIS: Halten Sie das Gehirn in seiner Höhle, bis die Nerven abgezogen sind.
15. Entfernen Sie überschüssiges Fett oder Muskeln aus dem Schlachtkörper. Legen Sie den Schlachtkörper 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 10%iges Formalin, gefolgt von kurzen Waschgängen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bis kein Fixiergeruch mehr vorhanden ist, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
    HINWEIS: Wenn das Nervensystem in den nächsten 2 Wochen präpariert wird, lagern Sie es bei 4 °C in PBS. Andernfalls lagern Sie es auf unbestimmte Zeit in 10% Formalin. Verwenden Sie immer eine chemische Haube, wenn Sie Formalin manipulieren.

2. Freilegung des Rückenmarks

1. Um das Rückenmark freizulegen, verwenden Sie einen kranial-kaudalen Ansatz. Um jeden Wirbel und seine darüber liegende Muskelschicht zu entfernen, schneiden Sie mit einer Federschere von Vannas in der Zehn-Uhr- und Zwei-Uhr-Position auf der Bauchseite. Schlagen Sie den Wirbel mit einer Dumont Mini-Pinzette ab. Setzen Sie diesen Vorgang über den Hals- und Brustwirbel fort.
2. Schneiden Sie für den Lendenwirbelbereich den Querfortsatz auf jeder Seite des Wirbels ab. Schneiden Sie dann in der Zwei-Uhr- und Zehn-Uhr-Position, indem Sie die Klinge einer Federschere von Vannas in den Wirbelkanal einführen. Entfernen Sie das Gewebe und achten Sie dabei auf die Nerven, die manchmal an den Knochen kleben.
3. Gehen Sie für den kaudalen Teil ähnlich vor.

3. Exposition des Brustnervs

1. Legen Sie den Schlachtkörper unter das Präpariermikroskop, um die vordere Seite sichtbar zu machen.
2. Schneiden Sie mit einer Federschere von Vannas entlang jeder Rippe (vom Brustbein bis zu den unteren Extremitäten), um die peripheren Nerven freizulegen.
3. Schneiden Sie anschließend den Wirbel auf beiden Seiten (lateral) des Ganglions ab, um das Ganglion freizulegen.

4. Abschälen des peripheren Nervs

1. Um das Rückenmark abzulösen und die peripheren Nerven weiter zu entfernen, rollen Sie das Rückenmark mit der Dumont-Minizange vorsichtig ab und ziehen Sie die Nerven nacheinander heraus, beginnend mit dem kaudalen Teil des Rückenmarks.
   HINWEIS: Vor dem Abziehen kann eine zusätzliche Fixierung in 10% Formalin für 15 min bei RT durchgeführt werden, gefolgt von kurzen 1x PBS-Wäschen, bis kein Fixiergeruch mehr vorhanden ist, wie in Schritt 1.15 durchgeführt.
2. Für den thorakalen Teil ziehen Sie den Nerv in einem 90°-Winkel (senkrecht zum Rückenmark).
3. Für den Plexus brachialis den Wirbel neben dem Nerv durchtrennen, um Platz für den Nerv zu schaffen.
   HINWEIS: Der Plexus brachialis kann nicht unter dem Wirbel geführt werden, wie im Brustbereich.
4. Entfernen Sie die überschüssigen Muskeln, um die Nerven zu reinigen.
5. In PBS bei 4 °C bis zu insgesamt 2 Wochen oder auf unbestimmte Zeit in 10 % Formalin bei RT lagern.

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Ergebnisse

Nagetiere haben maßgeblich zu unserem Verständnis der Biologie und Pathophysiologie des Nervensystems^{beigetragen 10}. Interessanterweise gibt es keine Methode, die die vollständige Zerlegung des zentralen und peripheren Nervensystems eines Nagetiers darstellt, um die Anatomie und pathologische Variation in einem Echtzeitmodell zu beurteilen ^1,2,11. ...

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Diskussion

Um ein Austrocknen der Muskeln und Nerven zu verhindern, sollte der Schlachtkörper alle 10 min in PBS eingeweicht werden. Bei der Ausrenkung der unteren Gliedmaßen (Schritt 1.12.6) ist es wichtig, den Ischiasnervenplexus und L2 immer im Blick zu haben, um eine Beschädigung/einen Riss zu vermeiden. Bei der Präparierung des Gehirns (Schritt 1.14.4) ist es wichtig, nicht zu tief zu gehen, um das Gehirn nicht zu schädigen. Bei der Präparierung der Spinalganglien und der peripheren Nerv...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124