Вскрытие всей центральной и периферической нервной системы у мышей

Резюме

Здесь мы представляем протокол для завершения вскрытия центральной и периферической нервной системы мышей. Рассеченные ткани в дальнейшем анализируются в последующих приложениях, таких как общие снимки или гистология.

Аннотация

Животные модели представляют собой рабочую лошадку в области нейробиологии. Несмотря на это, на сегодняшний день до сих пор не существует пошагового протокола для полного препарирования нервной системы грызуна, а также нет полной схемы, представляющей ее, которая была бы в свободном доступе. Доступны только методы забора головного мозга, спинного мозга, определенного ганглия заднего корешка и седалищного нерва (отдельно). Здесь мы приводим подробные фотографии и схему центральной и периферической нервной системы мышей. Что еще более важно, мы описываем надежную процедуру для выполнения его вскрытия. 30-минутный этап предварительного рассечения позволяет изолировать интактную нервную систему внутри позвонка с помощью мышц, свободных от внутренних органов и кожи. За этим следует 2-4-часовое вскрытие под микроскопом, чтобы обнажить спинной мозг и грудные нервы и, наконец, снять кожуру со всей центральной и периферической нервной системы. Этот протокол представляет собой значительный шаг вперед в изучении анатомии и патофизиологии нервной системы во всем мире. Например, рассеченные ганглии дорсальных корешков из модели мышей с нейрофиброматозом I типа могут быть дополнительно обработаны для гистологии, чтобы выявить изменения в прогрессировании опухоли.

Введение

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать центральную и периферическую нервную систему мыши в целое целое. В настоящее время не существует протокола для препарирования всей нервной системы грызуна для ее изучения на глобальном уровне. Неврологи обычно используют седалищный нерв в качестве суррогата для любого периферического нерва¹, а ганглии от L3 до L5^{2 в} качестве суррогата для любых ганглий. Используя эти методы, невозможно сделать вывод, являются ли результаты специфичными для конкретного нерва/ганглия. Поскольку известно, что по крайней мере некоторые нервные патологии поражают не все нервы и ганглии одинаково ^3,4,5, необходимо разработать методику, позволяющую изолировать всю нервную систему грызуна для изучения ее глобально.

На протяжении многих лет мы разрабатывали и совершенствовали метод полного препарирования центральной и периферической нервной системы мышей. Первый этап, по сути, представляет собой грубое препарирование мышей в рамках подготовки к этапам микродиссекции под микроскопом. На этапах со 2 по 4 обнажаются спинной мозг и грудные нервы, расчленяется головной мозг, а весь спинной мозг и периферические нервы отделяются от туши.

Этот метод эффективен в сочетании с визуализацией или гистологией для документирования любых макроскопических или микроскопических изменений 6,7,8,9. Нейробиологи, заинтересованные в изучении глобальных изменений или проведении экспериментов, не основанных на гипотезах, должны использовать этот метод для изучения глобальной нервной системы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, учреждением, сертифицированным Канадским советом по уходу за животными.

1. Подготовка к микродиссекции (преддиссекция)

1. Провести анестезию 5% изофлураном, затем эвтаназию 2% изофлураном и 10 psi CO₂ до тех пор, пока не исчезнут жизненные показатели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте вывих шейного отдела, так как это повреждает спинной мозг и шейные ганглии.
2. Поместите усыпленную мышь лицевой стороной вверх (вид спереди) на подушечку для вскрытия и распылите на шерсть 70% этанола.
3. Затем прикрепите верхние и нижние конечности, используя четыре булавки малого диаметра, чтобы удерживать мышь в положении во время вскрытия.
4. С помощью хирургических ножниц разрежьте кожу от нижней части живота до горла.
5. Снимите кожу, чтобы обнажить внутренние органы, и используйте дополнительные булавки, чтобы сохранить кожу с каждой стороны, обнажая брюшную полость.
6. Разрежьте грудную клетку, чтобы обнажить сердце и легкие.
7. С помощью пары стандартных анатомических щипцов захватите пищевод и трахею и разрежьте чуть выше щипцов.
8. Затем начните отслаивать все внутренние органы в краниально-каудальном доступе. Для этого разрежьте диафрагму вдоль позвоночного столба, чтобы удалить все внутренние органы одним куском.
9. Отцепите мышь и смойте лишнюю мышиную кровь из брюшной полости в раковине.
10. Положите мышь лицевой стороной вниз (вид сзади). Прикрепите верхние и нижние конечности, используя четыре булавки, чтобы удерживать мышь в нужном положении во время вскрытия.
11. С помощью хирургических ножниц сдирайте кожу с головы до задних конечностей.
12. Обнажите левый седалищный нерв (нижнюю конечность).
    1. Разрежьте мышцы в нижней части левой нижней конечности.
    2. Найдите и обнажите седалищный нерв, удалив мышцу вокруг него.
    3. Осторожно перережьте седалищный нерв на месте разветвления сурального, большеберцового и малоберцового нервов и пощадите кровеносные сосуды.
    4. Продолжайте изолировать седалищный нерв с помощью стандартных анатомических щипцов и очень тонких боннских ножниц, пока он не станет параллельным позвоночному столбу, оставляя свободный нерв около 2 см.
    5. Вставьте хирургические ножницы параллельно спинному мозгу и разрежьте бедро.
    6. Вывихните бедро, раздвинув крестец и бедренную кость пальцами.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса необходимо часто останавливаться, чтобы аккуратно потянуть седалищный нерв с помощью щипцов, чтобы избежать нарушения.
    7. В конце аккуратно оторвите заднюю конечность от тушки мыши, оставив седалищный нерв длиной около 4 см.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса найдите нерв L2 и вытащите его из задней конечности, чтобы избежать повреждения L2. Повторите шаг 1.12 для правой стороны.
13. Обнажите плечевые нервы (верхние конечности).
    1. Манипулируйте тушкой мыши в руках, а не на ровной поверхности (дискотеке).
    2. Найдите левое плечевое сплетение, раздразняв жир и мышцы в левой подмышечной впадине.
    3. После обнаружения разрежьте основные разветвления плечевого сплетения (радиально, подмышечное, надлопаточное) и их подразветвления вокруг локтевой кости очень тонкими боннскими ножницами, оставив свободные нервы около 1,5 см. Аккуратно снимите сплетение с верхней левой конечности.
    4. Вывихнуть верхнюю левую конечность; Убедитесь, что он не нервничает. Повторите шаг 1.13 для правой стороны.
14. Обнажите мозг.
    1. Теперь положите мышь лицевой стороной вверх (вид спереди)
    2. Вставьте одно лезвие очень тонких боннских ножниц в рот и разрежьте нижнюю челюсть через горло.
    3. Удалите нижнюю челюсть, дополнительно разрезав от щек к горлу.
    4. Затем разрежьте кость черепа, переходящую от одного уха к другому.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проникнуть слишком глубоко и не повредить мозг.
    5. Разрежьте и удалите нёбо и носовые кости, чтобы открыть череп.
    6. Разрежьте позвонок С1 у основания черепа, освободив мозжечок и начало спинного мозга.
    7. Наконец, разрежьте череп поперечно до глаза и удалите части черепа, чтобы обнажить мозг.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мозг в полости до тех пор, пока нервы не отклеятся.
15. Удалите лишний жир или мышцы из туши. Поместите тушу в 10% формалин на 15 минут при комнатной температуре (RT), затем кратко промойте 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) до тех пор, пока не исчезнет фиксирующий запах, и перейдите к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нервная система будет рассечена в течение следующих 2 недель, храните ее при температуре 4 °C в PBS. В противном случае храните его в 10% формалине неопределенно долго. Всегда используйте химический капюшон при работе с формалином.

2. Обнажение спинного мозга

1. Чтобы обнажить спинной мозг, используйте краниально-каудальный доступ. Чтобы удалить каждый позвонок и его мышечный слой выше, разрежьте в положениях «десять часов» и «два часа» с брюшной стороны, используя пружинные ножницы Ваннас. Откалывайте позвонок с помощью мини-щипцов Дюмона. Продолжайте этот процесс через шейные и грудные позвонки.
2. Для поясничного отдела разрежьте поперечный отросток с каждой стороны позвонка. Затем разрежьте в положениях «два часа» и «десять часов», вставив лезвие пружинных ножниц Vannas в позвоночный канал. Удалите ткани, уделяя внимание нервам, которые иногда прилипают к костям.
3. Аналогично действуйте и с хвостовой частью.

3. Воздействие на грудной нерв

1. Поместите тушу под микроскоп для вскрытия, чтобы визуализировать переднюю сторону.
2. С помощью пружинных ножниц Vannas разрежьте вдоль каждого ребра (от грудины до нижних конечностей), чтобы обнажить периферические нервы.
3. Далее разрежьте позвонок с обеих сторон (сбоку) от ганглия, чтобы обнажить ганглий.

4. Отшелушивание периферических нервов

1. Чтобы отслать спинной мозг и еще больше сместить периферические нервы, с помощью мини-щипцов Дюмонта аккуратно сверните спинной мозг и вытяните нервы один за другим, начиная с каудальной части спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед отшелушиванием можно провести дополнительную фиксацию в 10% формалине в течение 15 минут в режиме RT, а затем провести короткое промывание 1x PBS до тех пор, пока не исчезнет фиксирующий запах, как это выполнено на шаге 1.15.
2. В грудном отделе потяните нерв под углом 90° (перпендикулярно спинному мозгу).
3. Для плечевого сплетения разрежьте позвонок рядом с нервом, чтобы освободить место для нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плечевое сплетение не может проходить под позвонком, как в грудном отделе.
4. Удалите лишние мышцы, чтобы очистить нервы.
5. Хранить в PBS при температуре 4 °C в общей сложности до 2 недель или неопределенно долго при 10% формалине при RT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Грызуны сыграли важную роль в нашем понимании биологии нервной системы и патофизиологии¹⁰. Интересно, что ни один метод не представляет собой полного вскрытия центральной и периферической нервной системы грызуна для оценки анатомии и патологических вар?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Чтобы мышцы и нервы не высыхали, тушу следует замачивать в PBS каждые 10 минут. При вывихе нижних конечностей (шаг 1.12.6) важно всегда держать в поле зрения сплетение седалищного нерва и L2, чтобы избежать его повреждения/разрыва. При вскрытии мозга (шаг 1.14.4) очень важно избег...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124