マウス脳脊髄液中のグルコース濃度上昇のための浸透圧ミニポンプ植込み

要約

この記事では、マウスの脳脊髄液(CSF)中のグルコース濃度を高めるための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、マウスの神経変性、認知、および末梢グルコース代謝に対する高CSFグルコースの影響を研究するのに役立ちます。

要約

糖尿病は認知機能低下のリスクを高め、脳機能を損ないます。高血糖と認知障害の間のこの関係が因果関係であるかどうかは、とらえどころのないままです。さらに、これらの欠損が脳脊髄液(CSF)および/または血液中のグルコースレベルの上昇によって媒介されるかどうかも不明である。現在の糖尿病モデルはそのような研究課題に対処するのに十分に開発されていないため、中枢神経系(CNS)機能、特に学習と記憶に対する高CSFグルコースレベルの直接的な影響を調査した研究はほとんどありません。本稿では、マウスの浸透圧ミニポンプを用いて側脳室にグルコースを連続的に注入することにより、CSFグルコースレベルを4週間慢性的に上昇させる方法について述べる。プロトコルは、CSF中のグルコースレベルを測定することによって検証された。このプロトコルは、人工脳脊髄液(aCSF)を投与されたマウスのCSFグルコース濃度~56 mg/dLと比較して、0.25 μL/hの流速で50%グルコース溶液を注入した後、CSFグルコースレベルを~328 mg/dLに増加させました。さらに、このプロトコルは血糖値に影響を与えませんでした。したがって、この方法は、血糖値の変化とは無関係に、脳機能または特定の神経経路に対する高CSFグルコースの直接的な影響を決定するために使用することができる。全体として、ここで説明するアプローチは、アルツハイマー病および/または糖尿病に関連する他の神経変性疾患の特徴を媒介する高CSFグルコースの役割をテストするための動物モデルの開発を促進します。

概要

1型糖尿病と2型糖尿病の両方が脳機能を損ないます^1,2,3。例えば、糖尿病は認知機能低下やアルツハイマー病を含む神経変性疾患のリスクを高めます^3,4。さらに、糖尿病患者は脳内のグルコース感知に欠陥があります^5,6。この欠陥は、低血糖に関連する無意識の病因と低血糖に対する不十分な逆調節応答に寄与します^7,8、^これはすぐに治療しないと致命的となる可能性があります。

糖尿病は血液および脳脊髄液(CSF)⁹中のグルコースレベルを上昇させることを考慮すると、これらの要因の一方または両方が脳機能障害に寄与するかどうかを判断することが重要です。糖尿病が高CSFグルコースのみによって脳損傷を引き起こすのか、インスリン欠乏症やインスリン抵抗性などの他の要因と組み合わせて脳損傷を引き起こすのかも未解決の問題です。1型および2型糖尿病の動物モデルは、影響を受けたエネルギーバランスおよび末梢グルコース代謝に加えて、認知機能低下および神経変性を示す¹⁰、^11、12、13。しかし、これらのモデルから、脳機能に対する糖尿病の合併症を媒介する際の高CSFグルコース対血糖値の選択的効果を切り離すことは現実的ではない。

このプロトコルは、脳機能、エネルギーバランス、およびグルコース恒常性に対する慢性的に高いCSFグルコースレベルの影響をテストするために、高グリコラキアのマウスモデルを開発する方法を説明しています。この技術によって開発されたマウスモデルは、神経および行動機能に対する調節不全のグルコース恒常性の病因学的役割を調査するための研究のためのツールを提供します。

したがって、提案されたアプローチは、さまざまな病態生理学的条件におけるCSFグルコースレベルの上昇の直接的な影響を理解するのに役立ちます。

プロトコル

すべてのマウス手順は、ロチェスター大学の施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の人道的ケアおよび使用に関する米国公衆衛生局のガイドラインに従って実施されました。本試験に用いた6週齢のC57BL/6J雄マウスを商業的に入手した。すべての動物を12時間の昼/夜サイクルの部屋にグループ飼育し(ケージあたり5匹のマウス)、餌と水を 自由に摂取できるようにしました。マウスにグルコースを側脳室に注入するためのカニューレを移植した後、他のマウスからのインプラントへの損傷を防ぐために、マウスを単一収容した。

1.浸透圧ミニポンプの組み立て

1. 以下のプロトコールに従って人工脳脊髄液(aCSF)を調製する。NaCl (8.66 g)、KCl (0.224 g)、CaCl 2.2H 2 O (0.206 g)、および MgCl_2.6H 2 O (0.163 g) を滅菌水 500 mL に溶解し、溶液 A を調製します。 Na 2 HPO 4.7H 2 O (0.214 g) および NaH₂ PO₄ を溶解します。H₂O (0.027 g) を 500 mL の滅菌水に入れて溶液 B を調製した。次に、溶液AとBを1:1の比率で混合し、aCSFを調製した。
   注:このaCSF製剤にはグルコースは含まれていません。
2. 50%グルコース溶液を調製するには、ビーカー内の50 mLのaCSFに50 gのグルコースを加えます。ビーカーをホットプレートに置き、懸濁液の温度を60°Cにします。 グルコースが完全に溶解するまで懸濁液をマグネチックスターラーで混合する。
3. aCSFをビーカーに加えて、最終容量を100mLにします。溶液を0.22 μmの細孔フィルターに通して滅菌します。
4. 0.9%生理食塩水(NaCl)溶液を調製し、溶液を0.22 μmフィルターに通します。
5. ミニポンプと輸液キットのすべてのコンポーネントを滅菌トレイに入れ、滅菌ハサミで脳輸液キットのチューブを長さ1インチに切断します。滅菌止血材でチューブを持ち、カニューレの一端の上部に押し込みます。チューブのもう一方の端をフローモジュレーターの上側に接続します。チューブの両端を少量の接着剤で覆い、接続を強化します。
6. 27 Gの針を1 mLのシリンジに取り付け、aCSFまたはグルコース溶液のいずれかで満たします。27 Gの針を小さなチューブに挿入します。次に、チューブを流量変調器の開放端に接続し、溶液の液滴がカニューレから出始めるまで、対応する溶液で満たします。チューブに閉じ込められた気泡をすべて取り除きます。
7. ミニポンプを満たすには、ポンプを直立させ、シリンジ針をポンプに挿入します。ミニポンプの開口部で溶液の滴が形成され始めるまで、対応する溶液でそれを満たします。
8. アセンブリに気泡が発生しないように注意しながら、流量変調器をポンプにゆっくりと挿入します。
9. 浸透圧ミニポンプを組み立てたら、50 mLの円錐管に移します。カニューレが生理食塩水から離れていることを確認しながら、ポンプが完全に水没するように、滅菌生理食塩水でチューブを満たします。このような組み立てられたポンプ4台を1本の50mLチューブに入れることができます。
10. 各チューブにキャップを緩く置き、ポンプを37°Cでインキュベートして、少なくとも48時間プライミングします。

2. 浸透圧ポンプを埋め込む手術

1. 手術前の手順
   1. 手術器具をオートクレーブで滅菌し、使用前に少なくとも30分間冷却します。オートクレーブ条件には、121°Cで30分間の蒸気滅菌が含まれます。
   2. 手術部位を70%エタノールで消毒します。ノブ、イヤーバー、固定装置フレームの表面を拭きます。
      注意: 手術は、手術中に非滅菌表面に触れないように留意して、無菌環境で行う必要があります。汚染の疑いがある場合は手袋を交換してください。
   3. マウスを麻酔室に入れて、空気中で3〜5分間混合した3%イソフルランで麻酔します。次に、マウスをチャンバーから取り出し、滅菌ドレープの上に置きます。ノーズコーンを介して麻酔を1.5%〜2%に維持します。
   4. マウスの後足をつまんで反射を観察し、麻酔の深さを確認します。
   5. 鎮痛のために5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。.
   6. 清潔なバリカンを使用して、マウスヘッドの手術領域をクリップします。最初にポビドンヨード溶液で頭皮をこすり、次にアルコール綿棒で少なくとも2分間完全にこすります。このプロセスを少なくとも3回繰り返します。
   7. 手術中に目が乾かないように、目の潤滑剤を塗ります。
2. 手術
   1. マウスを固定装置フレームの上に置き、頭を切歯バーに合わせます。鼻コーンで鼻を覆います。手術領域を固定するために滅菌ドレープを適用します。
   2. イソフルランの流れを鼻錐形に移します。麻酔を1.5%〜2%イソフルランに維持し続ける。
   3. 体温を維持するためにマウスの下に加熱パッドを置きます。
   4. 新しい滅菌手袋を着用し、メスで頭皮の正中線切開(長さ~10-15 mm)を行います。頭蓋骨の表面をへらで露出させ、綿の先端を使用して出血を拭きます。
      注意: 大量に出血する場合は焼灼剤を使用してくださいが、これはまれです。
   5. 3%過酸化水素に浸した綿の先端でこすり、頭蓋縫合糸を露出させます。
   6. ブレグマとラムダをメモして、頭蓋骨の座標をナビゲートします。ブレグマですべての座標をゼロに設定します。
      注:これらの座標は、マウス脳アトラス¹⁴から得られた。アトラスの基準ブレグマ-ラムダ距離は4.21 mmです。頭蓋骨サイズの年齢および性別に基づく違いを補正するために、各マウスのブレグマ-ラムダ距離を測定し、4.21 mmで割って乗算係数を求めました。たとえば、ブレグマとラムダの間の距離が4.65 mmの場合、4.21 mmで割ると乗算係数は1.10になります。次に、アトラスから取得したすべての座標にこの係数を掛けて、穴を開けるために使用された実際の座標を測定しました。上記の例では、結果の前後(AP)座標と内側-外側(ML)座標はそれぞれ0.55 mmと1.1 mm(つまり、1.1 x 0.5または1 mm)になります。
   7. 電気ドリルを使用して、次の座標に穴を開けます:ブレグマの後方0.5 mm、右の正中線の横1 mm。
      注意: 頭蓋骨に穴を開けるときは、硬膜を破裂させないように注意してください。ドリルビットが無菌であることを確認してください。滅菌のために同じオートクレーブポーチに他の器具と一緒に入れることができます。
   8. 切開した皮膚の下に止血材を挿入し、浸透圧ミニポンプが埋め込まれる場所に押し込みます。止血器を静かに開閉して、ミニポンプ用のポケットを作ります。
   9. 滅菌止血材を使用して、フローモジュレーターの先端からプライミングされた浸透圧ミニポンプを選択します。ポンプを切開した皮膚を通してポケットに押し込みます。
      注意: ポンプとカニューレが非滅菌表面に触れないように注意してください。
   10. カニューレの下側に接着剤を塗布し、カニューレホルダーに固定します。カニューレを2 mm腹側に開けた穴から頭蓋骨の表面にゆっくりと下げます。接着剤が固まるまで、少なくとも5分間そのままにしておきます。
   11. カニューレを脳に挿入する前に、カニューレが詰まっていないこと、および溶液が適切に流れていることを確認してください。
       注意: 時々、グルコースは非常に低い流量のためにカニューレの先端に沈着し、流れを妨げることがあります。
   12. はさみの助けを借りて、カニューレの上部をクリップして、頭蓋骨の表面から外れないようにします。
   13. カニューレを歯科用セメントの層で覆い、追加のサポートを行います。
   14. ナイロン縫合糸(5-0サイズ、長さ30インチ)を使用して傷口を閉じ、感染を防ぐために創傷に局所抗生物質を塗布します。
   15. イソフルランをオフにして、動物を麻酔から回復させます。次に、動物を新しい清潔なケージに移します。
3. 術後ケア
   1. 手術後、マウスを少なくとも1週間モニターする。
   2. 5 mg / kgのカルプロフェンを、術後3日間、24時間に1回皮下投与します。.
   3. 手術後7〜10日で縫合糸を取り除く前に、創傷を完全に治癒させます。
      注:CSFグルコースが高いマウスは治癒に時間がかかることが観察されました。マウスの後足の爪をトリミングすると、マウスの引っ掻き行動による切開部位の損傷の可能性が最小限に抑えられます。

3.ミニポンプの交換

注:この研究で使用されたミニポンプは4週間しか持続しないため、長期研究の場合に必要となる可能性があるため、グルコース注入の期間を延長するためにミニポンプの交換もテストされました。これには、次の手順が含まれていました。

1. 上記のようにマウスを手術の準備をする。
2. ポンプの少し上の皮膚に1 cmの小さな垂直切開を行います。
3. 切開した皮膚の下に止血材を挿入し、ポンプを引き出します。
4. チューブからポンプを取り外し、新しいプライミングポンプをチューブに接続します。
5. ポンプを内側に戻し、皮膚を縫います。
6. 上記と同じ術後のケアの指示に従ってください。

4. CSF収集手順

1. 準備
   1. マイクロピペットプーラーマシンで直径1mmのガラスキャピラリーを引っ張り、直径0.5mmのチップを取得します。設定は、熱 = 800、プル = 15、速度 = 5、時間 = 200 単位です。引っ張った毛細血管を使用するまで滅菌箱に入れます。
   2. 27 Gの針を1 mLのシリンジに取り付けます。引っ張った毛細血管を針に挿入し、小さな粘着テープを使用して接続を固定します。
   3. シリンジをマイクロマニピュレーターのキャピラリーホルダーにしっかりと固定します。
   4. 次に、上記の手術前の手順で説明したように、手術のためにマウスを準備します。
2. 手術
   1. 定位固定装置フレームの上にマウスを置きます。ヘッドをフレームに固定した後、前述のように、ノブを回してヘッドを傾け、機首が下を向くようにします。手術領域を固定するために滅菌ドレープを適用します。
   2. 耳内面から尾側まで、背側に小さな切開を行います。
      注意: 切開中にチューブを損傷しないように注意してください。
   3. マウス本体からサポートを取り外し、首が背側に完全に伸びるようにマウスを垂直に置きます。
   4. 湾曲した鈍い鉗子の助けを借りて、正中線から後頸部の筋肉をそっと二等分して小さな窓を作ります。次に、濡れた綿のチップアプリケーターを使用して、首の筋肉を正中線から末梢にそっと移動させます。
   5. 透明な硬膜を持つ三角形の窓として現れる大槽が露出しているかどうかを観察します。
   6. マイクロマニピュレーターアセンブリをマウスの隣の固定装置フレームに置き、毛細管の先端が表面に触れないようにします。
   7. セットアップを妨げることなく、キャピラリーチップをそっと壊します。
   8. 虫眼鏡(倍率2.25倍)を見ながら、マイクロマニピュレーターの対応するノブを回して、毛細管の先端をゆっくりと整列させ、大槽に向かって動かします。
   9. 毛細血管の先端が大槽膜に触れると、いくらかの抵抗が感じられます。ノブを使用して、先端を膜に対して非常にゆっくりと押します。
      注意: 膜の血管を傷つけないように注意してください。このステップは、CSF内の血液汚染を避けるために非常に重要です。
   10. 非常に穏やかに膜を突き刺します。CSFは、キャピラリー内の負圧により、すぐにキャピラリーに流れ込み始めます。
   11. ~10 μLのCSFがキャピラリーに集められるまで、セットアップを数分間放置します。
   12. 次に、キャピラリーを槽マグナからゆっくりと引き出し、滅菌綿チップアプリケーターを槽マグナの開口部にそっと押し付けて、CSF漏れを止めます。
   13. シリンジからキャピラリーを慎重に取り外し、マイクロキャップ電球ディスペンサーに取り付けます。電球を押して、CSFを滅菌マイクロ遠心チューブに移します。
   14. マウスの下にサポートを置き、固定装置ノブを回して頭を水平にします。
   15. ナイロン縫合糸で傷を閉じます。
   16. マウスを装置から取り出す前に、300μLの滅菌生理食塩水を皮下注射する。
   17. 術後ケアは、術後7~10日で縫合糸を抜く時期になるまで、上記のように動物にケアを施す。

5.グルコースアッセイ

1. グルコース比色アッセイキットに記載されているプロトコルに従ってください。
2. キットに付属のリン酸ナトリウム緩衝原液を超純水で50 mM濃度に希釈します。
3. 希釈緩衝液中のキットに付属の1,000 mg/dLストック溶液から、0、2.5、5、7.5、10、15、20、25、および50 mg/dLの範囲でグルコース標準を調製します。
4. バッファー中のCSFサンプルの7倍希釈液を調製します。たとえば、収集された総CSF量が10 μLの場合、7倍希釈量は70 μLになります。
5. 15 μLのグルコース標準と希釈CSFを96ウェルプレートに二重にピペットで入れます。
6. 標準物質およびCSFを用いて各ウェルに85 μLの希釈緩衝液をピペットで入れます。
7. 6 mLの希釈緩衝液をグルコース熱量測定酵素混合物バイアルに加え、数秒間ボルテックスして完全に混合します。
8. 100 μLの酵素混合物調製物を各ウェルに添加し、反応を開始します。
9. プレートをカバーシートで密封し、プレートを軽くたたいて試薬を混合します。
10. プレートを37°Cのインキュベーターに10分間入れます。高グルコースのバイアルはすぐに紫色に変わり始めます。
11. 10分後、カバーを取り外し、プレートリーダーを使用して500〜520nmの吸光度を測定します。
12. CSFサンプルのグルコース濃度は、検量線から値を補間して計算します。

6.血糖アッセイ

1. かみそりの刃を使用してマウスの尾に小さな横方向の傷を付け、手動の指示に従って、血滴を使用して血糖値計で血糖値を測定します。

結果

オスマウスに浸透圧ミニポンプに組み立てられたカニューレを移植し(図1)、aCSFまたは50%グルコース溶液を側脳室に慢性的に注入しました(図2)。CSFは、この手順の有効性を検証するために、手術の10日後に収集されました(図3)。その結果、50%グルコースを注入したマウスでは、aCSFを注入したマウス(平均:56.5 mg/dL)と比較して、CS...

ディスカッション

この記事では、側脳室に埋め込まれたカニューレに接続された浸透圧ミニポンプを使用して、マウスのCSFグルコースを増加させるための詳細なプロトコルを報告します。この手順によるマウス脳へのグルコースの慢性注入は、認知、全身のグルコース代謝、およびエネルギーバランスに対する長期高グリコラキアの影響を描写し、糖尿病合併症の病因をよりよく理解するのに役立ちます。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	Membrane solutions	SFPES030022S
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip)	BD	309628
1 mL TB syringe	BD	309659
100 mL Glass beaker	Fisher	N/a
100% Ethanol (Koptec)	DLI	UN170	Use 70% dilution to clean the surgery area
50 mL conical tube	Fisher	N/A
Allignment indicator	KOPF	1905
Alzet brain infusion kit	DURECT	Kit # 3; 0008851	Cut tubing in the kit to 1 inch length
Alzet osmotic pump	DURECT	2004	Flow rate 0.25 µL/h
Anesthesia system	Kent Scientific	SomnoSuite
Betadine solution	Avrio Health	N/A
CaCl2 . 2H2O	Fisher	C79-500
Cannula holder	KOPF	1966
Centering scope	KOPF	1915
Dental Cement Liquid	Lang Dental	REF1404
Dental cement Powder	Lang Dental	REF1220-C
D-glucose	Sigma	G8270
Electric drill	KOPF	1911	While drilling a hole avoid rupturing dura mater
Eye lubricant (Optixcare)	CLC Medica	N/A
Glass Bead sterilizer (Germinator 500)	VWR	101326-488	Place instruments in sterile water to let them cool before surgery
Glucose Assay Kit	Cayman chemical	10009582
H2O2	Sigma	H1009-500ml	Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible.
Hair Clipper	WAHL	N/A
heating pad	Heatpax	19520483
Hemostat	N/A	N/A
Isoflurane (Fluriso)	Zoetis	NDC1385-046-60
KCl	VWR	0395-500g
Magnetic stand	WPI	M1
Magnifying desk lamp	Brightech	LightView Pro Flex 2
Metal Spatula	N/A	N/A
MgCl2 . 6H2O	Fisher	BP214-500
Micromanipulator (Right handed)	WPI	M3301R
Micromanipulator with digital display	KOPF	1940
Na2HPO4 . 7H2O	Fisher	S373-500
NaCl	Sigma	S7653-5Kg
NaH2PO4 . H2O	Fisher	S369-500
Neosporin	Johnson & Johnson	N/A	Apply topical oinment to prevent infection
Parafilm	Bemis	DM-999
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml	Zoetis	N/A	5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia
Scalpel	N/A	N/A
Stereotaxic allignment system	KOPF	1900
Sterile 27 gauge needle	BD	305109
Sterile cotton tip applicators (Solon)	AMD Medicom	56200
Sterile nylon sutures (5.0)	Oasis	MV-661	Use non-absorable suture for closing the wound
Sterile sharp scissors	N/A	N/A
Sterile surgical blades	VWR	55411-050
Surgical gloves (Nitrile)	Ammex	N/A	Change gloves if there is suspision of contamination
Tray	N/A	N/A