Implantation d’une minipompe osmotique pour augmenter la concentration de glucose dans le liquide céphalorachidien de souris

Résumé

Cet article décrit un protocole détaillé pour augmenter la concentration de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) des souris. Cette approche peut être utile pour étudier les effets d’une glycémie élevée dans le LCR sur la neurodégénérescence, la cognition et le métabolisme périphérique du glucose chez la souris.

Résumé

Le diabète augmente le risque de déclin cognitif et altère la fonction cérébrale. Que cette relation entre une glycémie élevée et des déficits cognitifs soit causale ou non reste insaisissable. De plus, on ne sait pas non plus si ces déficits sont médiés par une augmentation des taux de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) et / ou le sang. Il existe très peu d’études portant sur les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR sur la fonction du système nerveux central (SNC), en particulier sur l’apprentissage et la mémoire, car les modèles actuels du diabète ne sont pas suffisamment développés pour répondre à de telles questions de recherche. Cet article décrit une méthode pour augmenter chroniquement les niveaux de glucose dans le LCR pendant 4 semaines en perfusant continuellement du glucose dans le ventricule latéral à l’aide de minipompes osmotiques chez la souris. Le protocole a été validé en mesurant les niveaux de glucose dans le LCR. Ce protocole a augmenté les niveaux de glucose du LCR à ~328 mg / dL après perfusion d’une solution de glucose à 50% à un débit de 0,25 μL / h, par rapport à une concentration de glucose dans le LCR de ~ 56 mg / dL chez les souris ayant reçu du liquide céphalorachidien artificiel (aLCR). De plus, ce protocole n’a pas affecté la glycémie. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour déterminer les effets directs d’une glycémie élevée dans le LCR sur la fonction cérébrale ou une voie neuronale spécifique indépendamment des changements dans les niveaux de glucose dans le sang. Dans l’ensemble, l’approche décrite ici facilitera le développement de modèles animaux pour tester le rôle d’une glycémie élevée dans le LCR dans la médiation des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer et / ou d’autres troubles neurodégénératifs associés au diabète.

Introduction

Le diabète de type 1 et de type 2 altère les fonctions cérébrales ^1,2,3. Par exemple, le diabète augmente le risque de déclin cognitif et de troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d’Alzheimer ^3,4. De plus, les personnes atteintes de diabète ont une détection de glucose défectueuse dans le cerveau ^5,6. Ce défaut contribue à la pathogenèse de l’hypoglycémie associée à l’inconscience et à une réponse contre-réglementaire insuffisante à l’hypoglycémie^7,8, qui peut être fatale si elle n’est pas traitée immédiatement.

Étant donné que le diabète augmente le taux de glucose dans le sang ainsi que dans le liquide céphalorachidien (LCR)⁹, il est important de déterminer si l’un de ces facteurs ou les deux contribuent à une altération de la fonction cérébrale. La question de savoir si le diabète provoque des lésions cérébrales par une glycémie élevée dans le LCR seul ou en combinaison avec d’autres facteurs tels que la carence en insuline ou la résistance à l’insuline reste également ouverte. Les modèles animaux de diabète de type 1 et de type 2 montrent un déclin cognitif et une neurodégénérescence en plus d’un bilan énergétique affecté et d’un métabolisme périphérique du glucose^10,11,12,13. Cependant, à partir de ces modèles, il n’est pas possible de dissocier les effets sélectifs d’une glycémie élevée dans le LCR par rapport à la médiation des complications du diabète sur la fonction cérébrale.

Ce protocole décrit des méthodes pour développer un modèle murin d’hyperglycorrhachie afin de tester les effets des niveaux de glucose chroniquement élevés dans le LCR sur la fonction cérébrale, l’équilibre énergétique et l’homéostasie du glucose. Le modèle murin développé grâce à cette technique présente un outil pour les études sur le rôle étiologique de l’homéostasie du glucose dérégulée sur la fonction neuronale et comportementale.

Par conséquent, l’approche proposée sera utile pour comprendre les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR dans diverses conditions physiopathologiques.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Rochester et ont été effectuées conformément aux directives du Service de santé publique des États-Unis pour le soin et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire. Des souris mâles C57BL/6J âgées de six semaines utilisées pour cette étude ont été obtenues commercialement. Tous les animaux ont été logés en groupe (5 souris par cage) dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12 h et ont eu accès à de la nourriture et de l’eau ad libitum. Après que les souris ont été implantées avec une canule pour perfuser du glucose dans le ventricule latéral, elles ont été logées seules pour éviter tout dommage aux implants d’autres souris.

1. Assemblage de minipompes osmotiques

1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (aLCR) selon le protocole suivant. Dissoudre NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H 2 O (0,206 g) et MgCl 2,6H2O (0,163 g) dans 500 mL d’eau stérile pour préparer la solution A. Dissoudre_Na2HPO 4,7H2O (0,214 g)et NaH ₂ PO₄. _H2O(0,027 g) dans 500 mL d’eau stérile pour préparer la solution B. Ensuite, mélanger les solutions A et B dans un rapport de 1:1 pour préparer le LCRa.
   REMARQUE: Cette formulation d’aCSF ne contient pas de glucose.
2. Pour préparer la solution de glucose à 50 %, ajouter 50 g de glucose à 50 mL de LCR dans un bécher. Placez le bécher sur une plaque chauffante et portez la température de la suspension à 60 °C. Mélanger la suspension avec un agitateur magnétique jusqu’à ce que le glucose soit complètement dissous.
3. Ajouter aCSF au bécher pour obtenir le volume final de 100 mL. Passez la solution à travers un filtre à pores de 0,22 μm pour la stériliser.
4. Préparer une solution saline à 0,9 % (NaCl) et faire passer la solution à travers le filtre à 0,22 μm.
5. Placez tous les composants de la minipompe et du kit de perfusion dans un plateau stérile et coupez le tube du kit de perfusion cérébrale à 1 pouce de longueur avec un ciseau stérile. Tenez le tube avec un hémostatique stérile et poussez-le sur le dessus d’une extrémité de la canule. Connectez l’autre extrémité du tube à la partie supérieure du modulateur de débit. Couvrez les deux extrémités du tube avec une petite quantité de colle pour une connexion plus solide.
6. Fixez une aiguille de 27 G à une seringue de 1 mL et remplissez-la avec du LCR ou de la solution de glucose. Insérez l’aiguille de 27 G dans un petit morceau de tube. Ensuite, connectez le tube à l’extrémité ouverte du modulateur de débit et remplissez-le avec la solution correspondante jusqu’à ce que des gouttes de la solution commencent à sortir de la canule. Enlevez toutes les bulles d’air emprisonnées dans le tube.
7. Pour remplir la minipompe, maintenez la pompe à la verticale et insérez l’aiguille de la seringue dans la pompe. Remplissez-le avec la solution correspondante jusqu’à ce qu’une goutte de solution commence à se former à l’ouverture de la minipompe.
8. Insérez lentement le modulateur de débit dans la pompe tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air dans l’assemblage.
9. Une fois les minipompes osmotiques assemblées, transférez-les dans un tube conique de 50 mL. Remplissez le tube avec la solution saline stérile afin que les pompes soient complètement immergées, tout en vous assurant que la canule reste hors de la solution saline. Quatre pompes assemblées peuvent être placées dans un tube de 50 mL.
10. Placer le bouchon sur chaque tube et incuber les pompes à 37 °C pour amorcer pendant au moins 48 h.

2. Chirurgie pour implanter des pompes osmotiques

1. Procédure préopératoire
   1. Stérilisez les instruments chirurgicaux dans un autoclave et laissez-les refroidir pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Les conditions de l’autoclave impliquent une stérilisation à la vapeur à 121 °C pendant 30 min.
   2. Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Essuyez les boutons, les barres d’oreille et la surface stéréotaxique du cadre.
      REMARQUE: La chirurgie doit être effectuée dans un environnement aseptique, en gardant à l’esprit d’éviter de toucher des surfaces non stériles lors de la chirurgie. Remplacez les gants en cas de suspicion de contamination.
   3. Placez la souris dans une chambre d’anesthésie pour l’anesthésier avec 3% d’isoflurane mélangé à de l’air pendant 3-5 min. Ensuite, retirez la souris de la chambre et placez-la sur un champ stérile. Maintenir l’anesthésie via un cône nasal à 1,5%-2%.
   4. Pincez la patte postérieure de la souris pour observer tout réflexe et vérifier la profondeur de l’anesthésie.
   5. Injecter 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
   6. Utilisez des tondeuses propres pour clipser la zone chirurgicale sur la tête de la souris. Frottez d’abord le cuir chevelu avec une solution de povidone iodée, puis avec des tampons d’alcool à fond pendant au moins 2 minutes. Répétez ce processus au moins trois fois.
   7. Appliquez un lubrifiant pour les yeux pour empêcher les yeux de sécher pendant la chirurgie.
2. Chirurgie
   1. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique et placez la tête sur la barre d’incisive. Couvrez le nez avec le cône nasal. Appliquez des champs stériles pour sécuriser la zone chirurgicale.
   2. Déplacer le flux d’isoflurane vers le cône nasal. Continuer à maintenir l’anesthésie à 1,5 % -2 % d’isoflurane.
   3. Placez un coussin chauffant sous la souris pour maintenir la température corporelle.
   4. Mettez de nouveaux gants stériles et, avec un scalpel, faites une incision médiane (~10-15 mm de long) sur le cuir chevelu. Exposez la surface du crâne avec une spatule tout en utilisant des pointes en coton pour essuyer tout saignement.
      REMARQUE: Utilisez un cautériseur en cas de saignement abondant, ce qui est rare.
   5. Frottez avec une pointe en coton trempée dans du peroxyde d’hydrogène à 3% pour exposer les sutures crâniennes.
   6. Prenez note de bregma et lambda pour naviguer dans les coordonnées du crâne. Réglez toutes les coordonnées à zéro au bregma.
      NOTE: Ces coordonnées ont été obtenues à partir d’un atlas du cerveau de souris¹⁴. La distance de référence bregma-lambda dans l’atlas est de 4,21 mm. Pour corriger les différences de taille du crâne basées sur l’âge et le sexe, la distance bregma-lambda pour chaque souris a été mesurée, puis divisée par 4,21 mm pour obtenir un facteur de multiplication. Par exemple, si la distance entre bregma et lambda était de 4,65 mm, la division de 4,21 mm donnait un facteur de multiplication de 1,10. Toutes les coordonnées obtenues à partir de l’atlas ont ensuite été multipliées avec ce facteur pour mesurer les coordonnées réelles qui ont été utilisées pour percer le trou. Dans l’exemple ci-dessus, les coordonnées antéro-postérieure (AP) et médiale-latérale (ML) résultantes seraient respectivement de 0,55 et 1,1 mm (c.-à-d. 1,1 x 0,5 ou 1 mm).
   7. Utilisez une perceuse électrique pour faire un trou à ces coordonnées : 0,5 mm en arrière du bregma et 1 mm latéral à la ligne médiane vers la droite.
      REMARQUE: Lorsque vous percez le trou dans le crâne, veillez à ne pas rompre la dure-mère. Assurez-vous que le foret est stérile. Il peut être placé avec d’autres instruments dans la même pochette autoclave pour la stérilisation.
   8. Insérez un hémostatique sous la peau incisée et poussez-le à l’endroit où la minipompe osmotique sera implantée. Ouvrez et fermez doucement l’hémostat pour faire une poche pour la minipompe.
   9. Utilisez un hémostatique stérile pour prélever une minipompe osmotique amorcée à l’extrémité du modulateur de débit. Poussez la pompe à travers la peau incisée dans la poche.
      REMARQUE: Veillez à ne pas laisser la pompe et la canule toucher une surface non stérile.
   10. Appliquez un peu de colle sur la face inférieure de la canule et fixez-la dans le porte-canule. Abaissez lentement la canule à travers le trou percé de 2 mm ventralement jusqu’à la surface du crâne. Laissez-le là pendant au moins 5 minutes pour permettre à la colle de se solidifier.
   11. Avant d’insérer la canule dans le cerveau, assurez-vous que la canule n’est pas obstruée et que la solution coule correctement.
       REMARQUE: Parfois, le glucose peut se déposer à l’extrémité de la canule en raison d’un débit très faible, bloquant le flux.
   12. À l’aide d’un ciseau, coupez le haut de la canule en vous assurant qu’elle ne se déloge pas de la surface du crâne.
   13. Couvrir la canule d’une couche de ciment dentaire pour un soutien supplémentaire.
   14. Utilisez des sutures en nylon (taille 5-0 et 30 pouces de longueur) pour fermer la plaie et appliquez un antibiotique topique sur la plaie pour prévenir l’infection.
   15. Éteignez l’isoflurane et laissez l’animal se remettre de l’anesthésie. Ensuite, transférez l’animal dans une nouvelle cage propre.
3. Soins post-opératoires
   1. Après la chirurgie, surveillez la souris pendant au moins 1 semaine.
   2. Administrer 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée, une fois toutes les 24 heures pendant trois jours après la chirurgie.
   3. Laissez la plaie guérir complètement avant de retirer les sutures 7 à 10 jours après la chirurgie.
      REMARQUE: Il a été observé que les souris avec un taux élevé de glucose dans le LCR mettaient plus de temps à guérir. Couper les ongles sur les pattes postérieures de la souris minimise le risque de blessure au site de l’incision en raison du comportement de grattage des souris.

3. Remplacement des minipompes

REMARQUE: Étant donné que les minipompes utilisées dans cette étude ne durent que 4 semaines, le remplacement des minipompes a également été testé pour prolonger la durée de la perfusion de glucose, comme cela peut être nécessaire dans le cas d’études à long terme. Cela impliquait les étapes suivantes.

1. Préparez les souris pour la chirurgie comme détaillé ci-dessus.
2. Faites une petite incision verticale de 1 cm dans la peau légèrement au-dessus de la pompe.
3. Insérez un hémostatique sous la peau incisée et retirez la pompe.
4. Retirez la pompe du tube et connectez une nouvelle pompe amorcée au tube.
5. Réinsérez la pompe à l’intérieur et cousez la peau.
6. Suivez les mêmes instructions de soins postopératoires que celles décrites ci-dessus.

4. Procédure de collecte du LCA

1. Préparation
   1. Tirez des capillaires en verre de 1 mm de diamètre avec une machine à micropipettes pour obtenir des pointes de 0,5 mm de diamètre. Les paramètres sont les suivants : chaleur = 800, traction = 15, vitesse = 5 et temps = 200 unités. Placez les capillaires tirés dans une boîte stérile jusqu’à utilisation.
   2. Fixez une aiguille de 27 G à une seringue de 1 mL. Insérez le capillaire tiré sur l’aiguille et utilisez un petit ruban adhésif pour fixer la connexion.
   3. Fixez fermement la seringue dans un support capillaire d’un micromanipulateur.
   4. Ensuite, préparez la souris pour la chirurgie, comme décrit dans la procédure préopératoire ci-dessus.
2. Intervention chirurgicale
   1. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique. Après avoir fixé la tête sur le cadre, comme décrit précédemment, faites pivoter les boutons pour incliner la tête de sorte que le nez soit orienté vers le bas. Appliquez des champs stériles pour sécuriser la zone chirurgicale.
   2. Faites une petite incision sur la surface dorsale, en partant du plan intra-aural jusqu’au côté caudal.
      REMARQUE: Veillez à ne pas endommager la tubulure lors de l’incision.
   3. Retirez le support du corps de la souris et laissez la souris reposer verticalement afin que le cou soit complètement étendu dorsalement.
   4. À l’aide de pinces émoussées incurvées, coupez doucement les muscles postérieurs du cou à partir de la ligne médiane pour créer une petite fenêtre. Ensuite, utilisez un applicateur à embout de coton humide pour déplacer doucement les muscles du cou de la ligne médiane vers la périphérie.
   5. Observez si la citerne magna est exposée, qui apparaît comme une fenêtre triangulaire avec une membrane de dure-mère transparente.
   6. Placez l’ensemble micromanipulateur sur le cadre stéréotaxique à côté de la souris tout en vous assurant que l’extrémité capillaire ne touche aucune surface.
   7. Casser doucement l’extrémité capillaire sans perturber la configuration.
   8. Tout en regardant dans la loupe (grossissement de 2,25x), faites pivoter les boutons correspondants sur le micromanipulateur pour aligner lentement et déplacer l’extrémité capillaire vers la citerne magna.
   9. Une certaine résistance est ressentie une fois que l’extrémité capillaire touche la membrane de la citerne magna. Poussez très lentement la pointe contre la membrane à l’aide des boutons.
      REMARQUE: Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins de la membrane. Cette étape est très importante pour éviter toute contamination du sang dans le LCR.
   10. Percez très doucement la membrane. Le LCR commencera à couler dans le capillaire immédiatement en raison de la pression négative dans le capillaire.
   11. Laissez l’installation pendant quelques minutes jusqu’à ce que ~10 μL de LCR soit recueilli dans le capillaire.
   12. Ensuite, retirez lentement le capillaire de la citerne magna et appuyez doucement sur un applicateur à embout de coton stérile contre l’ouverture de la citerne magna pour arrêter la fuite de LCR.
   13. Retirez délicatement le capillaire de la seringue et fixez-le à un distributeur d’ampoules à microcapuchon. Appuyez sur l’ampoule pour transférer le LCR dans un tube microcentrifuge stérile.
   14. Placez un support sous la souris et faites pivoter les boutons stéréotaxiques pour niveler la tête.
   15. Fermez la plaie avec des sutures en nylon.
   16. Injecter 300 μL de solution saline stérile par voie sous-cutanée avant de retirer la souris de l’appareil.
   17. Donnez des soins postopératoires aux animaux comme décrit ci-dessus, jusqu’à ce qu’il soit temps de retirer les sutures - ~ 7-10 jours après la chirurgie.

5. Dosage de la glycémie

1. Suivez le protocole décrit dans le kit de dosage colorimétrique du glucose.
2. Diluer la solution tampon de phosphate de sodium fournie dans le kit à une concentration de 50 mM dans de l’eau ultra-pure.
3. Préparer les étalons de glucose dans des plages de 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 et 50 mg / dL à partir de la solution mère de 1 000 mg / dL fournie dans le kit dans une solution tampon diluée.
4. Préparer une dilution 7 fois des échantillons de LCR dans le tampon. Par exemple, si le volume total de LCR recueilli est de 10 μL, le volume dilué de sept fois sera de 70 μL.
5. Pipeter 15 μL d’étalons de glucose et de LCR dilué en double dans une plaque de 96 puits.
6. Pipeter 85 μL de tampon dilué dans chacun des puits avec étalons et LCR.
7. Ajouter 6 mL de tampon dilué dans le flacon de mélange d’enzymes calorimétriques au glucose et vorter pendant quelques secondes pour bien mélanger.
8. Ajouter 100 μL de la préparation du mélange enzymatique à chaque puits pour commencer la réaction.
9. Scellez la plaque avec une feuille de couverture et tapotez doucement sur la plaque pour mélanger les réactifs.
10. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 10 min. Les flacons avec une glycémie élevée commencent à devenir violets immédiatement.
11. Après 10 min, retirez le couvercle et mesurez l’absorbance à 500-520 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
12. Calculer la concentration de glucose dans les échantillons de LCR en interpolant leurs valeurs à partir de la courbe standard.

6. Test de glycémie

1. Faites une petite entaille latérale à la queue de la souris à l’aide d’une lame de rasoir et utilisez une goutte de sang pour mesurer la glycémie avec un glucomètre, selon les instructions du manuel.

Résultats

Des souris mâles ont été implantées avec une canule assemblée à une minipompe osmotique (Figure 1) pour perfuser chroniquement un aLCR ou une solution de glucose à 50% dans leurs ventricules latéraux (Figure 2). Le LCR a été prélevé 10 jours après la chirurgie (figure 3) afin de valider l’efficacité de cette procédure. Les résultats ont montré une augmentation des taux de glucose dans le LCR (moyenne: 327,7 mg / d...

Discussion

Cet article rapporte un protocole détaillé pour augmenter la glycémie du LCR chez la souris en utilisant des minipompes osmotiques connectées à une canule implantée dans le ventricule latéral. La perfusion chronique de glucose dans le cerveau de la souris par cette procédure sera utile pour délimiter les effets de l’hyperglycorrhachie à long terme sur la cognition, le métabolisme systémique du glucose et l’équilibre énergétique et pour mieux comprendre la pathogenèse des complications du diabète.

...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	Membrane solutions	SFPES030022S
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip)	BD	309628
1 mL TB syringe	BD	309659
100 mL Glass beaker	Fisher	N/a
100% Ethanol (Koptec)	DLI	UN170	Use 70% dilution to clean the surgery area
50 mL conical tube	Fisher	N/A
Allignment indicator	KOPF	1905
Alzet brain infusion kit	DURECT	Kit # 3; 0008851	Cut tubing in the kit to 1 inch length
Alzet osmotic pump	DURECT	2004	Flow rate 0.25 µL/h
Anesthesia system	Kent Scientific	SomnoSuite
Betadine solution	Avrio Health	N/A
CaCl2 . 2H2O	Fisher	C79-500
Cannula holder	KOPF	1966
Centering scope	KOPF	1915
Dental Cement Liquid	Lang Dental	REF1404
Dental cement Powder	Lang Dental	REF1220-C
D-glucose	Sigma	G8270
Electric drill	KOPF	1911	While drilling a hole avoid rupturing dura mater
Eye lubricant (Optixcare)	CLC Medica	N/A
Glass Bead sterilizer (Germinator 500)	VWR	101326-488	Place instruments in sterile water to let them cool before surgery
Glucose Assay Kit	Cayman chemical	10009582
H2O2	Sigma	H1009-500ml	Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible.
Hair Clipper	WAHL	N/A
heating pad	Heatpax	19520483
Hemostat	N/A	N/A
Isoflurane (Fluriso)	Zoetis	NDC1385-046-60
KCl	VWR	0395-500g
Magnetic stand	WPI	M1
Magnifying desk lamp	Brightech	LightView Pro Flex 2
Metal Spatula	N/A	N/A
MgCl2 . 6H2O	Fisher	BP214-500
Micromanipulator (Right handed)	WPI	M3301R
Micromanipulator with digital display	KOPF	1940
Na2HPO4 . 7H2O	Fisher	S373-500
NaCl	Sigma	S7653-5Kg
NaH2PO4 . H2O	Fisher	S369-500
Neosporin	Johnson & Johnson	N/A	Apply topical oinment to prevent infection
Parafilm	Bemis	DM-999
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml	Zoetis	N/A	5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia
Scalpel	N/A	N/A
Stereotaxic allignment system	KOPF	1900
Sterile 27 gauge needle	BD	305109
Sterile cotton tip applicators (Solon)	AMD Medicom	56200
Sterile nylon sutures (5.0)	Oasis	MV-661	Use non-absorable suture for closing the wound
Sterile sharp scissors	N/A	N/A
Sterile surgical blades	VWR	55411-050
Surgical gloves (Nitrile)	Ammex	N/A	Change gloves if there is suspision of contamination
Tray	N/A	N/A