Имплантация осмотического мини-насоса для повышения концентрации глюкозы в спинномозговой жидкости мыши

Резюме

В этой статье описан подробный протокол повышения концентрации глюкозы в спинномозговой жидкости (СМЖ) мышей. Этот подход может быть полезен для изучения влияния высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости на нейродегенерацию, когнитивные функции и периферический метаболизм глюкозы у мышей.

Аннотация

Диабет увеличивает риск снижения когнитивных функций и ухудшает работу мозга. Является ли эта связь между высоким уровнем глюкозы и когнитивным дефицитом причинно-следственной, остается неуловимым. Более того, также неясно, опосредованы ли эти дефициты повышением уровня глюкозы в спинномозговой жидкости (СМЖ) и/или крови. Существует очень мало исследований, изучающих прямое влияние высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости на функцию центральной нервной системы (ЦНС), особенно на обучение и память, поскольку современные модели диабета недостаточно развиты для решения таких исследовательских вопросов. В этой статье описывается метод хронического повышения уровня глюкозы в спинномозговой жидкости в течение 4 недель путем непрерывного введения глюкозы в боковой желудочек с использованием осмотических мини-насосов у мышей. Протокол был подтвержден путем измерения уровня глюкозы в спинномозговой жидкости. Этот протокол повышал уровень глюкозы в спинномозговой жидкости до ~ 328 мг / дл после инфузии 50% раствора глюкозы при скорости потока 0,25 мкл / ч по сравнению с концентрацией глюкозы в спинномозговой жидкости ~ 56 мг / дл у мышей, получавших искусственную спинномозговую жидкость (ликвор). Кроме того, этот протокол не влиял на уровень глюкозы в крови. Таким образом, этот метод может быть использован для определения прямого влияния высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости на функцию мозга или конкретный нейронный путь независимо от изменений уровня глюкозы в крови. В целом, подход, описанный здесь, будет способствовать разработке животных моделей для проверки роли высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости в опосредующих особенностях болезни Альцгеймера и / или других нейродегенеративных расстройств, связанных с диабетом.

Введение

Диабет 1 и 2 типа нарушает функцию мозга ^1,2,3. Например, диабет увеличивает риск снижения когнитивных функций и нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера ^3,4. Кроме того, люди с диабетом имеют дефектное восприятие глюкозы в головном мозге ^5,6. Этот дефект способствует патогенезу гипогликемии, связанной с неосведомленностью и недостаточным контррегуляторным ответом на гипогликемию^7,8, которая может привести к летальному исходу^, если ее не лечить немедленно.

Учитывая, что диабет повышает уровень глюкозы в крови, а также в спинномозговой жидкости (CSF)⁹, важно определить, способствует ли один или оба этих фактора нарушению функции мозга. Вопрос о том, вызывает ли диабет повреждение головного мозга из-за высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости отдельно или в сочетании с другими факторами, такими как дефицит инсулина или резистентность к инсулину, также остается открытым. Животные модели диабета 1 и 2 типа демонстрируют снижение когнитивных функций и нейродегенерацию в дополнение к нарушенному энергетическому балансу и периферическому метаболизму глюкозы^10,11,12,13. Однако из этих моделей невозможно отделить селективные эффекты высокого уровня глюкозы в спинномозговой жидкости от уровня глюкозы в крови при опосредовании осложнений диабета на функцию мозга.

В этом протоколе описываются методы разработки мышиной модели гипергликорахии для проверки влияния хронически высоких уровней глюкозы в спинномозговой жидкости на функцию мозга, энергетический баланс и гомеостаз глюкозы. Мышиная модель, разработанная с помощью этого метода, представляет собой инструмент для исследований, изучающих этиологическую роль нерегулируемого гомеостаза глюкозы в нервной и поведенческой функции.

Поэтому предложенный подход будет полезен для понимания прямых эффектов повышенного уровня глюкозы в спинномозговой жидкости при различных патофизиологических состояниях.

протокол

Все процедуры на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Рочестера и были выполнены в соответствии с рекомендациями Службы общественного здравоохранения США по гуманному уходу и использованию экспериментальных животных. Шестинедельные самцы мышей C57BL / 6J, использованные для этого исследования, были коммерчески получены. Все животные были размещены в группах (по 5 мышей в клетке) в комнате с 12-часовым циклом день/ночь и получили доступ к пище и воде ad libitum. После того, как мышам была имплантирована канюля для вливания глюкозы в боковой желудочек, они были размещены в одном месте, чтобы предотвратить любое повреждение имплантатов от других мышей.

1. Сборка осмотических мининасосов

1. Подготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF) в соответствии со следующим протоколом. Растворяют NaCl (8,66 г), KCl (0,224 г), CaCl 2,2H 2 O (0,206 г) и MgCl 2,6H 2 O (0,163 г) в 500 мл стерильной воды для приготовления раствора A. Растворяют Na 2 HPO 4,7H 2 O (0,214 г) и ₂ PO₄. Н2О (0,027 г) в 500 мл стерильной воды для приготовления раствора В. Затем смешайте растворы А и В в соотношении 1:1, чтобы приготовить ликвор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот состав aCSF не содержит глюкозы.
2. Чтобы приготовить 50% раствор глюкозы, добавьте 50 г глюкозы к 50 мл ликвора в стакане. Поместите стакан на горячую плиту и доведите температуру суспензии до 60 °C. Смешайте суспензию магнитной мешалкой до полного растворения глюкозы.
3. Добавьте ликвор в стакан, чтобы получить окончательный объем 100 мл. Пропустите раствор через пористый фильтр 0,22 мкм, чтобы стерилизовать его.
4. Приготовьте 0,9% физиологический раствор (NaCl) и пропустите раствор через фильтр 0,22 мкм.
5. Поместите все компоненты мини-насоса и инфузионного набора в стерильный лоток и отрежьте стерильными ножницами трубку от набора для инфузии мозга до 1 дюйма в длину. Держите трубку стерильным гемостатом и надавите на верхнюю часть одного конца канюли. Подсоедините другой конец трубки к верхней стороне модулятора потока. Покройте оба конца трубки небольшим количеством клея для более прочного соединения.
6. Прикрепите иглу 27 г к шприцу объемом 1 мл и заполните его либо ликвором, либо раствором глюкозы. Вставьте иглу 27 G в небольшой кусочек трубки. Затем подсоедините трубку к открытому концу модулятора потока и наполните ее соответствующим раствором до тех пор, пока капли раствора не начнут выходить из канюли. Удалите все пузырьки воздуха, попавшие в трубку.
7. Чтобы наполнить мини-насос, держите насос в вертикальном положении и вставьте иглу шприца в насос. Заполняйте его соответствующим раствором до тех пор, пока при открытии мини-насоса не начнет образовываться капля раствора.
8. Медленно вставьте модулятор потока в насос, следя за тем, чтобы в узел не попадали пузырьки воздуха.
9. После того, как осмотический мини-насос собран, перенесите их в коническую трубку объемом 50 мл. Заполните пробирку стерильным физиологическим раствором так, чтобы насосы были полностью погружены в воду, следя за тем, чтобы канюля не попадала в физиологический раствор. Четыре таких насоса в сборе могут быть размещены в одной трубке объемом 50 мл.
10. Неплотно наденьте крышку на каждую трубку и инкубируйте насосы при 37 °C для заправки в течение не менее 48 часов.

2. Операция по имплантации осмотических насосов

1. Предоперационная процедура
   1. Стерилизуйте хирургические инструменты в автоклаве и дайте им остыть не менее 30 минут перед использованием. Условия автоклава включают стерилизацию паром при 121 °C в течение 30 минут.
   2. Продезинфицируйте операционную область 70% этанолом. Протрите ручки, амбушюры и поверхность стереотаксической оправы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое вмешательство следует проводить в асептической среде, не допуская прикосновения к нестерильным поверхностям во время операции. Замените перчатки, если есть подозрение на загрязнение.
   3. Поместите мышь в анестезиологическую камеру, чтобы обезболить ее 3% изофлураном, смешанным с воздухом, в течение 3-5 минут. Затем извлеките мышь из камеры и поместите ее на стерильную драпировку. Поддерживайте анестезию через носовой колбочку на уровне 1,5%-2%.
   4. Ущипните мышь за заднюю лапу, чтобы соблюсти какой-либо рефлекс и проверить глубину анестезии.
   5. Вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно для обезболивания.
   6. Используйте чистые машинки для стрижки, чтобы закрепить операционную область на голове мыши. Протрите кожу головы сначала раствором повидон-йода, а затем спиртовыми тампонами в течение не менее 2 минут. Повторите этот процесс не менее трех раз.
   7. Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз во время операции.
2. Хирургия
   1. Поместите мышь на стереотаксическую рамку и установите голову на резц. Прикройте нос носовым конусом. Наложите стерильные простыни, чтобы обезопасить операционную область.
   2. Сместите поток изофлурана к носовому конусу. Продолжайте поддерживать анестезию на уровне 1,5%-2% изофлурана.
   3. Подложите под мышь грелку, чтобы поддерживать температуру тела.
   4. Наденьте новые стерильные перчатки и скальпелем сделайте разрез по средней линии (~10-15 мм длиной) на коже головы. Обнажьте поверхность черепа шпателем, используя ватные наконечники, чтобы вытереть кровотечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прижигатель при обильном кровотечении, что бывает редко.
   5. Потрите ватным кончиком, смоченным в 3% перекиси водорода, чтобы обнажить черепные швы.
   6. Обратите внимание на брегму и лямбду, чтобы ориентироваться в координатах черепа. Установите все координаты равными нулю в bregma.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти координаты были получены из атласа мозга^{мыши 14}. Эталонное расстояние брегма-лямбда в атласе составляет 4,21 мм. Чтобы скорректировать возрастные и половые различия в размере черепа, расстояние брегма-лямбда для каждой мыши было измерено, а затем разделено на 4,21 мм для получения коэффициента умножения. Например, если расстояние между брегмой и лямбдой составляло 4,65 мм, то деление на 4,21 мм давало коэффициент умножения 1,10. Все координаты, полученные из атласа, затем были умножены на этот коэффициент, чтобы измерить фактические координаты, которые использовались для бурения скважины. В приведенном выше примере результирующие передне-задние (AP) и медиально-латеральные (ML) координаты будут составлять 0,55 и 1,1 мм соответственно (т.е. 1,1 x 0,5 или 1 мм).
   7. Используйте электрическую дрель, чтобы сделать отверстие в следующих координатах: 0,5 мм кзади от брегмы и 1 мм сбоку от средней линии справа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сверля отверстие в черепе, будьте осторожны, чтобы не разорвать твердую мозговую оболочку. Убедитесь, что сверло стерильно. Его можно поместить вместе с другими инструментами в тот же мешочек автоклава для стерилизации.
   8. Вставьте гемостат под надрезанную кожу и прижмите его к месту, куда будет имплантирован осмотический мини-насос. Аккуратно открывайте и закрывайте гемостат, чтобы получился карман для мини-насоса.
   9. Используйте стерильный гемостат, чтобы выбрать заправленный осмотический мини-насос с наконечника модулятора потока. Протолкните насос через надрезанную кожу в карман.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы насос и канюля не касались нестерильной поверхности.
   10. Нанесите немного клея на нижнюю сторону канюли и закрепите ее в держателе канюли. Медленно опустите канюлю через просверленное отверстие 2 мм вентрально к поверхности черепа. Оставьте его там минимум на 5 минут, чтобы клей затвердел.
   11. Прежде чем вставлять канюлю в мозг, убедитесь, что канюля не забита и что раствор течет правильно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда глюкоза может осаждаться на кончике канюли из-за очень низкой скорости потока, блокируя поток.
   12. С помощью ножниц обрежьте верхнюю часть канюли, следя за тем, чтобы она не смещалась с поверхности черепа.
   13. Покройте канюлю слоем стоматологического цемента для дополнительной поддержки.
   14. Используйте нейлоновые швы (размер 5-0 и длина 30 дюймов), чтобы закрыть рану, и нанесите на рану местный антибиотик, чтобы предотвратить инфекцию.
   15. Выключите изофлуран и дайте животному восстановиться после анестезии. Затем переведите животное в новую чистую клетку.
3. Послеоперационный уход
   1. После операции наблюдайте за мышью не менее 1 недели.
   2. Вводите 5 мг / кг карпрофена подкожно один раз каждые 24 часа в течение трех дней после операции.
   3. Дайте ране полностью зажить перед снятием швов через 7-10 дней после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что мышам с высоким уровнем глюкозы в спинномозговой жидкости требовалось больше времени для заживления. Обрезка когтей на задних лапах мыши сводит к минимуму вероятность травмы места разреза из-за царапающего поведения мышей.

3. Замена мини-насосов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мини-насосы, используемые в этом исследовании, работают только в течение 4 недель, замена мини-насосов также была протестирована для увеличения продолжительности инфузии глюкозы, поскольку это может потребоваться в случае долгосрочных исследований. Для этого были предприняты следующие шаги.

1. Подготовьте мышей к операции, как описано выше.
2. Сделайте небольшой вертикальный разрез в 1 см на коже немного выше помпы.
3. Вставьте гемостат под надрезанную кожу и вытащите насос.
4. Снимите насос с трубки и подсоедините новый заправленный насос к трубке.
5. Вставьте помпу обратно внутрь и сшите кожу.
6. Следуйте тем же инструкциям по послеоперационному уходу, которые описаны выше.

4. Порядок сбора спинномозговой жидкости

1. Подготовка
   1. Вытяните стеклянные капилляры диаметром 1 мм с помощью съёмника микропипеток, чтобы получить наконечники диаметром 0.5 мм. Настройки: тепло = 800, тяга = 15, скорость = 5 и время = 200 единиц. Поместите вытянутые капилляры в стерильную коробку до использования.
   2. Прикрепите иглу 27 г к шприцу объемом 1 мл. Вставьте натянутый капилляр на иглу и используйте небольшую клейкую ленту, чтобы закрепить соединение.
   3. Прочно зафиксируйте шприц в капилляродержателе микроманипулятора.
   4. Затем подготовьте мышь к операции, как описано в предоперационной процедуре выше.
2. Хирургическое вмешательство
   1. Поместите мышь на стереотаксическую рамку. После фиксации головы на раме, как описано ранее, поверните ручки, чтобы наклонить голову так, чтобы нос был обращен вниз. Наложите стерильные простыни, чтобы обезопасить операционную область.
   2. Сделайте небольшой разрез на дорсальной поверхности, начиная от внутрислуховой плоскости к каудальной стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить трубку во время разреза.
   3. Снимите опору с тела мыши и дайте мыши отдохнуть вертикально, чтобы шея была полностью вытянута дорсально.
   4. С помощью изогнутых тупых щипцов аккуратно разделите пополам задние мышцы шеи от средней линии, чтобы создать небольшое окошко. Затем используйте влажный аппликатор с ватным наконечником, чтобы аккуратно переместить мышцы шеи от средней линии к периферии.
   5. Обратите внимание, обнажается ли большая цистерна, которая выглядит как треугольное окно с прозрачной мембраной твердой мозговой оболочки.
   6. Поместите узел микроманипулятора на стереотаксическую рамку рядом с мышью, убедившись, что наконечник капилляра не касается какой-либо поверхности.
   7. Аккуратно разорвите наконечник капилляра, не нарушая настройку.
   8. Глядя в увеличительное стекло (увеличение 2,25x), поверните соответствующие ручки на микроманипуляторе, чтобы медленно выровнять и переместить наконечник капилляра к большой цистерне.
   9. Некоторое сопротивление ощущается, когда наконечник капилляра касается большой мембраны цистерны. Очень медленно прижмите наконечник к мембране с помощью ручек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить кровеносные сосуды в мембране. Этот шаг очень важен, чтобы избежать загрязнения крови в спинномозговой жидкости.
   10. Очень аккуратно прокалывают мембрану. Спинномозговая жидкость сразу начнет поступать в капилляр из-за отрицательного давления в капилляре.
   11. Оставьте установку на несколько минут, пока ~ 10 мкл спинномозговой жидкости не соберется в капилляре.
   12. Затем медленно вытяните капилляр из большой цистерны и осторожно прижмите стерильный аппликатор с ватным наконечником к отверстию большой цистерны, чтобы остановить утечку спинномозговой жидкости.
   13. Осторожно извлеките капилляр из шприца и приложите его к дозатору колбы с микроколпачком. Нажмите на колбу, чтобы перенести спинномозговую жидкость в стерильную микроцентрифужную пробирку.
   14. Подложите под мышь опору и вращайте стереотаксические ручки, чтобы выровнять голову.
   15. Закройте рану капроновыми швами.
   16. Введите 300 мкл стерильного физиологического раствора подкожно, прежде чем извлекать мышь из аппарата.
   17. Обеспечьте послеоперационный уход за животными, как описано выше, до тех пор, пока не придет время снимать швы - ~ 7-10 дней после операции.

5. Анализ глюкозы

1. Следуйте протоколу, описанному в наборе для колориметрического анализа глюкозы.
2. Разбавьте буферный раствор фосфата натрия, входящий в комплект, до концентрации 50 мМ в сверхчистой воде.
3. Приготовьте стандарты глюкозы в 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 и 50 мг / дл в диапазоне от исходного раствора 1000 мг / дл, предоставленного в наборе, в разбавленном буферном растворе.
4. Приготовьте 7-кратное разведение образцов ликвора в буфере. Например, если общий объем собранной спинномозговой жидкости составляет 10 мкл, то семикратный разбавленный объем составит 70 мкл.
5. Пипетка 15 мкл стандартов глюкозы и разведенный ликвор в двух экземплярах в 96-луночном планшете.
6. Пипетка 85 мкл разбавленного буфера в каждую из лунок со стандартами и ликвором.
7. Добавьте 6 мл разбавленного буфера во флакон со смесью калориметрических ферментов глюкозы и перемешивайте его в течение нескольких секунд, чтобы тщательно перемешать.
8. Добавьте по 100 мкл препарата ферментной смеси в каждую лунку, чтобы начать реакцию.
9. Запечатайте пластину покровным листом и аккуратно постучите по пластине, чтобы перемешать реагенты.
10. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 10 минут. Флаконы с высоким содержанием глюкозы сразу же начинают окрашиваться в фиолетовый цвет.
11. Через 10 минут снимите крышку и измерьте коэффициент поглощения на длине волны 500-520 нм с помощью считывателя пластин.
12. Рассчитайте концентрацию глюкозы в образцах ликвора, интерполируя их значения со стандартной кривой.

6. Анализ глюкозы в крови

1. Сделайте небольшую боковую зазубрину к хвосту мыши с помощью лезвия бритвы и используйте каплю крови для измерения уровня глюкозы в крови глюкометром, согласно инструкции по эксплуатации.

Результаты

Самцам мышей имплантировали канюлю, собранную в осмотической мини-помпе (рис. 1), для хронической инфузии спинномозговой жидкости или 50% раствора глюкозы в боковые желудочки (рис. 2). Спинномозговая жидкость была собрана через 10 дней после операции (

Обсуждение

В этой статье представлен подробный протокол повышения уровня глюкозы в спинномозговой жидкости у мышей с помощью осмотических мини-насосов, подключенных к канюле, имплантированной в боковой желудочек. Хроническая инфузия глюкозы в мозг мыши с помощью этой процедуры будет полезна дл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	Membrane solutions	SFPES030022S
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip)	BD	309628
1 mL TB syringe	BD	309659
100 mL Glass beaker	Fisher	N/a
100% Ethanol (Koptec)	DLI	UN170	Use 70% dilution to clean the surgery area
50 mL conical tube	Fisher	N/A
Allignment indicator	KOPF	1905
Alzet brain infusion kit	DURECT	Kit # 3; 0008851	Cut tubing in the kit to 1 inch length
Alzet osmotic pump	DURECT	2004	Flow rate 0.25 µL/h
Anesthesia system	Kent Scientific	SomnoSuite
Betadine solution	Avrio Health	N/A
CaCl2 . 2H2O	Fisher	C79-500
Cannula holder	KOPF	1966
Centering scope	KOPF	1915
Dental Cement Liquid	Lang Dental	REF1404
Dental cement Powder	Lang Dental	REF1220-C
D-glucose	Sigma	G8270
Electric drill	KOPF	1911	While drilling a hole avoid rupturing dura mater
Eye lubricant (Optixcare)	CLC Medica	N/A
Glass Bead sterilizer (Germinator 500)	VWR	101326-488	Place instruments in sterile water to let them cool before surgery
Glucose Assay Kit	Cayman chemical	10009582
H2O2	Sigma	H1009-500ml	Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible.
Hair Clipper	WAHL	N/A
heating pad	Heatpax	19520483
Hemostat	N/A	N/A
Isoflurane (Fluriso)	Zoetis	NDC1385-046-60
KCl	VWR	0395-500g
Magnetic stand	WPI	M1
Magnifying desk lamp	Brightech	LightView Pro Flex 2
Metal Spatula	N/A	N/A
MgCl2 . 6H2O	Fisher	BP214-500
Micromanipulator (Right handed)	WPI	M3301R
Micromanipulator with digital display	KOPF	1940
Na2HPO4 . 7H2O	Fisher	S373-500
NaCl	Sigma	S7653-5Kg
NaH2PO4 . H2O	Fisher	S369-500
Neosporin	Johnson & Johnson	N/A	Apply topical oinment to prevent infection
Parafilm	Bemis	DM-999
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml	Zoetis	N/A	5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia
Scalpel	N/A	N/A
Stereotaxic allignment system	KOPF	1900
Sterile 27 gauge needle	BD	305109
Sterile cotton tip applicators (Solon)	AMD Medicom	56200
Sterile nylon sutures (5.0)	Oasis	MV-661	Use non-absorable suture for closing the wound
Sterile sharp scissors	N/A	N/A
Sterile surgical blades	VWR	55411-050
Surgical gloves (Nitrile)	Ammex	N/A	Change gloves if there is suspision of contamination
Tray	N/A	N/A