自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

要約

プロトコルは自由に動く意識のマウスの細胞外の電気生理学的な特性を明らかにするための運動皮質(MC)の細胞外記録の方法論を、またローカル視野の潜在性(LFPs)および興味の行動の根底にあるネットワークの神経活動を評価するために有用であるスパイクのデータ分析記述する。

要約

プロトコルは自発的および/または特定の行動と電気生理学的な信号を関連付けることによって特定の仕事を遂行するマウスをすることのニューロンの発火およびネットワークローカル電界電位(LFP)の特性を明らかにすることを向ける。この手法は、これらの行動の根底にあるニューロンネットワーク活動を研究する上で貴重なツールとなります。本稿では、自由に動く意識のあるマウスにおける電極の埋め込みとそれに伴う細胞外記録の詳細かつ完全な手順について解説しています。この研究には、微小電極アレイを埋め込むための詳細な方法、マルチチャンネルシステムを使用して運動皮質(MC)内のLFPとニューロンスパイク信号をキャプチャし、その後のオフラインデータ分析が含まれます。意識のある動物におけるマルチチャンネル記録の利点は、より多くのスパイクニューロンおよびニューロンサブタイプを取得して比較できることであり、これにより、特定の行動と関連する電気生理学的信号との関係を評価できる。特に、本研究で説明したマルチチャンネル細胞外記録技術およびデータ解析手順は、行動マウスの実験を行う際に、他の脳領域にも適用できる。

概要

細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています¹。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニュー^{ラルコーディング2}にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています^3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します⁵。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります^6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP信号を迅速かつ簡単に計算するための一般的なソフトウェアを使用して、マイクロドライブシステムを作成し、パラメータを設定する方法に関する初心者向けの情報を提供します。

頭皮から記録された脳波(EEG)やイベント関連電位(ERP)などによる脳機能の非侵襲的記録は、ヒトやげっ歯類の研究で広く使用されてきましたが、EEGおよびERPデータは空間的および時間的特性が低いため、特定の脳領域内の近くの樹状突起シナプス活動によって生成される正確な信号を検出することはできません¹.現在、意識のある動物のマルチチャンネル記録を利用することで、霊長類やげっ歯類の脳にマイクロドライブシステムを移植することで、脳の深層部の神経活動を慢性的かつ漸進的に記録することができます1,2,3,4,5,6,7,8,9 .簡単に言うと、研究者は、脳の異なる部分を標的とするために、電極または四極管の独立した位置決めに使用できるマイクロドライブシステムを構築することができる^10,11。例えば、Changらは、軽量でコンパクトなマイクロドライブ¹²を組み立てることによって、マウスのスパイクおよびLFPを記録する技術を記述した。さらに、行動課題中のげっ歯類における複数の単一ニューロンおよびLFPを記録するために、カスタムメイドの付属部品を備えた微細加工されたシリコンプローブが市販されている¹³。マイクロドライブシステムの組み立てにはさまざまな設計が使用されてきましたが、マイクロドライブシステム全体の複雑さと重量の点で、これらの成功はまだ限られています。例えば、Lansinkらは、単一の脳領域から記録するための複雑な構造を有するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを示した¹⁴。佐藤らは、自動油圧位置決め機能¹⁵を表示するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを報告した。これらのマイクロドライブシステムの主な欠点は、マウスが自由に動くには重すぎることと、初心者には組み立てが難しいことです。マルチチャンネルの細胞外記録は、行動テスト中の神経活動を測定するのに適しており効率的な技術であることが示されていますが、複雑なマイクロドライブシステムによって取得された信号を初心者が記録および分析することは容易ではありません。自由に動くマウス^16,17では、マルチチャンネルの細胞外記録とデータ解析の全操作プロセスを開始することが困難であることを考慮し、本稿では、簡略化されたガイドラインを提示し、一般的に入手可能なコンポーネントと設定を使用してマイクロドライブシステムを作成する詳細なプロセスを紹介します。また、スパイク信号とLFP信号を高速かつ簡単に計算するための共通ソフトウェアのパラメータも提供されています。さらに、このプロトコルでは、ヘリウムバルーンの使用によりマウスを自由に動かすことができ、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺することに貢献します。本研究では、マイクロドライブシステムを簡単に構築し、記録とデータ解析のプロセスを最適化する方法について概説する。

プロトコル

すべてのマウスを商業的に入手し、室温22〜25°C、相対湿度50%〜60%で12時間の明/12時間の暗サイクル(現地時間午前8:00に点灯)で維持した。マウスは、餌と水を継続的に供給することができた。すべての実験は、華南師範大学の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、施設動物倫理委員会によって承認されました。生後3-5ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを用いた。

1. マイクロドライブシステム組立

1. 2つのスタルと可動マイクロドライブを固定するネジを使用して、2つのコンピュータ設計ボードを接続し、コネクタを1つのボードに取り付けます(図1A、Bi-iii)。ネジ(0.5 mm/円)をひねってマイクロドライブを駆動します。
2. マイクロドライブがMC領域の両側に8本のガイドチューブ(長さ~3 cm、内径~50 μm、外径~125 μm)を2セット搭載できることを確認し、同じ長さ(少なくとも15 mm; 図1Biv, v)。
3. 直径35μmのNiクロム線(~5cm)を16本切断し、ガイドチューブに連続して装填し、接着剤を塗布して固定します(図1Bi、vi、vii)。
4. ワイヤの絶縁体を剥がし、チャネル マップに従ってコネクタから各ピンに露出した各ワイヤ、基準電極、および接地電極を連続的に撚り合わせ、各ピンに導電性塗料をゆっくりとコーティングします(図 1Bviii-x)。
5. エポキシ樹脂を使用してピンを覆い(図1Axi、xii)、インピーダンステスターを介して金メッキを行い、電極チップのインピーダンスを~350kΩに低減します(図1Bxiii、xiv)。インピーダンステスターのパラメータを次のように設定します:-10.08 μAの直流、1秒間、金めっき溶液、5 mM PtCl₄を含む。
6. 最後に、ネジをひねってマイクロドライブを上部に移動します。 図1A に示すように変更したマイクロドライブシステムの全体的なサイズを確認します(長さ約15 mm、幅10 mm、高さ20 mm、重量~1 g)。コンピュータ設計基板と可動部品の詳細な仕様を 図1Ai、ii.で確認する。

2. 電極アレイの埋め込み

1. 手術キットを滅菌し、滅菌手袋を着用し、手術開始前に医師の滅菌白衣を着用してください。
2. 痛みを管理するには、誘導チャンバー内のマウスにメロキシカム注射剤(5 mg / kg)の皮下注射を使用します。.次に、誘導チャンバー18,19でペントバルビタール(80 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけます。つま先のつまみ反射がまだ存在する場合は、ペントバルビタール(20 mg / kg / h)の追加用量を適用します。.
3. マウスを脳定位固定装置に固定し、温度コントローラーを使用して直腸温度を37°Cに保ちます。
4. テトラサイクリン眼軟膏をマウスの両眼に塗布し、手術前に滅菌手袋を再度交換します。
5. マウスの毛皮を剃り、先端が滅菌した綿のアプリケーターを使用して、中心から外側に向かって同心円状にベタジンスクラブとアルコールを交互に3回交互に手術部位を消毒します(図2i、ii)。頭蓋骨を露出させるために、小さな正中線切開(~15 mm)を行います。すぐに、痛みを和らげるために1%リドカインを首の筋肉に局所的に塗布します。.次に、ハサミを使用して残存組織を取り除き、生理食塩水でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨を洗浄します(図2iii)。
6. インクを充填したガラス微小電極を使用して、両側MCの埋め込みに必要な位置に印を付けます(図2iv、v)。以前の研究20に基づくと、両側MCの位置は次のとおりです:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側^1.25 mm。
7. マイクロドライブシステムを保護するために4本のステンレス鋼ネジ(直径0.8 mm)を埋め込み、すべてのネジを基準電極と接地電極でリンクし、次に混合歯科用セメントで覆って壁を形成します(図2vi-xi)。
8. MC領域の調整された頭蓋骨の左側と右側の両方に頭蓋骨ドリルを使用して、2つの小さな穴(~1.5 mm²)を慎重に開けます(図2xii)。左右MCの脳定位座標を使用します:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm、硬膜の腹側0.5 mm。
9. 細かい鉗子で硬膜を穴から慎重に取り外します(図2xiii)。
10. マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロドライブシステムを10 μm/sで穴の中央に挿入します(図2xiv-xvii)。
11. マイクロドライブシステムの挿入が終わったら、ワセリンを歯科用セメントの壁に充填します(図2xviii)。
12. マイクロドライブシステムの底板と歯科用セメントの壁を混合歯科用セメントで接合します(図2xix)
13. 切開部を生理食塩水で洗浄した後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所処理を行い、術後の痛みを和らげます。
14. 導電性銅箔テープを埋め込み型マイクロドライブシステムに巻き付けます(図2xx)。
15. マウスを31〜33°Cに保たれたケージに移動し、麻酔からの回復をモニターします。
16. マウスを1週間回復させ、別々の給餌を行います。塩酸リンコマイシンと塩酸リドカインを含むゲルを3日間連続して塗布して切開部を確認し、治療します。

3. 自由動マウスの両側MCにおけるマルチチャンネル記録

1. 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。少なくとも1日前に、マイクロドライブシステム(図1Aii)の可動部分のネジをひねって、電極アレイ(~0.1mmの深さ)を下に移動します。
2. 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。ヘッドステージの中央とヘリウムバルーン(約0.02Lのヘリウム充填)をネジでリンクして、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺します(図3A、B)。
3. 録音ソフトウェアで30kHzでサンプリングすることにより、記録電極とマルチチャンネルシステムを使用して生信号をキャプチャし、マルチチャンネルシステムからデジタルアナログ(DA)コンバーターを使用してデジタル化します。
4. 録音ソフトウェアで 10 kHz でリサンプリングして生データから LFP 信号を抽出し、録音ソフトウェアのノッチ フィルターを使用して 50 Hz のライン ノイズを除去します。
5. 自由に動くマウスから安定した状態で生データを少なくとも60秒間記録します。記録が終了したら、ヘッドステージとマイクロドライブシステム間の接続をゆっくりと取り外し、マウスをホームケージに戻します。
6. 記録したデータをコンピュータに保存し、オフラインで解析します(図4 、 図5)。
7. 実験終了後、研究所のガイドラインに従って安楽死を行い、3V出力の電源で電極の位置を確認し、1分間の電解病変を行い、その後組織学的解析を行います。凍結ミクロトームを用いてマウスの脳を30μmのスライスに切断し、MC切片を採取した後、顕微鏡で画像を撮影します(図3C、D)。

4. スパイクの選別と分析

1. スパイクソーティングソフトウェアで [File]>[Open > Nev files ]をクリックして、30 kHzでサンプリングされたスパイクデータを開きます(図4Ai)。
2. 「情報」をクリックしてソートされていないチャネルを選択し、「 ソート」>「ソート方法の変更」>「K-Meansの使用」を選択します。 K-Means Sorting>Valley-Seeking Sorting ボタンを押して、ソートされたユニットを取得します(図4Aii、iii)。
3. [File] > [Save as] をクリックし、ソートされたスパイク データをファイル名拡張子 .nev で保存し、[File] > [Export Per-Waveform Data] を選択して、.txtファイル名拡張子で PCA 結果をエクスポートします(図 4Aiv)。
4. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File]>[Import Data > Blackrock File ]をクリックして、ソートされたスパイクファイルを開きます(図4Bi)。
5. [ 解析]>[オートコレログラム ]をクリックして、選択したユニットのオートコレログラムを取得し、パラメータを-0.05秒のX最小値、0.05秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bii、iii)。
6. ソートされたスパイクデータをロードし、[ Analysis] > Interspike Interval Histograms をクリックしてスパイク間隔ヒストグラムを取得し、パラメータを0秒の最小間隔値、0.1秒の最大間隔値、0.001のBin値に設定します(図4Biv、v)。
7. Analysis > Crosscorrelogramsをクリックして、ソートされた2つの単位事象間のクロス相関図を取得し、参照事象とパラメータを-0.1秒のX最小値、0.1秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bvi、vii)。
8. [結果] > [数値結果] をクリックして、オートコレログラム、スパイク間間隔ヒストグラム、およびクロス相関図の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図 4Bviii、ix)。データを解析し、グラフを描画します。

5. LFP分析

1. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File][Import Data > Blackrock File ]をクリックして、10 kHzでサンプリングされた連続信号データを開きます(図5Ai)。
2. [ Analysis > Spectrum for Continuous ] をクリックして、選択したチャネルからの LFP のパワー スペクトルを解析します。パラメータを次のように設定します:8,192の周波数値の数、3-5の複数のテーパー値、総パワースペクトル密度(PSD)のパーセンテージの正規化、および1Hzから100Hzまでの周波数範囲(図5Aii、iii)。
3. [ Analysis > Coherence for Continuous ] をクリックして、MC の左側と右側から 2 つの LFP のコヒーレンスを解析します。 リファレンスチャンネルとパラメータを次のように設定します。 コヒーレンス値、周波数値の数を8,192、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hzから100Hzで計算します(図5Aiv、 v).
4. MC の左側と右側から 2 つの LFP 間の相関関係を分析するには 、[Analysis > Corr. with Cont. Variables ] をクリックします。 基準チャンネル(LFPデータ)とパラメータを、X最小値を-0.1秒、X最大値を0.1秒、ビン値を0.001に設定します(図5Avi、 vii)。
5. [結果]>[数値結果]をクリックして、PSD、コヒーレンス、および相関の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Aviii、ix)。
6. 各周波数帯域について代表的なトレースを抽出する必要があるチャンネルを選択し、[連続変数のデジタルフィルタリング>編集]をクリックして各周波数帯域を取得し、パラメータを[Filter Freq. Response as Bandpass]、[Filter Implementation]を無限インパルス応答(IIR)Butterworth、[Filter Order]の値を2に設定します。最後に、対象となる周波数範囲を設定します(図5Bi-iv)。
   注:ここで使用された周波数範囲は、デルタ(δ、1-4 Hz)、シータ(θ、5-12 Hz)、ベータ(β、13-30 Hz)、低ガンマ(低γ、30-70 Hz)、および高ガンマ(高γ、70-100 Hz)の発振です。
7. データを分析してグラフを描画します。

6. スパイクとLFPの相関関係

1. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで 、>データのインポート>ブラックロックファイルの ファイルをクリックして、連続信号データとスパイクデータを開きます。
2. [Analysis] > [Coherence Analysis] をクリックして 、選択したチャネルのスパイクと LFP の間のコヒーレンスを解析します。参照変数(スパイクタイミング)とパラメータを次のように設定します:コヒーレンス値、周波数値の数を512、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hz〜100Hzで計算します(図5Ci、ii)。
3. [結果]>[数値結果]をクリックして、スパイクフィールドの一貫性の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Ciii、iv)。
4. データを分析してグラフを描画します。

結果

ハイパス(250Hz)フィルタを適用して、生の信号からマルチユニットスパイクを抽出しました(図6A)。さらに、PCAでソートした正常マウスのMCから記録された単位を検証し(図7A-D)、マウスのMCにおける単位の谷幅と波形持続時間を記録した。その結果、マウスのMC推定錐体ニューロン(Pyn)の谷幅と波形持続時間の両方が、推定介?...

ディスカッション

自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられてきましたが、初心者が信号を記録して解析することはまだ非常に困難です。本研究では、マイクロドライブシステムの作成と電極注入の簡易ガイドラインと、スパイクソーティングソフトウェアと神経生理学的データ解析用ソフトウェア を介して 電気信号を捕捉および分析するため?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.54 mm pin header	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	1 x 5	Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	To optimize images from GraphPad.
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.
Brass nut	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 brass nut	The nut fixes the position of screw.
Brass screw	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 x 11 mm brass screw	A screw that hold the movable micro-drive.
C57BL/6J	Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD.	N/A	12 weeks of age.
Centrifuge tube	Biosharp	15 mL; BS-150-M	To store mice brain with sucrose sulutions.
Conducting paint	Structure Probe, Inc.	7440-22-4	To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.
Conductive copper foil tape	3M	1181	To reduce interferenc.
Connector	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	2 x 10P	To connect the headtage to micro-drive system.
DC Power supply	Maisheng	MS-305D	A power device for  electrolytic lesion.
Dental cement	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	N/A	To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation.
Digital analog converter	Blackrock	128-Channel	A device that converts digital data into analog signals.
Epoxy resin	Alteco	N/A	To cover pins.
Excel	Microsoft	N/A	To summarize data after analysis.
Eye scissors	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or cutting the Ni-chrome wire.
Fine forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery.
Forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or assembling the mirco-drive system.
Freezing microtome	Leica	CM3050 S	Cut the mouse’s brain into slices
Fused silica capillary tubing	Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd.	TSP050125	To  serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.
Glass microelectrode	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	To mark the desired locations for implantation using the filled ink.
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	To analyze and visualize the results.
Guide-tube	Polymicro technologies	1068150020	To load Ni-chrome wires.
Headstage	Blackrock	N/A	A tool of transmitting signals.
Helium balloon	Yili Festive products Co., Ltd.	24 inch	To offset the weight of headstage and micro-drive system.
Ink	Sailor Pen Co.,LTD.	13-2001	To mark the desired locations for implantation.
Iodine tincture	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To disinfect mouse's scalp.
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine  hydrochloride gel	Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd.	10g	A drug used to reduce inflammation.
Meloxicam	Vicki Biotechnology Co., Ltd.	71125-38-7	To reduce postoperative pain in mice.
Micromanipulators	Scientifica	Scientifica IVM Triple	For electrode arrays implantation.
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni-E	Capture the images of brain sections
nanoZ impedance tester	Plexon	nanoZ	To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	A tool for analyzing the electrophysiological data.
NeuroExplorer	Plexon, USA	N/A	A software.
Ni-chrome wire	California Fine Wire Co.	M472490	35 μm Ni-chrome wire.
Offline Sorter	Plexon	Offline Sorter	A tool for sorting the recorded multi-units.
PCB board	Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd.	N/A	Computer designed board.
Pentobarbital	Sigma	P3761	To anesthetize mice.
Pentobarbital sodium	Sigma	57-33-0	To anesthetize the mouse.
Peristaltic pump	Longer	BT100-1F	A device used for perfusion
Polyformaldehyde	Sangon Biotech	A500684-0500	The main component of fixative solution for fixation of mouse brains
PtCl4	Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd.	13454-96-1	Preparation for gold plating liquid.
Saline	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To clean the mouse's skull.
Silver wire	Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd.	2 mm diameter	Applying for ground and reference electrodes.
Skull drill	RWD Life Science	78001	To drill carefully two small holes on mouse's skull.
Stainless steel screws	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	M0.8 x 2	To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68513	To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.
Sucrose	Damao	57-50-1	To dehydrate the mouse brains  after perfusion.
Super glue	Henkel AG & Co.	PSK5C	To fix the guide tube and Ni-chrome wire.
Temperature controller	Harvard Apparatus	TCAT-2	To maintain mouse's rectal temperature at 37°C
Tetracycline eye ointment	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To protect the mouse's eyes during surgery.
Thread	Rapala	N/A	To link ballon and headstage.
Vaseline	Unilever plc	N/A	To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull.