ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング

要約

広帯域振動和周波数発生(VSFG)画像と明視野第2高調波発生(SHG)イメージングモダリティを取得するために、マルチモーダルで高速ハイパースペクトルイメージングフレームワークが開発されました。赤外線周波数は分子振動と共鳴するため、対称性が許容されるサンプルの微視的構造およびメゾスコピックな形態学の知識が明らかになります。

要約

2次の非線形光信号である振動和周波数発生(VSFG)は、~100μmの空間分解能を持つ分光法として、界面の分子を研究するために伝統的に使用されてきました。ただし、分光法はサンプルの不均一性に敏感ではありません。メゾスコピック的に不均一なサンプルを研究するために、私たちは他の研究者とともに、VSFG分光法の分解能の限界を~1μmレベルまで下げ、VSFG顕微鏡を構築しました。このイメージング技術は、イメージングによってサンプルの形態を分解できるだけでなく、画像のすべてのピクセルで広帯域のVSFGスペクトルを記録することもできます。2次非線形光学技術であるため、その選択規則により、生物学、材料科学、生物工学などで一般的に見られる非中心対称またはキラルな自己組織化構造を可視化できます。本稿では、固定されていないサンプルのイメージングを可能にする倒立透過設計について説明します。また、この研究は、VSFG顕微鏡をニューラルネットワーク関数ソルバーと組み合わせることで、個々の自己組織化シートの化学的特異的な幾何学的情報を解像できることも示しています。最後に、さまざまなサンプルの明視野、SHG、およびVSFG構成で得られた画像は、VSFGイメージングによって明らかにされる固有の情報について簡単に説明します。

概要

2次非線形光学技術^1,2である振動和周波数発生(VSFG)は、対称性で許容されるサンプル3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^を化学的にプロファイリングするための分光ツールとして広く使用されています。14、¹⁵、16、¹⁷、^18、

プロトコル

1. ハイパースペクトルライン走査型VSFG顕微鏡

1. レーザーシステム
   1. 1025nm±5nmを中心とするパルスレーザーシステム( 材料表を参照)を使用します。レーザーは40W、200kHz(200μJ/パルス)、パルス幅は~290fsに設定されています。
      注:正確な繰り返し率は異なる場合があり、このVSFG顕微鏡では一般的に高繰り返し率のレーザーの方がうまく機能します。
   2. シードレーザーの出力を市販の光パラメトリック増幅器(OPA)に誘導して、中赤外(MIR)ビームを生成します( 材料表を参照)。MIRを対象周波数に調整します(図1A)。
      注:本研究では、MIRは3450 nm±85 nm(~2900 ± 72 ^cm-1)を中心とし、パルス幅は~290 fs、パルスエネルギーは~6 μJで、-CH_x 官能基領域の一部を包含しています。
2. アップコンバージョンビーム
   1. OPAからの残留1025 nmビームをファブリ・ペローエタロン( 材料表を参照)に通し、半値幅が~4.75 ^cm-1のスペクトル的に狭くなったアップコンバージョンビームを生成します。
   2. 狭くなった1025 n....

ディスカッション

最も重要なステップは 1.42 から 1.44 です。光学空間分解能を得るためには、対物レンズの位置を合わせることが重要です。また、出射された信号を集めて中継し、入射スリットに走査ビームを線状に投影することも重要です。適切なアライメントにより、最高の分解能とS/N比が保証されます。SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm シートのような一般的なサンプルでは、高い S/N 比で高解像度の画像(~1 μm 分.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB - N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component