Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme

Özet

Geniş bantlı titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) görüntülerinin yanı sıra parlak alan, ikinci harmonik üretim (SHG) görüntüleme modaliteleri elde etmek için çok modlu, hızlı bir hiperspektral görüntüleme çerçevesi geliştirilmiştir. Kızılötesi frekansın moleküler titreşimlerle rezonans olması nedeniyle, simetriye izin verilen numunelerin mikroskobik yapısal ve mezoskopik morfoloji bilgisi ortaya çıkar.

Özet

İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik sinyal olan titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG), geleneksel olarak ~100 μm uzamsal çözünürlüğe sahip bir spektroskopi tekniği olarak arayüzlerdeki molekülleri incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, spektroskopi bir numunenin heterojenliğine duyarlı değildir. Mezoskopik olarak heterojen örnekleri incelemek için, diğerleriyle birlikte, VSFG spektroskopisinin çözünürlük sınırını ~ 1 μm seviyesine kadar zorladık ve VSFG mikroskobunu oluşturduk. Bu görüntüleme tekniği, yalnızca görüntüleme yoluyla örnek morfolojileri çözmekle kalmaz, aynı zamanda görüntülerin her pikselinde geniş bantlı bir VSFG spektrumu kaydeder. İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknik olan seçim kuralı, diğerlerinin yanı sıra biyoloji, malzeme bilimi ve biyomühendislikte yaygın olarak bulunan sentrosimetrik olmayan veya kiral kendinden montajlı yapıların görselleştirilmesini sağlar. Bu makalede, izleyiciler, sabitlenmemiş örneklerin görüntülenmesine izin veren ters çevrilmiş bir iletim tasarımı aracılığıyla yönlendirilecektir. Bu çalışma aynı zamanda VSFG mikroskobunun kendi kendine monte edilmiş tabakaların kimyasala özgü geometrik bilgilerini, bir sinir ağı fonksiyon çözücüsü ile birleştirerek çözebileceğini göstermektedir. Son olarak, çeşitli örneklerin parlak alan, SHG ve VSFG konfigürasyonları altında elde edilen görüntüler, VSFG görüntülemenin ortaya çıkardığı benzersiz bilgileri kısaca tartışmaktadır.

Giriş

İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknik^{olan titreşimsel} toplam frekans üretimi (VSFG) ^1,2, simetriye izin verilen numuneleri kimyasal olarak profillemek için bir spektroskopi aracı olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13

Protokol

1. Hiperspektral çizgi taramalı VSFG mikroskobu

1. Lazer sistemi
   1. 1025 nm ± 5 nm'de ortalanmış darbeli bir lazer sistemi ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Lazer, ~290 fs darbe genişliğiyle 40 W, 200 kHz (200 μJ/darbe) olarak ayarlanmıştır.
      NOT: Tam tekrarlama oranı değişebilir ve yüksek tekrarlama oranlı bir lazer genellikle bu VSFG mikroskobu için daha iyi çalışır.
   2. Bir orta kızılötesi (MIR) ışını oluşturmak için tohum lazerinin çıkışını ticari bir optik parametrik amplifikatöre (OPA) yönlendirin (bkz. MIR'yi ilgi alanlarının sıklığına göre ayarlayın (Şekil 1A).
      NOT: Bu ça....

Tartışmalar

En kritik adımlar 1.42 ile 1.44 arasındadır. Optik uzamsal çözünürlük için objektif merceği iyi hizalamak çok önemlidir. Yayılan sinyalin toplanması, iletilmesi ve tarama ışınının giriş yarıklarında bir çizgi olarak yansıtılması da önemlidir. Doğru hizalamalar, en iyi çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını garanti eder. SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm yaprak gibi tipik bir örnek için, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip iyi çözünürlüklü bir görüntü (~1 μm çözünürl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Camera Por	Thorlabs	WFA4100	connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold	Thorlabs	MRA25-M01	reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack	Thorlabs	UPH3-P5	hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick	Thorlabs	LCP4S	convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm	Thorlabs	CEA1500	provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris	Thorlabs	LCP50S	control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket	Thorlabs	LCP01B	mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon	SLS Optics Ltd.	Customized	generate narrow-band 1030 nm light
Cage Plate Mounting Bracket	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD	Andor Technologies	Newton	2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier	Light Conversion	Orpheus-One-HP	Tunable MID light generator
Copper Chloride	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror	Newport	Customized	selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter	Thorlabs	SM1A34	provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective	Zeiss	420150-9900-000	Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective	Pike Technologies Inc.	891-0007	Reflective objective
Laser	Carbide, Light-Conversion	C18212	Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS	Thorlabs	M32RMSS	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving	Thorlabs	M32M27S	adapt or convert the threading size or type of microscope objectives
Manual Mid-Height Condenser Focus Module	Thorlabs	ZFM1030	adjust the focus of an optical element
Monochromator	Andor Technologies	Shamrock 500i	Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms	Thorlabs	ZFM2020	control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner	Mad City Labs Inc.	MMP3	3D sample stage
Resonant Scanner	EOPC	SC-25	325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera	Thorlabs	DCU224C	Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens	Thorlabs	ITL200	white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard	Thorlabs	OPX2400	incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm	Thorlabs	KCB1	hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm	Thorlabs	KCB2	hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage	Thorlabs	CSA2100	securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,	Thorlabs	C60L24	enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages	Thorlabs	MCM3001	control ZFM2020
Tube lens	Thorlabs	LA1380-AB - N-BK7	SFG signal collection
Visible LED Set	Thorlabs	WFA1010	provide illumination in imaging setup
Whitelight Source	Thorlabs	WFA1010	Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages	Optosigma	TSD-65122CUU	positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier	Thorlabs	XT95RC4	mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation	Thorlabs	XYR1	precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole	Thorlabs	XYT1	provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser	Light Conversion	CB3-40W	Seed laser
β-Cyclodextrin	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	Self-assembly component