マウスにおける心筋虚血再灌流後の冠動脈血流予備能の動的評価

要約

本プロトコルは、左前下行動脈の迅速かつ正確な局在化のための修正された胸骨傍長軸ビューを説明しています。このアプローチは、マウスの心筋虚血再灌流後の冠状動脈血流予備能の動的変化の検査を容易にする一方で、よりシンプルでユーザーフレンドリーになるように設計されています。

要約

心虚血後、上流の動脈で血流が成功裏に完全に回復した場合でも、心筋灌流が不十分であることがよくあります。「ノーリフロー現象」として知られるこの現象は、冠状動脈の微小血管機能障害に起因し、臨床転帰不良と関連しています。臨床現場では、冠動脈疾患の指標として、冠状動脈予備能(CFR)の減少が頻繁に使用されます。CFRは、薬理学的または代謝的要因によって誘発されるピーク流速と静止流速の比として定義されます。

このプロトコルは、脈波ドップラー測定を使用して虚血再灌流(IR)の前後のCFRの動的変化を評価することに焦点を当てました。この研究では、正常なマウスは、イソフルラン刺激下での安静時の値よりも最大2倍高い冠状動脈血流のピーク速度を増加させる能力を示しました。ただし、虚血再灌流後、1時間でのCFRは手術前のベースラインと比較して大幅に減少しました。時間の経過とともに、CFRは緩やかな回復を示しましたが、通常のレベルを下回ったままでした。収縮機能の維持にもかかわらず、微小血管機能障害の早期発見は非常に重要であり、実用的なガイドを確立することは、このタスクで医師を支援すると同時に、時間の経過に伴う心血管疾患の進行の研究を容易にする可能性があります。

概要

冠状動脈性心臓病は、世界中で主要な死亡原因の1つとなっています¹。心虚血後に一次経皮的冠動脈インターベンション(PCI)によって原因となる冠動脈が再開された場合でも、冠動脈微小血管灌流はしばしば減少したままです。さらに、心筋¹ に供給する下流の毛細血管での再灌流の保証はありません。この現象は「ノーリフロー現象」と呼ばれ、臨床進行や予後不良と関連しています。したがって、再灌流療法が成功した後に適切な微小血管リフローを達成することは、心筋の温存にとって重要になります。したがって、血行再建術後の微小血管機能の早期評価は、臨床診療にとって非常に重要です。

微小血管機能の評価には、微小循環抵抗(IMR)および充血性微小血管抵抗(HMR)の指標への侵襲的冠動脈内温度/圧力ガイドワイヤー、非侵襲的心血管磁気共鳴(CMR)、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放出断層撮影法(PET)などのさまざまな技術を採用できます².しかし、これらの方法は侵襲的または半侵襲的であり、高価で、しばしば容易に利用できないため、臨床的有用性が制限されています。一方、経胸壁ドップラー心エコー検査による冠動脈流入予備能 (CFR) の評価は、他の方法に見られるように患者を電離放射線にさらすことなく、非侵襲的で比較的単純で費用対効果の高いアプローチを提供します³。

これまでの研究では、マウスやラットのCFRを測定するために経胸壁ドップラー心エコー法が採用されてきましたが、プラットフォーム、マウス、プローブの間の複雑な角度を特定するには、オペレーターにとって課題が残っています。このプロトコルは、左前下行動脈 (LAD) 冠状動脈を特定し、修正胸骨傍長軸 (PLAX) ビューを使用して CFR を迅速に測定する簡単な方法を提供することにより、この問題を解決します。

さらに、犯人病変から遠位の梗塞関連動脈(IRA)で得られたCFRは、心筋造影心エコー検査(MCE)⁴によって評価された灌流状態と強い相関を示しています。また、急性心筋梗塞(^AMI)5後の生存率と左心室(LV)機能の回復の予測マーカーとしても特定されています。さらに、CFR は、全死因死亡率と心血管系の有害な転帰の信頼できるマーカーとして確立されています ^6,7。以前の報告では、心筋梗塞のラットモデルにおけるCFRを評価するための心エコー検査の使用が説明されています⁸。それにもかかわらず、虚血再灌流の初期段階におけるCFRは十分に研究されていません。したがって、この研究は、再灌流の初期段階にあるIRマウスの動的試験を通じて、微小血管機能障害を診断し、虚血再灌流の治療効果を評価するための参照値を提供します。

プロトコル

すべての実験は、北京大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、8-12週齢の雄C57マウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1.動物の調理

1. 脱毛クリームを使用して、胸部から髪を取り除きます( 材料の表を参照)。次に、手順2に続いて超音波画像の取得に進みます。

2. IR手術前の超音波画像診断

1. マウスをイソフルラン誘導チャンバー( 材料の表を参照)に入れてマウスを麻酔し、1.5〜2.0 L / min O₂ の流れで1.5%の濃度でイソフルラン送達を開始します。
2. 麻酔をかけたマウスを生理学的モニタリングプラットフォーム(超音波システムのイメージングプラットフォーム、 材料の表を参照)上の仰臥位に配置します。生理学的モニタリングテーブルの銅シートに少量の導電性ゲルを塗布し、その上にマウスの足を低粘着テープで固定して、ECGと呼吸に関する生理学的情報を取得します。内蔵のウォーミングプラットフォームを使用して、体温を37〜38°Cに保ちます。
   注:ガス麻酔器の制御スイッチをチャンバーからマスクに切り替え、この間、麻酔薬の投与量を1.5%に一定に保ちます。この時点でのマウスの心拍数は、約350〜450拍/分である必要があります。
3. 乾燥を防ぐために、イメージングの前に眼科用獣医軟膏を目に塗布します。.
4. 40 MHzリニアプローブ⁹ (マウス用MS550プローブなど)を使用して経胸壁心エコー検査を行います(図1A)。
   注:超音波装置にはMS550プローブが装備されています。
5. 超音波透過ジェル( 材料の表を参照)をたっぷりと塗布して、最適な画質を確保します。
6. プローブとプラットフォームの位置を調整して、修正された胸骨傍長軸(PLAX)を形成します view⁹ (図1A)Bモードで左前下行動脈(LAD)を検査します。簡単に言うと、傍胸骨長軸ビューを使用して、プラットフォームを横方向に整列させ、プローブとプラットフォームの間に小さな角度で配置して心臓を画像化します。
7. Bモードで適切な心臓セクションを見つけ、タッチスクリーンで カラードップラー をアクティブにします(図1B)。LAD(白い矢印)は、左心室壁内で識別できます(図1B)。リアルタイムの赤色は、血流の方向(つまり、血流がプローブに向かっている)を示します。
   注:X軸を調整することにより、カラードップラーは、この画像ウィンドウ内で完全なLAD(大動脈洞から遠位枝部位まで)を視覚化できます。
8. プローブを少し動かして正しい位置を見つけ、肺静脈の血流の影響を減らします。
   注:肺静脈の血流の影響を減らすには、プローブをわずかに調整し、LADを肺静脈と区別します。LADは左心室壁を走り、肺静脈は左心房に流れ込みます。カラードップラーを使用してLADを見つけ、Bモードを使用して適切なセクションを選択します。
9. カラードップラーモードでLADを視覚化した後、 パルス波(PW) ボタンを押してPWモードに切り替えます。黄色のインジケーターラインを冠状動脈に配置し、流れの方向と平行になるようにします。次に、[ クリップを保存] ボタンを押して、ベースラインデータを記録します。
10. イソフルラン濃度を3%に上げ、30秒待ちます。流速が時間とともに徐々に増加することを確認してください。 Save Clip ボタンを頻繁に押すと、最高の血流速度がキャプチャされます。
    注:イソフルラン刺激により心臓がより激しく働き、心臓とLADが動く可能性があります。PWモードの画像がキャプチャまたはシネ保存されたら、 PWモード をクリックして、黄色のインジケータラインがLAD上にあることを確認します。ずれが発生した場合は、黄色のインジケーターラインを血流点に少し調整して、記録を続行してください。このプロセスには、迅速な習得と切り替えが必要です。
11. 冠状動脈血流画像を収集した後、麻酔薬をオフにし、プローブを正常なPLAXビューに調整します。マウスの心拍数が約500 bpmまでゆっくりと増加するのを待ってから、プローブを胸骨傍短軸切片(PSAX)に切り替えてマウスの心機能を測定します。
12. 心エコーイメージングが完了したら、動物をプラットフォームから取り出し、自宅のケージで回復させます。ジェルを取り出し、低体温症を防ぐために動物を乾燥させます。
13. Peak Vel 関数ツールと LV 関数ツールを使用して、画像からそれぞれピーク拡張期速度と心臓収縮期関数を取得します。
14. CFR を、最大流量での拡張期ピーク冠状動脈流速 (CFV) とベースラインでの拡張期ピーク CFV の比として計算します。

3. 心筋虚血再灌流法

注:最初の測定はベースラインであり、その後、同じ動物に対して手術が行われました。

1. ペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg)でマウスを麻酔し、鎮痛剤カルプロフェン(5 mg / kg、皮下注射)を投与します。外科的処置全体を通して、予め温めた加熱パッド(37°C)を使用してください。つま先をつまむ反射やまばたき反射に対する離脱反射がないため、適切な麻酔の深さを確保します。マウスの仰臥位を加熱パッドに置き、眼科用軟膏を目に塗布して、目が乾燥するのを防ぎます。人工呼吸器のための気管内挿管の実施:首の毛を取り除く前後に、ベタジンまたはクロルヘキシジンと70%アルコールの3つの交互のスクラブでその領域を消毒します。気管の位置を特定し、カテーテルをそっと挿入します。次に、マウスを人工呼吸器(120呼吸/分で吸気潮汐量250μL)に接続します( 材料の表を参照)。
2. 前胸部の皮膚を、ベタジンまたはクロルヘキシジンと70%アルコールを交互に3回入れて消毒します。第4肋間腔で左開胸術¹⁰ を行うことにより、心臓を露出させます。
3. 左前下行動脈(LAD)を5-0シルク縫合糸( 材料表を参照)を使用してスリップノットで結紮し、左心房付属器の根元から1〜2mm下に挿入します。ステッチ方向が左心房付属器の下端と平行であることを確認してください。虚血性心筋の局所的な色濃化 により 、すべてのマウスの虚血を視覚的に確認します。
4. LAD動脈を30分間閉塞します¹¹.30分後、結紮糸を放出し、心筋の以前に変色した領域の発赤を1〜2分間観察することにより、再灌流を確認します。
5. 冠状動脈閉塞/再灌流後、胸部を層状に閉じ、マウスが約30分間回復するのを待ちます¹¹。

4. IR手術後の超音波画像診断

1. 再灌流後1時間、3時間、5時間、8時間、24時間、および48時間で、セクション2で概説した手順に従って、CFRを再度測定します。これらの測定値を、虚血再灌流(IR)手順の前に得られたCFR値と比較します。

5. 統計分析

1. 適切な統計解析ソフトウェアを使用して、統計解析を実行します( 資料の表を参照)。
   注:対応のあるサンプル間の連続変数の比較には、データが正規分布している場合は対応のある t検定 を利用します。非正規分布のデータの場合、または正規性の仮定が満たされない場合は、フリードマンの分散分析を使用します。 p < 0.05 を統計的に有意であると考えます。

ディスカッション

この研究では、修正された胸骨傍長軸ビューを使用して、虚血再灌流後のCFRを動的に評価するプロトコルを提示します。主な知見は、IRマウスにおけるCFRの有意な減少を示しており、最も顕著な減少は再灌流後1時間で観察された。しかし、心機能は48時間以内に影響を受けませんでした。

CFRは心筋の血液供給の指標として機能し、冠動脈狭窄と冠動脈微小血管循環の両方を評価するための非侵襲的なアプローチを提供します。臨床試験では、CFR値が低いほど予後不良と関連していることが示されており14,15,16、^16、14のCFRカットオフ値が最適であると確立されている。最近のメタアナリシスでは、CFRが0.1単位減少するごとに死亡リスクが16%増加することが示され、CFRはリスクの連続体を表しており、レベルが低いほど患者は臨床転帰が不良になりやすいことが示されています¹⁷。本研究では、再灌流時間の延長に伴ってCFRが増加する傾向を示したが、施術前よりは低いままであり、PCIによる犯人血管開口直後だけでなく、48時間経過時の患者モニタリングの重要性が強調された。さらに、CFRは冠状動脈微小血管機能障害の尺度として機能し、心筋組織灌流に対する限局性疾患、びまん性疾患、および小血管疾患の血行動態学的影響を統合します¹⁸。したがって、CFRは冠状動脈微小血管疾患の診断のための重要な非侵襲的技術です。LAD の CFR は死亡率の強力で独立した指標であるため ^6,7、この研究は、臨床上の決定のための参照値を提供することを目的としています。さらに、超音波装置の使用は、医療費抑制環境での冠動脈造影の必要性を減らすことができる可能性があります。適切なトレーニングとテクノロジーのアップグレードにより、リスクの層別化を個々の患者のニーズに合わせて調整できます。

変更されたPLAXビューは、科学研究者の利便性と時間を節約します。この技術の継続的な改善により、他の冠状動脈微小血管疾患へのより広範な応用が容易になります。このプロトコルの主なステップには、冠状動脈の視覚化と高品質のPW速度画像の取得が含まれます。麻酔薬の濃度が上がると血流速度が徐々に増加するため、最大血流速度を逃さないように連続捕獲することをお勧めします。麻酔薬の濃度を上げると心拍数が変化する可能性があるため、測定中はほとんどカラードップラーモードに戻り、測定前後で一貫した位置を確保することをお勧めします。

冠状動脈の湾曲により、動脈全体を完全に表示することはできず、1つのセグメントのみでの測定につながります。オペレーターは、冠動脈の始点を測定して、冠動脈の最大血流速度のポイントをできるだけ正確に特定することを目指す必要があります。さらに、CFRは冠状動脈血流量の変化に基づいて決定するのが理想的ですが、この研究では血流量ではなく血流速度を使用しており、血管径の影響を見落としています。しかし、以前の研究では、CFRとCFVR(冠状動脈流速予備)¹⁹との間に強い相関関係が示されています。冠状動脈微小血管機能に関するさらなる研究は、虚血の複雑な変化を理解し、冠状動脈微小血管機能障害の理解を深めるのに役立つ可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 silk suture	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	210322
C57 mice	Peking University Health Science Center Department of Laboratory Animal Science
Depilating agent	Nair	NAR-255-1
Electrode gel	Cofoe
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo3100
Isoflurane	REWARD	R510-22-10
Linear array high frequency transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech	ALC-V9
Small Animal Anesthesia Machine	REWARD	R530
SPSS	IBM Corp, Armonk, NY, USA	version 23.0	statistical analysis software
Ultrasound Gel	Cofoe
Vevo Lab Software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.7.0