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要約

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的およびコミュニケーション的行動の障害と反復行動の出現に関連しています。 ショウジョウバエ モデルにおけるASD遺伝子と行動障害との相互関係を研究するために、この論文では、社会的間隔、攻撃性、求愛、グルーミング、および慣れ行動を分析するための5つの行動パラダイムについて説明します。

要約

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用やコミュニケーション能力の欠損、制限された行動や反復的な行動の強化、場合によっては学習障害や運動障害などの一般的な行動症状を伴う神経発達障害の異質なグループを包含しています。 ショウジョウバエ は、多くのヒトの疾患をモデル化するための比類のないモデル生物としての役割を果たしてきました。ASDには多くの遺伝子が関与しているため、ショウジョウバエは、障害に関与していると推定される遺伝子をテストする強力で効率的な方法として浮上しています。ASDには、さまざまな機能的役割を持つ何百もの遺伝子が関与しているため、ASDの単一の遺伝的ハエモデルは実現不可能です。代わりに、個々の遺伝子変異体、遺伝子ノックダウン、またはASD関連遺伝子のハエホモログの過剰発現ベースの研究が、これらの遺伝子産物の根底にある分子経路に関する洞察を得るための一般的な手段です。 ショウジョウバエ では、特定の行動要素の欠損を簡単に読み取ることができる多くの行動手法が利用可能です。ソーシャルスペースアッセイ、およびハエの攻撃性および求愛アッセイは、社会的相互作用またはコミュニケーションの欠陥を評価するのに有用であることが示されています。ハエのグルーミング行動は、反復行動の優れた読み出しです。ハエのアハエでは、一部のASD患者で影響を受けることがわかっているアハエの学習能力を推定するために使用されます。これらの行動パラダイムの組み合わせを利用して、ハエのヒトASD様疾患状態を徹底的に評価することができます。 Fmr1 変異型ハエ、ヒトにおけるFragile-X症候群の再現、およびハエニューロンにおけるPOGZ-ホモログ 行 ノックダウンを用いて、社会的間隔、攻撃性、求愛行動、グルーミング行動、および慣れにおける定量化可能な欠損を示しました。これらの行動パラダイムは、ハエモデルにおけるASDやその他の神経発達障害の研究に広く使用されることを前提として、ここでは最も単純でわかりやすい形で示されています。

概要

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、神経障害の異質なグループを包含しています。これには、社会的コミュニケーションと社会的相互作用における多文脈的で持続的な欠損、および制限された反復的な行動および活動パターンと関心の存在を特徴とする、さまざまな複雑な神経発達障害が含まれます1。世界保健機関(WHO)によると、世界中で100人に1人の子供がASDと診断されており、男女比は4.22です。この病気は生後2年目または3年目に明らかになります。ASDの子供は、社会的感情的な互恵性、非言語的コミュニケーション、および関係スキルに関心がないことを示しています。彼らは、型にはまった運動、柔軟性に欠ける儀式化されたルーチンのフォロー、制限された興味への集中など、反復的な行動を示します。ASDの子供は、触覚、嗅覚、音、味覚に対して高い反応を示しますが、痛みと温度の反応は比較的低いです1。この障害の浸透度は、ASDに苦しむ患者によっても異なるため、変動性が増加します。

ASDの現在の臨床診断は、ASDのすべての形態をカバーする確認的なバイオマーカーベースまたは一般的な遺伝子検査がないため、個人の行動評価に基づいています3。遺伝的および神経生理学的基盤を解読することは、治療戦略を標的にするのに役立ちます。過去10年間で、大規模な研究により、ASD患者で欠失または変異した、または発現レベルが変化する数百の遺伝子が特定されました。現在進行中の研究では、マウスやショウジョウバエなどのモデル生物を用いて、これらの候補遺伝子の寄与を検証することを強調しており、これらの遺伝子をノックアウトまたはノックダウンした後、ASD様の行動障害の検査を行い、異常を引き起こす根本的な遺伝的および分子的経路を解明しています。ヒト染色体遺伝子座16p11.2でコピー数多型(CNV)を再現したマウスモデルは、ASDの行動上の欠陥4,5,6の一部を示しています。催奇形性薬物バルプロ酸(VPA)への出生前曝露は、ヒトASD7,8に似た形質を示す別のマウスモデルです。さらに、遺伝的症候群に関連する自閉症を示すマウスモデル、例えば、Fmr1、Pten、Mecp2、Cacna1cの突然変異によって引き起こされる単一遺伝子症候群モデル、およびCntnap2、Shank、Neurexin、またはNeuroligin遺伝子5のような遺伝子の突然変異によって引き起こされる単一遺伝子非症候群モデルが存在する。

ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)は、ASDを含む多数のヒト疾患の細胞、分子、および遺伝的基盤を研究するためのもう1つの著名なモデル生物です9。ショウジョウバエとヒトは、分子レベル、細胞レベル、シナプスレベルで高度に保存された生物学的プロセスを共有しています。ショウジョウバエは、ASDに関連する遺伝子を特徴付け、シナプス形成、シナプス機能と可塑性、神経回路の組み立て、および成熟におけるそれらの正確な役割を解読するために、ASD研究10,11,12で成功裏に使用されています。ASD関連遺伝子のハエ相同体は、社会的および/または反復行動の調節に役割を果たしていることがわかった11,13,14,15,16,17,18,19,20,21。ショウジョウバエは、ASD遺伝子とその変異体15,22,23のスクリーニングのモデルとしても機能しています。ハエのASD研究における最大の課題は、他の疾患モデルとは異なり、単一のASDハエモデルがないことです。特定のASD遺伝子の突然変異やノックダウンの影響を理解するためには、研究者は行動表現型がASD患者の症状を十分に模倣しているかどうかを検証し、表現型の分子的または生理学的基盤の理解に進む必要があります。

したがって、ASD様表現型の検出は、ハエモデルでのASD研究に不可欠です。社会的行動/相互作用、コミュニケーション、反復行動、刺激に対する反応性の欠損などの異常を検出することを可能にする、いくつかの行動技術が長年にわたって登場してきました。さらに、これらの行動手法のいくつかの修正とアップグレードは、アップスケーリング、アッセイの自動化、読み出し、定量、比較方法などの特定の要件に合わせて、さまざまなラボで行われています。このビデオ記事では、5つの行動パラダイムの最も基本的なバージョンが示されており、それらを組み合わせることで、ASDのような行動結果を最も簡単な方法で検出できます。

攻撃性は、生存と生殖に影響を与える進化的に保存された生来の行動です24。同種に対する攻撃的な行動は、「社会化の動機」25,26および「コミュニケーション」27の影響を受け、どちらもASDの影響を受けた個人では損なわれます。攻撃的な行動はショウジョウバエによく記載されており、堅牢な攻撃性アッセイ28,29,30およびよく理解された遺伝的および神経生物学的基礎31を通じてその定量化可能性は、ハエモデルにおけるASD表現型を評価するための適切な行動パラダイム32となる。攻撃性は、社会環境から離れた社会的孤立の影響を受け、それが攻撃性の強化につながります。オスのハエが数日間隔離されて飼育されている場合も同じことが観察されています33,34。ハエの社会性を定量化する別の行動アッセイは、ハエの小グループにおける最も近い隣人とハエ間の距離を測定するソーシャルスペースアッセイ35であり、ハエ12,21,36,37および環境的に誘発されたASDハエモデル38におけるASD遺伝子オルソログの役割をテストするのに最適である。39.

ショウジョウバエの求愛アッセイは、自閉症関連遺伝子18,19,21,40を含む、回路または遺伝子操作による社会的およびコミュニケーションスキルの変化をアッセイするために頻繁に使用される別の行動パラダイムです。ASD患者には反復的な行動パターンが一般的であり、ハエではグルーミング行動(清掃やその他の目的で行われる一連の明確なステレオタイプな行動)によって再現されます。これは、ハエ21,41のASD遺伝子変異の影響、および化学物質38,39への曝露の影響をアッセイするために成功裏に使用されています。アッセイの複数の進歩と自動化は、16,41,42,43以前に説明されています。ここでは、最も基本的なアッセイパターンを示しており、これは採用と定量が容易です。

ASDは、一部の患者44,45,46,47,48,49,50、ASDモデル生物51,52の慣れ、学習、および記憶の能力に影響を与えることが知られており、また、さまざまな嗅覚行動50の欠損を引き起こします。ショウジョウバエのライトオフジャンプ慣れは、ASD遺伝子のスクリーニングに以前に使用されてきました23。馴化は、嗅覚馴化アッセイ53,54,55の簡単な方法によってアッセイすることができる。我々は、嗅覚の慣れを誘導する方法を説明し、ASD遺伝子変異体または遺伝子ノックダウン状態における馴化の欠陥を検出するために使用できる古典的なY迷路ベースのバイナリ匂い選択アッセイ56を使用して結果をアッセイする。突然変異(または遺伝子ノックダウン)または薬理学的治療がハエの行動に及ぼす影響がASD様表現型に相当するかどうかを評価するために、ここで説明するこれらの5つのアッセイを組み合わせて使用できます。

プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. アグレッションアッセイ

  1. アグレッションアッセイアリーナの準備
    1. 標準的な24ウェルプレート(図1A)を取り、プレートの各ウェルをフライアグレッションのための単一の「アリーナ」(図1B)として使用します。各ウェルの半分を通常のフライフードで満たし、一晩乾燥させます。
      注:オプションで、イーストペーストのドットや男性の攻撃性を確保するために斬首された女性など、攻撃性の焦点をアリーナに含めることができます。
    2. 透明なプラスチック/アクリルシートは、約3〜4個のウェルの表面を覆うのに十分な量です。シートに穴を開けて、個々のハエをウェルに挿入するための直径~2.5mmの小さな開口部を作ります。
  2. ハエ吸引器の準備
    1. 長さ30〜50cmのゴム/シリコンチューブを用意します(図1C1)。
    2. 200 μL (または 1,000 μL) のピペットチップを取り、細いチップから ~1 cm を切り落とします。ゴムチューブの一方の端にカットエンドを挿入します。この先端は、口からの吸引に使用される「口の端」になります。
    3. 別のピペットチップを取り、このチップの狭い方の端を切って、ハエが入るのに十分な開口部を作ります。このピペットチップのベースをチューブのテールエンドに挿入します。これがアスピレーターの「フライエンド」になり、そこからフライが吸引されます(図1C2)。
    4. メッシュクロスまたは綿の薄い層をチューブの「フライエンド」、つまりチューブと先端の接合部に挿入します。ピペットチップに吸引されたフライがメッシュの前のチップに引っかかったままであることを確認してください。
    5. パイプとピペットチップの間の接合部をパラフィルムでシールします。
  3. シングルハウジングチューブとグループハウジングバイアルの調製
    1. シングルハウジングチューブの調製
      1. 調製したばかりのフライフード約500 μLを2 mLのマイクロチューブに加えます(図1D)。ミニ遠心分離機を使用して、食品をチューブの底部分に引き下げます。
      2. 蓋を開けたまま一晩にして、食品を室温で固めるようにセットします。チューブを細かい布で覆い、迷子のハエがチューブに入るのを防ぎます。
      3. マイクロチューブの蓋に空気循環用の針を通し、食品が固まったら蓋を閉めます。
    2. グループハウジングバイアルの調製
      1. 通常のフライバイアルを取り、バイアルの最低限に作りたての食品を入れます(図1D)。
  4. 実験前のハエの準備
    1. インキュベーター内の標準的なフライフードを含む通常のガラス/プラスチックボトルに、目的の遺伝子型のフライラインをインキュベーターに入れ、12時間の明暗サイクルで25°Cに維持します。
    2. 所望の遺伝子型の新たに閉じた(0〜24時間)ハエを収集し、実体顕微鏡を使用して二酸化炭素麻酔下でそれらを性分離する。
    3. オスのフライの半分を個別に「シングルハウジングチューブ」に挿入します。オスのハエの残りの半分を10匹のグループに入れ、メスのハエを通常の「グループハウジングバイアル」に入れて社会的な状態を作り出します。すべてのチューブとバイアルを25°Cで5日間保存します。
      注意: ビヘイビアルームの温度を24〜25°C、湿度~50%に維持します。使用したハエ系統は、w1118 およびFMRトランスヘテロ接合体変異体ハエ(Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57であった。 Fmr1 ハエを5日間隔離したところ、別のオスに対する攻撃性が有意に減少しました(図1E)。
  5. 攻撃行動実験の実施
    1. ZT0-ZT3の時間枠内で攻撃性実験を行い、ハエはこの時間帯に活動のピークを示します。
      注:ZT=Zeitgeberの標準的な12時間の明暗サイクルの時間。ZT0= 点灯、つまり光の位相の開始、ZT3= 光の位相の開始から 3 時間後、というようになります。ZT12 =消灯します。
    2. 2匹のオスのハエを、口内吸引法により、単一またはグループハウジングチャンバーのいずれかから、蓋の穴を通して攻撃アリーナに移します。ハエが逃げないように、すぐに穴を離してください。
    3. ハエがアリーナ内に1〜2分間順応するのを待ちます。タイマーを20分間開始します。スタンドを使用してアリーナの真上にカメラまたは携帯電話を垂直に配置することにより、20分間全体のハエをビデオに記録します。アグレッシブな試合の種類がビデオに表示されていることを確認します。
      注意: アリーナの明確な照明を確保し、蓋からのまぶしさ/反射がカメラのレンズに直接当たらないようにしてください。
    4. 各遺伝子型およびすべてのタイプの住居条件について、15〜20組のハエについて実験を繰り返します。
      注:無意識の偏見は、対照バエとテストハエ、および複数の遺伝子型に属するビデオファイルの二重盲検化によって打ち消すことができます。
  6. アグレッションアッセイデータの解析
    1. ビデオファイルを十分に大きな画面のコンピューターに転送して、攻撃的な試合が見えるようにします。
    2. ビデオを再生し、20分58,59の時間内にアグレッシブな試合の総数を数えます。
    3. 各遺伝子型と各住宅パターンのデータをスプレッドシートにまとめて整理し、任意の統計ソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。両側 の t 検定を実行し、データを箱ひげとしてプロットします。

2. ソーシャルスペースアッセイ

注:ここで述べるアッセイプロトコル、アリーナ、および分析は、以前に説明されている60,61。

  1. ソーシャルスペースアッセイ(SSA)アリーナの準備
    1. 長方形のガラス板(13.5 cm x 10.4 cm、厚さ0.3 cm)の上に、アクリルスペーサーの直角がガラス板の角に合うように、三角形のアクリルスペーサー(高さ= 8.9 cm、ベース= 6.7 cm、厚さ= 0.3 cm)を平らに置きます(図2A)。
    2. 長方形のアクリルスペーサー2個(6.7cm×1.5cm、厚さ=0.3cm)をガラス板に平らに置き、2つの三角形のスペーサーの底面に合わせます。この配置の後、4つのアクリルスペーサーが、スペーサーで覆われていない長方形のガラス板上の三角形のアリーナ(~2.16平方cm61)を囲んでいることを確認します(図2A、B)。定規のステッカー(図2C)を三角形のスペーサーの1つに貼り、上から見えることを確認します。
    3. 次に、アクリルスペーサーの上に2番目の長方形のガラス板(13.5 cm x 10.4 cm、厚さ0.3 cm)を配置し、下部のガラス板と揃うようにします。アクリルスペーサーはガラススペースの間に挟まれ、2つのガラス板の間の中央に三角形のスペースが残ります。4つの小さなバインダークリップを使用して、ペインとスペーサーを保持します。
  2. SSAのためのフライの準備
    1. 所望の遺伝子型の新たに閉じた(0〜24時間)ハエを収集し、実体顕微鏡を使用して冷間麻酔下でそれらを性分離します。
      注:冷間麻酔装置(ペトリ皿を使用できます)を-20°Cのインキュベーターで冷やします。ハエを空のバイアルに入れ、ハエが動かなくなるまでこれらのバイアルを氷(氷のバケツ)に浸し、冷たいシャーレに置き、選別を開始します。
    2. オスとメスのハエを別々に24時間、25°Cのインキュベーターに入れ、12時間の明暗サイクルで保存します。
      注:ここで示した実験では、使用したハエ株は w1118 および FMR トランスヘテロ接合体変異体ハエ(Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M)でした。
  3. SSA 実験の実行
    1. アグレッションアッセイと同じ実験条件(温度:24-25°C、湿度~50%)を維持し、ZT0-ZT3の時間枠で実験を行います。
    2. 右下のバインダークリップを取り外し、その長方形のスペーサーを少し外側にずらして、2つの長方形のスペーサーの間に隙間(~0.5 cm)ができるようにします。
    3. 食品バイアルから空のバイアルに(前日に収集された)ハエを移します。それらを、長方形のスペーサーの間に作られた空間を穏やかに吸引することにより、ソーシャルスペースアリーナ(三角形の領域)に移します。長方形のスペーサーとバインダークリップを元の位置にスライドさせてすぐにスペースを閉じ、ハエが逃げるスペースが残っていないことを確認します。
    4. チャンバーを直立位置に保持することにより、実験の開始時にすべてのハエがチャンバーの基部にあることを確認するために、チャンバーをソフトパッドに3回静かに叩きます。
    5. cl SSAチャンバーを直立位置にし、タイマーを開始します。ハエがアリーナ内の位置に落ち着き、最小限の動きを示す20分後にアリーナの鮮明な写真を撮ります。まぶしさや不規則な照明は避けてください。
    6. ハエを叩き、ステップ 2.3.5 から 2.3.7 までのステップを繰り返す (内部反復) ことにより、同じハエの集団に対して実験を 3 回繰り返します。同じ遺伝子型/条件の異なるハエの集団で3回繰り返します(独立した繰り返し)。
      注:アッセイチャンバーを凍結して、チャンバーからハエを捨てます。ハエのグループで1ラウンドの実験を行った後、ガラスとプラスチックの表面をエタノールで拭いてすべての臭いを取り除きます。
  4. ソーシャルスペースアッセイデータの解析
    1. ImageJ62 ソフトウェアで画像を分析し、前述の61のようにフライ間の最近傍距離をリストアップする。
    2. 統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行し、グラフをプロットします。
      注:ここに記載されているSSAアッセイに使用されたハエ株は、w1118 および Fmr1 トランスヘテロ接合体変異体ハエ(Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M)57であった。 Fmr1 ハエは、最も近いハエからの距離が大幅に増加していることを示しています(図2D)。

3.求愛アッセイ

  1. 求愛室
    1. 求愛室(図3A)の4つのピースすべてを 、図3Bに示す順序で組み立てます。中央のディスクの各ミシン目は、蓋とベースピースの間に挟まれ、「求愛室」として機能します(図3C)。
  2. 交配済みのメスの入手
    1. CS(Canton S、野生型)の複数の培養ボトルを開始および維持し、各フードボトルに~60〜100匹のオスとメスのハエがいます。
    2. 成虫が出てきたら、すべての成虫のハエを捨て、2〜3時間ごとにこれらのボトルから出てきたハエを少量の酵母ペーストを補給した新しいフードバイアルに移します。
      注意: バイアルの過密を避けてください。古いハエ、幼虫、または蛹を交配バイアルに移さないように注意してください。
    3. これらの「交配バイアル」を4日間インキュベートして、すべての雌が交配したことを確認します。
  3. オス用シングルハウジングチューブの調製
    1. 約500 μLのフライフードを各2 mLマイクロチューブに加えます。ミニ遠心分離機を使用して、食品をチューブの底部分に引き下げます。
    2. 食品を一晩固化させ、マイクロフュージチューブの蓋を切断し、パラフィルムで覆い、パラフィルムに針で穴を開けて空気循環させます。
  4. 処女男性の収集と隔離
    1. 目的の遺伝子型の10〜15人の男性と20〜30人の処女女性との交配を別々の食品バイアルにセットアップします。
    2. 子孫から目的の遺伝子型の処女男性を収集し、吸引器を使用して「シングルハウジングチューブ」に個別に保管します。新しく閉じたオスを5〜6時間ごとに収集し続け(遺伝子型ごとに最大40〜50人のオス)、個々のシングルハウジングチューブに隔離します。
    3. チューブの蓋をパラフィルムで再度密封します。
  5. 求愛アッセイ実験の実施
    1. 試験雄の隔離から5日後、ZT0-ZT3の時間枠で求愛アッセイを実施します。
    2. ビデオ録画装置は、アッセイのワークスペースに重点を置いて、事前に十分にセットアップしてください。
    3. 吸引器の助けを借りて、交配バイアルから1匹の予交雌(生後6〜10日)を採取し、求愛室に挿入します。
    4. アスピレーターを使用して、オス(コントロール/テスト)フライをシングルハウジングチューブから、トランスファーホールを通じてシングルプレメイテッドメスを含む求愛チャンバーに静かに移します。蓋をすばやく回転させてチャンバーを閉じます。
    5. ハエの行動を15分間ビデオで記録します。
  6. ビデオデータの解析と統計
    1. ビデオファイルをコンピューターに転送します。男性が15分間の求愛に費やした時間の長さは、手動でビデオを見て確認します。
    2. オスのハエごとに求愛指数(CI)を計算し、これはオスが15分間にメスに求愛するのに費やした時間の割合(またはパーセンテージ)です。
    3. 15分間の 交尾試行 の総数を数えます。
    4. オスが最初に求愛を試みる前に示したタイムラグの長さを、 求愛潜時(CL)として注目してください。
      注:統計的な検出力を達成し、CI結果の一貫性を判断するために、状態/遺伝子型ごとに40〜60人の男性を分析することをお勧めします。

4. グルーミング行動アッセイ

  1. グルーミング行動アッセイアリーナ
    1. 容積が ~0.4 cm3 の小さな円形チャンバーを、グルーミング行動を記録するためのアリーナとして使用します。
      注:セクション3に記載されているのと同じ求愛アリーナをグルーミング行動アッセイに使用できます。
    2. グルーミング行動には、脚などの細かい臓器の動きを記録する必要があるため、高解像度または高コントラストのビデオ録画を使用してください。このプロトコルに従うには、20 cm x 20 cmの寸法の均一に照らされた表面として、拡散ガラスで覆われたLEDパネルを使用します。求愛室をパネルの上に置き、光が下から部屋を通過するようにします。
  2. 実験前のハエの準備
    1. 実験用遺伝子型は、食品ボトル内のハエを25°Cで、12時間の明暗サイクルで維持します。
    2. 所望の遺伝子型の新たに閉じた(0〜24時間)ハエを収集し、ソーシャルスペースアッセイに記載されているように、実体顕微鏡を使用して冷間麻酔下でそれらを性分離します。
    3. オスのハエをシングルハウジングチューブ(アグレッションアッセイで使用)に24時間分離します。
      注:ここで示した実験では、使用したハエ株は 、W1118 および FMR トランスヘテロ接合体変異体ハエ(Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M)でした。
  3. グルーミング行動アッセイの実施
    1. 温度を24〜25°C、湿度を~50%に保ちます。ZT0〜ZT3の時間枠16の間に実験を行う。
    2. アスピレーターを使用して、シングルハウジングチューブからグルーミングアリーナにシングルハウジングのオスフライを移します。ハエが逃げないように、すぐに蓋の穴をスライドさせて外します。
    3. グルーミングアリーナを拡散LEDパネルに置き、ハエがアリーナ内に1分間順応するのを待ちます。スタンドに取り付けられたアリーナの真上にカメラを垂直に配置することにより、フライを10分間ビデオで記録します。グルーミングの発作の種類がビデオで表示され、定量化できることを確認してください。
      注:グルーミング行動には、頭、目、触角、吻、腹部、生殖器、および脚のある翼(最初のペア:T1、2番目のペア:T2、または3番目の脚のペア:T3)のこすりが含まれます。この研究で考慮されたグルーミング行動パラメータは、Andrew et al. 41 に記載され、 図4に示されている通りです。
    4. 遺伝子型ごとに実験を繰り返します。
    5. グルーミング行動データの分析
      1. ビデオを分析し、次の4つのパラメーターを計算します: グルーミングインデックス (グルーミングに費やされた時間の割合)。 グルーミングレイテンシー (最初のグルーミング試合までの時間)。 グルーミング試合番号; 平均グルーミング-試合時間 (合計試合時間/試合回数)。
      2. フライがパラメータの表示を停止して2秒間動かないか、試合を停止して少なくとも4歩歩いた場合、1回のグルーミング試合は終了としてマークされます。

5. 嗅覚馴染のアッセイ

注:図5に示すように、最終的な組み立てはY-迷路アッセイ54,56の日に行う必要があります。

  1. ハエの慣れの準備
    1. インキュベーター内のすべての実験について、周囲温度25 °C、湿度70%、標準12時間光:12時間暗サイクル(LD)で目的の遺伝子型のハエを飼育します。
    2. 0〜12時間前の新しく閉じたハエを収集し、綿のストッパーを締めた新しいミディアムボトルに~30〜40のハエを移します。
    3. 各ボトルにコードを割り当てて、実験者が実験対象の遺伝子型について盲目になるようにします。
  2. 嗅覚馴染の誘導
    1. パラフィン液(光)で希釈した好ましい匂い物質1 mLを1.5 mLのマイクロチューブに入れます。コントロールには、1.5 mLのマイクロフュージチューブに1 mLのパラフィン液体ライトを使用します。チューブ内の内容物を10分間ボルテックスして均一に混合し、均等に穴の開いたプラスチックラップで覆います。
      注:ビデオでは、20%の酪酸エチルが使用されます。
    2. ワイヤーを使用して、希釈した臭気物質を含むチューブまたは希釈液のみをハエを含む別のメディアボトルに吊るします。
    3. ボトルを綿でしっかりと覆い、次にクラフト紙で包んで、臭気物質の蒸気の拡散を防ぎます。コントロールボトルと臭気含有ボトルにそれぞれナイーブと臭いにさらされている(慣れている)ラベルを付けます。これらの誘導ボトルを上記の条件でインキュベーター内で3日間維持します。
  3. ハエとY迷路装置の準備
    1. ハエを誘導ボトルから水に浸した濾紙のみが入ったバイアルに移します。
    2. 実験前に室温で約16〜18時間飢餓状態にして、モチベーションを高めます。
    3. Y迷路装置のコンポーネントが清潔で無臭であることを確認してください。4つのパーツを縦に組み立てます。クライミングチャンバーをY迷路に取り付け、Y迷路をアダプターの上部に接続します。 図5に示すように、Y迷路の底部を、下部の中央ステムとして機能するエントリーバイアルにしっかりと取り付けます。
    4. 各クライミングチャンバーの先細りの端を、臭気のないシリコンチューブを使用して、臭気物質(蒸留水で10-3 希釈)を含む試薬ボトルに接続します。
    5. 真空ポンプを使用して、ガスボトルからYの2つのアームに等流量(~120 mL/分)で臭気物質をポンプで送り込み、一貫性を保つために15分間飽和させます。
  4. 古典的なY迷路アッセイの実行
    1. 各バイアルの飢餓状態のハエをY迷路セットアップのエントリーバイアルにそっと導入します。
    2. 彼らが短期間順応するのを許してください。エントリーバイアルをY迷路アダプターに接続して、テストを開始します。そして、ハエがY迷路の腕を登り、2つの収集室に閉じ込められるようにします。各テストの所要時間を 1 分に設定します。
    3. 完了したら、フライをエントリーバイアルの底にタップバックし、Y迷路のアームの位置を切り替えてサイドバイアスを回避します。同じハエのセットに対して4回の読み取りを行います。
    4. 時間内にY迷路の2つのアームをそれぞれ登るハエの数を記録します。
    5. アッセイを少なくとも8バッチ繰り返して、代表的なデータセットを取得します。
  5. 収集したデータの分析と解釈
    1. パフォーマンスインデックス(PI)を計算して結果を定量化します。これは、エアアームを選択したハエの数(A)と臭気アームを選択したハエの数(O)の数の差を、参加者のハエの総数の割合として表すことができます。
    2. 統計的検定(対応のないスチューデント のt検定)を使用して、ナイーブフライと臭気にさらされたハエのPIが有意であるかどうかを確認します。

結果

アグレッションアッセイ
ハエASDモデルとして、Fmr1変異型ハエが用いられている63,64。w1118匹の雄を対照として用い、Fmr1トランスヘテロ接合体Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57匹の雄を実験用ハエとして使用した。成人男性は、隔離チューブに5日間収容されました。同型男性(同じ遺伝子型、同じ住...

ディスカッション

ショウジョウバエ は、ハエとヒトの疾患遺伝子との間の遺伝子配列の高度な保存により、ヒトの神経障害の研究のための優れたモデル生物として使用されています9。数多くの堅牢な行動パラダイムにより、ヒトの疾患を再現する突然変異体に現れる表現型を研究するための魅力的なモデルとなっています。自閉症スペクトラム障害(ASD)には何百もの遺伝子が関与して...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

慣れと匂い選択アッセイのセットアップを提供してくれたMani Ramaswami氏(NCBS、バンガロール)とBaskar Bakthavachalu氏(IIT Mandi)、アグレッションアッセイに関する貴重な提案をしてくれたPavan Agrawal氏(MAHE)、求愛アッセイチャンバーのプロトタイプとFmr1変異フライラインを共有してくれたAmitava Majumdar氏(NCCS、プネー)、MB247-GAL4ラインを共有してくれたGaurav Das氏(NCCS、プネー)に大変感謝しています。ショウジョウバエ株については、Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC、米国インディアナ州)、国立遺伝学研究所(国立遺伝研、京都)、バナーラスヒンドゥー大学(BHU、バラナシ、インド)、国立生物科学センター(NCBS、バンガロール、インド)に感謝します。研究室での研究は、SERB-DST(ECR/2017/002963)からADへの助成金、ADに授与されたDBT Ramalingaswamiフェローシップ(BT/RLF/Re-entry/2016年11月)、およびインドのIITカラグプルからの機関支援によって支援されました。SDとSMは博士号を受け取りますCSIR-Senior Research Fellowshipからフェローシップ。PMは、インドのMHRDから博士号を取得しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheetAlternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizesThickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapesi) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambersx2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vialPerspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottlesBorosil #1500017
Gas washing stopperBorosil #1761021
Glass vialOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) lightSRL #18211
Roller clampsPolymed #14098
Silicone tubesOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pumpHana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-mazeBorosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottlesOD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vialsOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set upCamcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
CottonAbsorbent, autoclaved
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipette tips200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tubelength= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

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