Paradigmes pour l’évaluation comportementale dans le modèle de trouble du spectre autistique de la drosophile

Résumé

Le trouble du spectre autistique (TSA) est associé à un comportement social et communicatif altéré et à l’émergence d’un comportement répétitif. Pour étudier l’interrelation entre les gènes TSA et les déficits comportementaux dans le modèle de la drosophile , cinq paradigmes comportementaux sont décrits dans cet article pour mesurer l’espacement social, l’agressivité, la parade nuptiale, le toilettage et le comportement d’habituation.

Résumé

Le trouble du spectre autistique (TSA) englobe un groupe hétérogène de troubles neurodéveloppementaux avec des symptômes comportementaux communs, notamment des déficits dans l’interaction sociale et la capacité de communication, des comportements restreints ou répétitifs accrus, ainsi que, dans certains cas, des troubles d’apprentissage et un déficit moteur. La drosophile a servi d’organisme modèle sans précédent pour la modélisation d’un grand nombre de maladies humaines. Comme de nombreux gènes ont été impliqués dans les TSA, les mouches des fruits sont apparues comme un moyen puissant et efficace de tester les gènes supposément impliqués dans la maladie. Comme des centaines de gènes, avec des rôles fonctionnels variés, sont impliqués dans les TSA, un seul modèle génétique de mouche TSA est irréalisable ; au lieu de cela, les mutants génétiques individuels, les inactivations de gènes ou les études basées sur la surexpression des homologues de mouches des gènes associés aux TSA sont les moyens courants d’obtenir des informations sur les voies moléculaires sous-jacentes à ces produits géniques. Une foule de techniques comportementales sont disponibles chez la drosophile qui permettent de lire facilement les déficits dans des composants comportementaux spécifiques. Le dosage de l’espace social et les essais d’agression et de parade nuptiale chez les mouches se sont révélés utiles pour évaluer les défauts d’interaction sociale ou de communication. Le comportement de toilettage chez les mouches est une excellente lecture du comportement répétitif. Le test d’habituation est utilisé chez les mouches pour estimer la capacité d’apprentissage de l’habituation, qui s’avère être affectée chez certains patients atteints de TSA. Une combinaison de ces paradigmes comportementaux peut être utilisée pour faire une évaluation approfondie de l’état pathologique humain de type TSA chez les mouches. En utilisant des mouches mutantes Fmr1 , récapitulant le syndrome de l’X fragile chez l’homme et l’inactivation de la rangée homologue POGZ dans les neurones des mouches, nous avons montré des déficits quantifiables dans l’espacement social, l’agressivité, le comportement de parade nuptiale, le comportement de toilettage et l’accoutumance. Ces paradigmes comportementaux sont démontrés ici dans leurs formes les plus simples et les plus directes, avec l’hypothèse que cela faciliterait leur utilisation généralisée pour la recherche sur les TSA et d’autres troubles neurodéveloppementaux dans les modèles de mouches.

Introduction

Les troubles du spectre autistique (TSA) englobent un groupe hétérogène de troubles neurologiques. Elle comprend une gamme de troubles neuro-développementaux complexes caractérisés par des déficits multicontextuels et persistants dans la communication sociale et l’interaction sociale et la présence de modèles et d’intérêts comportementaux et d’activités restreints et répétitifs¹. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), 1 enfant sur 100 est diagnostiqué avec un TSA dans le monde avec un ratio hommes-femmes de 4,2². La maladie devient évidente au cours de la deuxième ou de la troisième année de vie. Les enfants autistes montrent un manque d’intérêt pour la réciprocité socio-émotionnelle, la communication non verbale et les compétences relationnelles. Ils présentent des comportements répétitifs tels que des mouvements moteurs stéréotypés, un suivi de routine inflexible et ritualisé et une concentration intense sur des intérêts restreints. Les enfants atteints de TSA présentent un degré élevé de réponse au toucher, à l’odorat, au son et au goût, tandis que la réponse à la douleur et à la température est comparativement faible¹. La pénétrance de ce trouble est également différente entre les différents patients souffrant de TSA et, par conséquent, la variabilité augmente.

Le diagnostic clinique actuel des TSA est basé sur l’évaluation comportementale des individus, car il n’existe pas de test génétique commun basé sur des biomarqueurs de confirmation qui couvre toutes les formes de TSA³. Décrypter les bases génétiques et neurophysiologiques serait utile pour cibler les stratégies de traitement. Au cours de la dernière décennie, un grand nombre de recherches ont abouti à l’identification de centaines de gènes qui sont soit supprimés, soit mutés, soit dont les niveaux d’expression sont modifiés chez les patients atteints de TSA. Les recherches en cours mettent l’accent sur la validation de la contribution de ces gènes candidats à l’aide d’organismes modèles comme la souris ou la mouche des fruits, dans lesquels ces gènes sont éliminés ou renversés, suivis de tests de déficits comportementaux de type TSA et d’élucidation des voies génétiques et moléculaires sous-jacentes à l’origine des anomalies. Un modèle murin récapitulant les variations du nombre de copies (CNV) dans les loci chromosomiques humains 16p11.2 montre certains des défauts comportementaux des TSA ^4,5,6. L’exposition prénatale à un médicament tératogène, l’acide valproïque (APV), est un autre modèle murin décrivant des traits ressemblant à ceux des TSA humains ^7,8. En outre, il existe une gamme de modèles murins qui présentent un autisme associé au syndrome génétique, par exemple, des modèles syndromiques monogéniques causés par des mutations dans Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c et des modèles non syndromiques monogéniques causés par des mutations dans des gènes comme Cntnap2, Shank, Neurexin ou Neuroligin ^{gènes 5}.

La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) est un autre organisme modèle important pour l’étude des bases cellulaires, moléculaires et génétiques d’une pléthore de troubles humains⁹, y compris les TSA. La drosophile et l’homme partagent des processus biologiques hautement conservés aux niveaux moléculaire, cellulaire et synaptique. Les mouches des fruits ont été utilisées avec succès dans des études sur les TSA 10,11,12 pour caractériser les gènes liés aux TSA et déchiffrer leur rôle exact dans la synaptogenèse, la fonction et la plasticité synaptiques, l’assemblage des circuits neuronaux et la maturation ; Les homologues de mouches des gènes associés aux TSA ont joué un rôle dans la régulation du comportement social et/ou répétitif 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. La mouche des fruits a également servi de modèle pour le dépistage des gènes des TSA et de leurs variantes 15,22,23. Le plus grand défi dans la recherche sur les TSA chez les mouches est que, contrairement à d’autres modèles de maladies, il n’existe pas de modèle unique de mouche TSA. Pour comprendre l’impact des mutations ou de l’inactivation d’un gène spécifique de TSA, un chercheur doit valider si les phénotypes comportementaux imitent suffisamment les symptômes des patients atteints de TSA, puis procéder à la compréhension des fondements moléculaires ou physiologiques des phénotypes.

Par conséquent, la détection de phénotypes de type TSA est essentielle à la recherche sur les TSA dans le modèle de mouche. Une poignée de techniques comportementales ont émergé au fil des ans qui nous permettent de détecter des anomalies telles que des déficits dans le comportement/l’interaction sociale, la communication, les comportements répétitifs et la réactivité aux stimuli. De plus, plusieurs modifications et mises à niveau de ces techniques comportementales ont été apportées dans différents laboratoires pour répondre à des exigences spécifiques telles que la mise à l’échelle, l’automatisation des tests, les lectures, la quantification et les méthodes de comparaison. Dans cet article vidéo, les versions les plus basiques de cinq paradigmes comportementaux sont présentées, qui, en combinaison, peuvent être utilisés pour détecter les résultats comportementaux de type TSA de la manière la plus simple.

L’agression est un comportement inné conservé au cours de l’évolution qui affecte la survie et la reproduction²⁴. Le comportement agressif envers les congénères est influencé par la « motivation à la socialisation »^25,26 ainsi que par la « communication »²⁷, les deux étant compromis chez les personnes atteintes de TSA. Le comportement agressif est bien décrit chez la drosophile et sa quantifiabilité grâce au test d’agression robuste 28,29,30 et à une base génétique et neurobiologique bien comprise³¹ en fait un paradigme comportemental approprié ³² pour évaluer le phénotype TSA dans un modèle de mouche. L’agression est influencée par l’isolement social loin d’un environnement social, ce qui conduit à une agressivité accrue ; La même chose a été observée lorsque les mouches mâles sont logées en isolement pendant quelques jours^33,34. Un autre test comportemental qui quantifie la sociabilité chez les mouches est le Social Space Assay³⁵, qui mesure les distances entre les voisins les plus proches et les distances entre les mouches dans un petit groupe de mouches, ce qui le rend parfaitement adapté pour tester les rôles des orthologues des gènes TSA chez les mouches 12,21,36,37 ainsi que chez les modèles de mouches TSA induites par l’environnement ^{38, 39}. Planche à billets

Le test de parade nuptiale de la drosophile est un autre paradigme comportemental fréquemment utilisé pour tester l’altération des compétences sociales et de communication lors d’un circuit ou d’une manipulation génétique, y compris les gènes liés à l’autisme 18,19,21,40. Les modèles de comportement répétitifs sont répandus chez les patients atteints de TSA, ce qui est récapitulé chez les mouches par le comportement de toilettage - une série d’actions distinctes et stéréotypées effectuées pour le nettoyage et à d’autres fins. Il a été utilisé avec succès pour tester l’impact des mutations du gène TSA chez les mouches^21,41 ainsi que l’exposition aux produits chimiques^38,39. De multiples avancées et automatisations dans le test ont été décrites avant 16,41,42,43 ; Ici, nous démontrons le modèle de test le plus basique, qui est facile à adopter et à quantifier.

Les TSA sont connus pour avoir un impact sur la capacité d’accoutumance, d’apprentissage et de mémoire chez certains patients 44,45,46,47,48,49,50, organismes modèles TSA ^51,52 et provoquent également des déficits dans différents comportements olfactifs⁵⁰. L’habituation au saut lumineux de la drosophile a déjà été utilisée pour dépister les gènes^{TSA 23}. L’habituation peut être mesurée par une méthode simple d’habituation olfactive 53,54,55. Nous décrivons la méthode pour induire l’habituation olfactive et analysons le résultat à l’aide d’un test binaire classique basé sur un labyrinthe en Y⁵⁶ qui peut être utilisé pour détecter les défauts d’accoutumance dans le mutant du gène ASD ou l’inactivation du gène. Pour évaluer si l’impact d’une mutation (ou d’un inactivation génétique) ou d’un traitement pharmacologique sur le comportement d’une mouche équivaut à un phénotype de type TSA, on peut utiliser une combinaison de ces 5 tests décrits ici.

Protocole

Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Dosage de l’agression

1. Préparation de l’arène de l’essai d’agression
   1. Prenez une plaque standard de 24 puits (figure 1A) et utilisez chaque puits de la plaque comme une seule « arène » (figure 1B) pour l’agression des mouches. Remplissez la moitié de chaque puits avec de la nourriture pour mouches ordinaire et laissez-le sécher pendant la nuit.
      REMARQUE : En option, un point focal pour l’agression peut être inclus dans l’arène, comme un point de pâte de levure ou une femelle décapitée pour assurer l’agression masculine.
   2. Prenez n’importe quelle feuille de plastique / acrylique transparente, suffisamment pour couvrir la surface d’environ trois à quatre puits. Perforez la feuille pour faire une petite ouverture de ~2,5 mm de diamètre pour insérer des mouches individuelles dans les puits à travers celle-ci.
2. Préparation de l’aspirateur de mouches
   1. Prenez un tube en caoutchouc/silicone de 30 à 50 cm de long (Figure 1C1).
   2. Prenez une pointe de pipette de 200 μL (ou 1 000 μL) et coupez-la à ~1 cm de la pointe étroite. Insérez l’extrémité coupée à une extrémité du tube en caoutchouc ; Cette pointe sera l’extrémité de la bouche, utilisée pour l’aspiration par la bouche.
   3. Prenez une autre pointe de pipette et coupez l’extrémité étroite de cette pointe pour faire une ouverture suffisante pour qu’une mouche puisse y entrer. Insérez la base de cette pointe de pipette dans l’extrémité arrière du tube ; il s’agira de l’extrémité de la mouche de l’aspirateur, à partir de laquelle la mouche sera aspirée (Figure 1C2).
   4. Insérez un morceau de tissu en maille ou une fine couche de coton sur l’extrémité de la braguette du tube, à la jonction entre le tube et la pointe. Assurez-vous qu’une mouche aspirée dans la pointe de la pipette reste coincée dans la pointe, devant le filet.
   5. Scellez les jonctions entre le tuyau et les pointes de pipette à l’aide de parafilm.
3. Préparation de tubes à boîtier unique et de flacons à logement de groupe
   1. Préparation des tubes à boîtier unique
      1. Ajoutez près de 500 μL de nourriture pour mouches fraîchement préparée dans un tube de microfuge de 2 mL (figure 1D). À l’aide d’une mini-centrifugeuse, descendez les aliments vers la partie inférieure du tube.
      2. Réglez les aliments pour qu’ils se solidifient à température ambiante en gardant le couvercle ouvert pendant la nuit. Couvrez les tubes avec un morceau de tissu fin pour empêcher les mouches errantes de pénétrer dans les tubes.
      3. Perforez les couvercles des tubes de microfuge avec des aiguilles pour la circulation de l’air et fermez les couvercles une fois que les aliments sont solidifiés.
   2. Préparation de flacons d’hébergement de groupe
      1. Prenez des flacons de mouches ordinaires et remplissez-les au minimum avec des aliments fraîchement préparés (figure 1D).
4. Préparation des mouches avant l’expérience
   1. Maintenir les lignées de mouches des génotypes désirés dans des bouteilles régulières en verre/plastique contenant de la nourriture anti-mouches standard dans un incubateur à 25 °C sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures.
   2. Prélever les mouches nouvellement fermées (0 à 24 h) du génotype désiré et les séparer par sexe sous anesthésie au dioxyde de carbone à l’aide d’un stéréomicroscope.
   3. Insérez la moitié des mouches mâles individuellement dans des « tubes à boîtier unique ». Gardez l’autre moitié des mouches mâles dans un groupe de 10 avec les mouches femelles dans des « flacons de logement de groupe » réguliers, créant ainsi une condition sociale. Conservez tous les tubes et flacons à 25 °C pendant 5 jours.
      REMARQUE : Maintenez une température de 24-25 °C et ~50% d’humidité dans la salle de comportement. Les souches de mouches utilisées étaient : les mouches mutantes trans-hétérozygotes w¹¹¹⁸ et FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Les mouches Fmr1 , qui ont été maintenues en isolement pendant 5 jours, montrent une diminution significative des épisodes d’agression envers un autre mâle (Figure 1E).
5. Réalisation de l’expérience de comportement d’agression
   1. Effectuez l’expérience d’agression pendant la fenêtre horaire ZT0-ZT3, car les mouches montrent un pic d’activité à ce moment de la journée.
      REMARQUE : ZT=Temps Zeitgeber dans un cycle standard lumière/obscurité de 12 heures ; ZT0= lumières allumées, c’est-à-dire le début de la phase d’éclairage, ZT3= 3 h après le début de la phase d’éclairage, et ainsi de suite. ZT12 = lumières éteintes.
   2. Transférez deux mouches mâles des chambres d’habitation simples ou de groupe par la méthode d’aspiration buccale à l’arène d’agression par le trou du couvercle ; Éloignez immédiatement le trou pour vous assurer que les mouches ne peuvent pas s’échapper.
   3. Laissez les mouches s’acclimater dans l’arène pendant 1 à 2 minutes. Démarrez une minuterie pendant 20 min. Enregistrez les mouches pendant les 20 minutes en plaçant une caméra ou un téléphone portable exactement verticalement au-dessus de l’arène à l’aide d’un support. Assurez-vous que les types d’attaques agressives sont visibles dans la vidéo.
      REMARQUE : Assurez-vous d’un éclairage clair de l’arène et évitez tout éblouissement/réflexion du couvercle tombant directement sur l’objectif de l’appareil photo.
   4. Répétez l’expérience pour 15 à 20 paires de mouches pour chaque génotype et chaque type de condition de logement.
      REMARQUE : Les préjugés inconscients peuvent être annulés par la double insu des mouches témoins et des mouches d’essai, ainsi que par des fichiers vidéo appartenant à plusieurs génotypes.
6. Analyse des données du test d’agression
   1. Transférez les fichiers vidéo sur un ordinateur doté d’un écran suffisamment grand pour que les combats d’agression soient visibles.
   2. Jouez la vidéo et comptez le nombre total de combats agressifs dans un laps de temps de 20 min^58,59.
   3. Compilez et organisez les données de chaque génotype et de chaque modèle de logement dans une feuille de calcul et effectuez l’analyse des données à l’aide de n’importe quel logiciel statistique. Effectuez un test t bilatéral et tracez les données sous forme de boîte et de moustaches.

2. Essai de l’espace social

REMARQUE : Le protocole de dosage, l’arène et l’analyse décrits ici ont été décrits précédemment^60,61.

1. Préparation de l’arène de l’essai de l’espace social (SSA)
   1. Placez les deux intercalaires triangulaires en acrylique (hauteur = 8,9 cm, base = 6,7 cm et épaisseur = 0,3 cm) à plat sur une vitre rectangulaire (13,5 cm x 10,4 cm, épaisseur 0,3 cm) de sorte que les angles droits des entretoises en acrylique soient alignés avec les coins de la vitre (Figure 2A).
   2. Placez deux intercalaires rectangulaires en acrylique (6,7 cm x 1,5 cm, épaisseur = 0,3 cm) à plat sur la vitre, alignés avec les bases des deux intercalaires triangulaires. Après cette disposition, vérifiez que les quatre entretoises en acrylique entourent une arène triangulaire (~2,16 cm²⁶¹) sur la vitre rectangulaire qui n’est pas recouverte par des entretoises (Figure 2A,B). Placez un autocollant d’une règle (Figure 2C) sur l’une des entretoises triangulaires et assurez-vous qu’il est visible du haut.
   3. Placez maintenant une deuxième vitre rectangulaire (13,5 cm x 10,4 cm, épaisseur 0,3 cm) sur les entretoises en acrylique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la vitre en bas ; Les intercalaires en acrylique se retrouvaient pris en sandwich entre l’espace vitré, laissant un espace triangulaire au milieu entre deux vitres. Utilisez quatre petites pinces à reliure pour maintenir les vitres et les entretoises.
2. Préparation des mouches pour l’ASS
   1. Prélever les mouches nouvellement fermées (0 à 24 h) du génotype désiré et les séparer par sexe sous anesthésie froide à l’aide d’un stéréomicroscope.
      REMARQUE : Réfrigérez l’appareil d’anesthésie froide (une boîte de Pétri peut être utilisée) dans un incubateur à -20 °C. Placez les mouches dans des flacons vides, immergez-les dans de la glace (dans un seau à glace) jusqu’à ce qu’elles deviennent immobiles, placez-les sur la boîte de Pétri froide et commencez à trier.
   2. Conservez les mouches mâles et femelles séparément pendant 24 h dans des flacons alimentaires dans un incubateur à 25 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.
      REMARQUE : Pour les expériences démontrées ici, les souches de mouches utilisées étaient des mouches mutantes trans-hétérozygotes w¹¹¹⁸ et FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Réalisation de l’expérience SSA
   1. Maintenir les mêmes conditions expérimentales que le test d’agression (température : 24-25°C, humidité ~ 50%) et effectuer l’expérience pendant la fenêtre temporelle ZT0-ZT3.
   2. Retirez la pince de reliure en bas à droite et décalez légèrement cette entretoise rectangulaire vers l’extérieur de sorte qu’un espace (~0,5 cm) soit créé entre les deux entretoises rectangulaires.
   3. Transférez les mouches (ramassées la veille) du flacon alimentaire dans un flacon vide. Transférez-les dans l’arène de l’espace social (la zone triangulaire) par aspiration douce à travers l’espace créé entre les intercalaires rectangulaires. Fermez immédiatement l’espace en faisant glisser l’entretoise rectangulaire et la pince à reliure dans leurs positions et assurez-vous qu’il ne reste aucun espace pour que les mouches puissent s’échapper.
   4. En tenant la chambre en position verticale, martelez doucement la chambre 3 fois sur un tampon souple pour vous assurer que toutes les mouches sont à la base de la chambre au début de l’expérience.
   5. Fixez la chambre SSA en position verticale et démarrez la minuterie. Prenez une photo claire de l’arène après 20 minutes lorsque les mouches s’installent à leurs positions dans l’arène et montrent un minimum de mouvement. Évitez l’éblouissement et l’éclairage irrégulier.
   6. Répétez l’expérience 3 fois pour la même population de mouches en martelant les mouches et en répétant les étapes des étapes 2.3.5 à 2.3.7 (répétitions internes). Répétez 3 fois avec une population différente de mouches du même génotype/condition (répétitions indépendantes).
      REMARQUE : Congelez la chambre de test pour jeter les mouches de la chambre. Essuyez les surfaces en verre et en plastique avec de l’éthanol pour éliminer toutes les odeurs après une série d’expériences avec un groupe de mouches.
4. Analyse des données d’analyse de l’espace social
   1. Analysez les images dans le logiciel ImageJ⁶² et listez les distances entre les vols les plus proches voisins comme décrit précédemment⁶¹.
   2. Effectuer des analyses statistiques et tracer des graphiques à l’aide de logiciels statistiques.
      REMARQUE : Les souches de mouches utilisées pour le test SSA décrit ici étaient des mouches mutantes trans-hétérozygotes w¹¹¹⁸ et Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Les mouches Fmr1 présentent une distance significativement accrue par rapport aux voisins les plus proches (Figure 2D).

3. Test de parade nuptiale

1. La chambre nuptiale
   1. Assemblez les quatre pièces de la chambre nuptiale (figure 3A) dans l’ordre indiqué à la figure 3B. Chaque perforation du disque central, prise en sandwich entre le couvercle et les pièces de base, fonctionnera comme la « chambre nuptiale » (figure 3C).
2. Obtention de femelles préaccouplées
   1. Démarrez et maintenez plusieurs bouteilles de culture de mouches CS (Canton S, type sauvage) avec ~60-100 mouches mâles et femelles dans chaque bouteille de nourriture.
   2. Lorsque les adultes émergent, jetez toutes les mouches adultes et transférez les mouches sortant de ces bouteilles toutes les 2 à 3 heures dans de nouveaux flacons de nourriture complétés par une petite quantité de pâte de levure.
      REMARQUE : Évitez de surcharger les flacons. Veillez à ne pas transférer de vieilles mouches, des larves ou des pupes dans le flacon d’accouplement.
   3. Incuber ces « fioles d’accouplement » pendant 4 jours pour s’assurer que toutes les femelles se sont accouplées.
3. Préparation de tubes à boîtier unique pour les mâles
   1. Ajoutez près de 500 μL de nourriture pour mouches dans chaque tube de microfuge de 2 ml. Utilisez une minicentrifugeuse pour tirer les aliments vers le bas vers la partie inférieure du tube.
   2. Laissez la solidification de la nourriture pendant la nuit, coupez le couvercle du tube de microfuge, couvrez-le de parafilm et perforez le parafilm avec une aiguille pour la circulation de l’air.
4. Collecte et isolement des mâles vierges
   1. Mettez en place des croisements avec 10 à 15 mâles et 20 à 30 femelles vierges des génotypes souhaités dans des flacons alimentaires séparés.
   2. Prélever des mâles vierges des génotypes souhaités dans la descendance et les conserver individuellement dans des « tubes à boîtier unique » à l’aide de l’aspirateur. Continuez à prélever les mâles nouvellement enfermés toutes les 5 à 6 heures (jusqu’à 40 à 50 mâles pour chaque génotype) et isolez-les dans des tubes individuels à boîtier unique.
   3. Refermez le couvercle du tube avec le parafilm.
5. Réalisation de l’expérience de test de parade nuptiale
   1. Après 5 jours d’isolement des mâles testés, effectuez le test de parade nuptiale pendant la fenêtre de temps ZT0-ZT3.
   2. Installez les appareils d’enregistrement vidéo bien à l’avance, en vous concentrant sur l’espace de travail du test.
   3. À l’aide d’un aspirateur, prélever une femelle préaccouplée (âgée de 6 à 10 jours) dans les flacons d’accouplement et l’insérer dans une chambre nuptiale.
   4. À l’aide de l’aspirateur, transférez doucement une mouche mâle (témoin/test) du tube à boîtier unique à la chambre nuptiale contenant la femelle préaccouplée unique à travers le trou de transfert. Tournez rapidement le couvercle pour fermer la chambre.
   5. Enregistrement vidéo du comportement des mouches pendant 15 min.
6. Analyse des données vidéo et statistiques
   1. Transférez les fichiers vidéo sur un ordinateur ; Notez la durée du temps passé par le mâle en parade nuptiale pendant 15 min en parcourant manuellement la vidéo.
   2. Calculez l’indice de parade nuptiale (IC) pour chaque mouche mâle, qui est la fraction (ou le pourcentage) du temps passé par le mâle à courtiser la femelle pendant 15 min.
   3. Comptez le nombre total de tentatives de copulation en 15 min.
   4. Notez la durée du décalage temporel montré par le mâle avant sa première tentative de courtisation comme la latence de parade nuptiale (CL).
      REMARQUE : Il est recommandé d’analyser 40 à 60 mâles par affection/génotype pour obtenir une puissance statistique et déterminer la cohérence des résultats de l’IC.

4. Test du comportement de toilettage

1. Arène d’essai du comportement de toilettage
   1. Utilisez une petite chambre circulaire d’un volume de ~0,4 cm³ comme arène pour enregistrer le comportement de toilettage.
      REMARQUE : La même arène nuptiale décrite dans la section 3 peut être utilisée pour le test de comportement de toilettage.
   2. Comme le comportement de toilettage implique l’enregistrement du mouvement d’organes plus fins comme les jambes, utilisez un enregistrement vidéo haute résolution ou à contraste élevé. Pour suivre ce protocole, utilisez un panneau LED recouvert de verre diffus comme surface uniformément éclairée de dimensions 20 cm x 20 cm. Placez la chambre nuptiale sur le dessus du panneau pour vous assurer que la lumière passe du bas à travers la chambre.
2. Préparation des mouches avant l’expérience
   1. Maintenir les mouches génotypes expérimentales dans des bouteilles alimentaires à 25 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures.
   2. Prélever des mouches nouvellement fermées (0 à 24 h) du génotype désiré et les séparer par sexe sous anesthésie froide à l’aide d’un stéréomicroscope comme décrit dans le test de l’espace social.
   3. Isoler les mouches mâles dans des tubes à boîtier unique (comme utilisé dans l’essai d’agression) pendant 24 h.
      REMARQUE : Pour l’expérience démontrée ici, les souches de mouches utilisées étaient : des mouches mutantes trans-hétérozygotes W¹¹¹⁸ et FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Réalisation du test de comportement de toilettage
   1. Maintenir une température de 24-25 °C et une humidité ~ 50% ; effectuer l’expérience pendant la fenêtre de temps ZT0-ZT3¹⁶.
   2. Transférez une mouche mâle à logement unique d’un tube à boîtier unique dans l’arène de toilettage à l’aide d’un aspirateur. Faites glisser immédiatement le trou dans le couvercle pour vous assurer que les mouches ne peuvent pas s’échapper.
   3. Placez l’arène de toilettage sur un panneau LED diffus et laissez la mouche s’acclimater dans l’arène pendant 1 min. Enregistrez la vidéo pendant 10 min en plaçant la caméra exactement verticalement au-dessus de l’arène montée sur un support. Assurez-vous que les types de séances de toilettage sont visibles et quantifiables dans la vidéo.
      REMARQUE : Le comportement de toilettage comprend le frottement de la tête, des yeux, des antennes, du proboscis thorax, de l’abdomen, des organes génitaux et des ailes avec des pattes (première paire : T1, deuxième paire : T2 ou troisième paire de pattes : T3). Les paramètres comportementaux de toilettage qui ont été pris en compte dans cette étude sont décrits dans Andrew et al. ⁴¹ et démontrés dans la figure 4.
   4. Répétez l’expérience pour chaque génotype.
   5. Analyse des données comportementales de toilettage
      1. Analysez les vidéos et calculez les quatre paramètres suivants : Indice de toilettage (pourcentage de temps passé dans le toilettage) ; latence de toilettage (temps jusqu’à la première séance de toilettage) ; numéro de toilettage ; et la durée moyenne du toilettage (durée totale du combat/nombre de combats).
      2. Marquez une seule séance de toilettage comme terminée lorsqu’une mouche cesse de montrer l’un des paramètres et reste immobile pendant 2 secondes ou arrête la course et fait au moins 4 pas.

5. Dosage de l’habituation olfactive

REMARQUE : Comme le montre la figure 5, l’assemblage final doit être effectué le jour de l’essai du labyrinthe en Y^54,56.

1. Préparer les mouches à l’accoutumance
   1. Élever des mouches des génotypes souhaités pour toutes les expériences dans un incubateur avec une température ambiante de 25 ^°C et 70 % d’humidité sous une lumière standard de 12 h : 12 h de cycle d’obscurité (LD).
   2. Collectez les mouches âgées de 0 à 12 h et nouvellement fermées et transférez ~30 à 40 mouches dans une bouteille moyenne fraîche avec un bouchon en coton resserré.
   3. Attribuez des codes à chaque bouteille pour que l’expérimentateur ne connaisse pas les génotypes soumis à l’expérimentation.
2. Induction de l’habituation olfactive
   1. Placez 1 ml de l’odorisant préféré dilué avec du liquide de paraffine (léger) dans un tube de microfuge de 1,5 ml. Pour le contrôle, il suffit d’utiliser 1 mL de paraffine liquide légère dans un tube microfuge de 1,5 mL. Agitez le contenu dans le tube pendant 10 minutes pour assurer un mélange uniforme, puis couvrez-le d’une pellicule plastique uniformément perforée.
      REMARQUE : Dans la vidéo, 20% de butyrate d’éthyle sera utilisé.
   2. Utilisez du fil pour suspendre les tubes contenant l’odorant dilué ou uniquement le liquide diluant dans des flacons séparés contenant des mouches.
   3. Couvrez bien les bouteilles de coton, puis enveloppez-les de papier kraft pour éviter la diffusion de la vapeur odorante. Étiquetez les flacons de contrôle et les flacons contenant des odeurs comme étant naïfs et exposés aux odeurs (habitués), respectivement. Conservez ces flacons d’induction pendant 3 jours dans un incubateur dans les conditions mentionnées ci-dessus.
3. Préparation des mouches et de l’appareil du labyrinthe en Y
   1. Transférez les mouches des bouteilles à induction dans des flacons contenant uniquement du papier filtre imbibé d’eau.
   2. Affamez-les pendant environ 16 à 18 h à température ambiante avant l’expérience pour augmenter la motivation.
   3. S’assurer que les composants de l’appareil du labyrinthe en Y sont propres et sans odeur ; Assemblez les quatre parties de manière verticale. Fixez les chambres d’escalade au labyrinthe en Y, qui est ensuite connecté au haut de l’adaptateur. Fixez fermement le fond du labyrinthe en Y à la fiole d’entrée qui sert de tige centrale au fond, comme illustré à la figure 5.
   4. Connectez l’extrémité effilée de chaque chambre d’escalade avec les flacons de réactifs contenant de l’odorisant (dilution ^10-3 avec de l’eau distillée) à l’aide de tubes en silicone sans odeur.
   5. Pompez l’odorisant à un débit égal (~120 mL/min) des bouteilles de gaz vers les deux bras du Y à l’aide d’une pompe à vide et laissez-le saturer pendant 15 min pour plus de consistance.
4. Réalisation de l’essai classique du labyrinthe en Y
   1. Introduisez doucement les mouches affamées de chaque flacon dans le flacon d’entrée de la configuration du labyrinthe en Y.
   2. Laissez-les s’acclimater pendant une brève période ; connectez le flacon d’entrée avec l’adaptateur Y-maze pour commencer le test ; et laissez les mouches grimper dans les bras du labyrinthe en Y et se retrouver piégées dans les deux chambres de collecte. Réglez la durée de chaque test sur 1 min.
   3. Une fois terminé, remettez les mouches au fond de la fiole d’entrée et changez la position des bras du labyrinthe en Y pour éviter les biais latéraux. Prenez quatre lectures pour le même ensemble de mouches.
   4. Notez le nombre de mouches grimpant sur chacun des deux bras du labyrinthe en Y pendant la durée de l’opération.
   5. Répétez le test pour au moins 8 lots afin d’obtenir un ensemble de données représentatif.
5. Analyse et interprétation des données collectées
   1. Quantifiez les résultats en calculant l’indice de performance (IP), qui peut être représenté comme la différence entre le nombre de mouches choisissant le bras d’air (A) et le nombre de mouches choisissant le bras d’odeur (O) en tant que fraction du nombre total de mouches participantes.
   2. Utilisez des tests statistiques (test t de Student non apparié) pour vérifier si l’IP des mouches naïves par rapport aux mouches exposées aux odeurs est significative.

Résultats

Essai d’agression
En tant que modèle de mouche ASD, les mouches mutantes Fmr1 ont été utilisées^63,64. w¹¹¹⁸ mâles ont été utilisés comme mouches témoins et Fmr1 trans-hétérozygote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M⁵⁷ mouches mâles comme mouches expérimentales ; Les mâles adultes ont été logés dans des tubes d’isolement pendant 5 jours. Des mâles homotypiques (même...

Discussion

La drosophile est utilisée comme un excellent organisme modèle pour la recherche sur les troubles neurologiques humains en raison d’un haut degré de conservation des séquences génétiques entre les gènes de la mouche et de la maladie humaine⁹. De nombreux paradigmes comportementaux robustes en font un modèle attrayant pour l’étude des phénotypes se manifestant chez les mutants récapitulant les maladies humaines. Comme des centaines de gènes sont impliqués dans les troubles...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971