JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Расстройство аутистического спектра (РАС) связано с нарушением социального и коммуникативного поведения и возникновением повторяющегося поведения. Для изучения взаимосвязи между генами РАС и поведенческим дефицитом в модели дрозофилы в данной статье описаны пять поведенческих парадигм для анализа социального пространства, агрессии, ухаживания, ухода и привыкания.

Аннотация

Расстройство аутистического спектра (РАС) включает в себя гетерогенную группу расстройств развития нервной системы с общими поведенческими симптомами, включая дефицит социального взаимодействия и способности к общению, усиленное ограниченное или повторяющееся поведение, а также, в некоторых случаях, неспособность к обучению и двигательный дефицит. Дрозофила послужила не имеющим аналогов модельным организмом для моделирования большого числа заболеваний человека. Поскольку многие гены были вовлечены в РАС, плодовые мушки стали мощным и эффективным способом проверки генов, предположительно участвующих в этом расстройстве. Поскольку сотни генов с различными функциональными ролями вовлечены в РАС, единая генетическая модель РАС невозможна; Вместо этого отдельные генетические мутанты, нокдауны генов или основанные на сверхэкспрессии исследования гомологов генов, ассоциированных с РАС, являются распространенными средствами для получения информации о молекулярных путях, лежащих в основе этих генных продуктов. У дрозофилы доступно множество поведенческих техник, которые обеспечивают легкое считывание дефицита в конкретных поведенческих компонентах. Было показано, что анализ социального пространства, а также анализ агрессии и ухаживания у мух полезны для оценки дефектов в социальном взаимодействии или коммуникации. Груминговое поведение у мух является отличным считыванием повторяющегося поведения. Анализ привыкания используется у мух для оценки способности к привыканию, которая обнаруживается у некоторых пациентов с РАС. Комбинация этих поведенческих парадигм может быть использована для тщательной оценки состояния заболевания человека с РАС у мух. Используя мутантных мух Fmr1 , повторяя синдром ломкой X у людей и нокдаун ряда POGZ-гомолога у нейронов мух, мы показали количественно измеримый дефицит социального пространства, агрессии, брачного поведения, ухаживающего поведения и привыкания. Эти поведенческие парадигмы демонстрируются здесь в их простейших и понятных формах с предположением, что это будет способствовать их широкому использованию для исследований РАС и других расстройств развития нервной системы на моделях мух.

Введение

Расстройство аутистического спектра (РАС) включает в себя гетерогенную группу неврологических расстройств. Он включает в себя ряд сложных расстройств развития нервной системы, характеризующихся мультиконтекстуальными и стойкими дефицитами в социальной коммуникации и социальном взаимодействии, а также наличием ограниченных, повторяющихся поведенческих и активных моделей и интересов1. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), у 1 из 100 детей во всем мире диагностируется РАС с соотношением мужчин и женщин 4,22. Болезнь становится очевидной на втором или третьем году жизни. Дети с РАС демонстрируют отсутствие интереса к социально-эмоциональной взаимности, невербальному общению и навыкам взаимоотношений. Они демонстрируют повторяющееся поведение, такое как стереотипные моторные движения, негибкое и ритуализированное следование рутине, а также интенсивное внимание к ограниченным интересам. Дети с РАС демонстрируют высокую степень реакции на прикосновение, обоняние, звук и вкус, в то время как реакция на боль и температурусравнительно низкая. Пенетрантность этого расстройства также различна у разных пациентов, страдающих аутизмом, и, следовательно, вариабельность увеличивается.

В настоящее время клинический диагноз РАС основан на поведенческой оценке индивидуумов, поскольку не существует подтверждающего, основанного на биомаркерах или общего генетического теста, который охватывал бы все формы РАС3. Расшифровка генетических и нейрофизиологических основ была бы полезна для определения стратегий лечения. За последнее десятилетие большое количество исследований привело к идентификации сотен генов, которые либо удалены, либо мутировали, или уровни экспрессии которых изменены у пациентов с РАС. Текущие исследования подчеркивают валидацию вклада этих генов-кандидатов с использованием модельных организмов, таких как мышь или плодовая муха, у которых эти гены нокаутируются или сбиваются с ног, после чего проводятся тесты на поведенческие дефициты, подобные РАС, и выясняются основные генетические и молекулярные пути, вызывающие аномалии. Мышиная модель, повторяющая вариации числа копий (CNV) в хромосомных локусах человека 16p11.2, показывает некоторые поведенческие дефекты РАС 4,5,6. Пренатальное воздействие тератогенного препарата вальпроевой кислоты (VPA) является еще одной моделью мыши, демонстрирующей черты, напоминающие человеческие ASD 7,8. Кроме того, существует ряд мышиных моделей, которые демонстрируют генетический синдром-ассоциированный аутизм, например, одногенные синдромные модели, вызванные мутациями в Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, и одногенные несиндромальные модели, вызванные мутациями в таких генах, как Cntnap2, Shank, Neurexin или Neuroligin 5.

Плодовая муха (Drosophila melanogaster) является еще одним известным модельным организмом для изучения клеточных, молекулярных и генетических основ множества заболеванийчеловека, включая РАС. Дрозофилы и люди имеют общие высококонсервативные биологические процессы на молекулярном, клеточном и синаптическом уровнях. Плодовые мушки были успешно использованы в исследованиях РАС 10,11,12 для характеристики генов, связанных с РАС, и расшифровки их точной роли в синаптогенезе, синаптической функции и пластичности, сборке нейронных цепей и созревании; Было обнаружено, что гомологи генов, ассоциированных с РАС, играют роль в регуляции социального и/или повторяющегося поведения 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Плодовая муха также работала в качестве модели для скрининга генов РАС и их вариантов 15,22,23. Самая большая проблема в исследованиях РАС на мухах заключается в том, что, в отличие от других моделей заболеваний, не существует единой модели мухи с РАС. Чтобы понять влияние мутаций или подавления определенного гена РАС, исследователь должен проверить, достаточно ли поведенческие фенотипы имитируют симптомы пациентов с РАС, а затем перейти к пониманию молекулярных или физиологических основ фенотипов.

Следовательно, обнаружение РАС-подобных фенотипов имеет жизненно важное значение для исследований РАС на модели мухи. За эти годы появилось несколько поведенческих методов, которые позволяют нам обнаруживать аномалии, такие как дефицит социального поведения/взаимодействия, общения, повторяющегося поведения и реакции на раздражители. Кроме того, в различных лабораториях было внесено несколько модификаций и обновлений этих поведенческих методов в соответствии с конкретными требованиями, такими как масштабирование, автоматизация анализов, считывание, количественная оценка и методы сравнения. В этой видеостатье демонстрируются самые основные версии пяти поведенческих парадигм, которые в сочетании могут быть использованы для выявления поведенческих исходов РАС самым простым способом.

Агрессия – это эволюционно консервативное врожденное поведение, влияющее на выживание и размножение. На агрессивное поведение по отношению к сородичам влияет «мотивация к социализации»25,26, а также «общение»27, которые скомпрометированы у людей с РАС. Агрессивное поведение хорошо описано у дрозофилы, а его количественная оценка с помощью надежного анализа агрессии 28,29,30 и хорошо изученная генетическая и нейробиологическая основа 31 делают его подходящей поведенческой парадигмой32 для оценки фенотипа РАС на модели мухи. На агрессию влияет социальная изоляция вдали от социальной среды, что приводит к усилению агрессии; То же самое наблюдалось, когда самцы мух содержались в изоляции в течение нескольких дней33,34. Еще одним поведенческим анализом, который количественно оценивает общительность у мух, является Social Space Assay35, который измеряет расстояния между ближайшими соседями и расстояния между мухами в небольшой группе мух, что делает его идеально подходящим для проверки роли ортологов гена ASD у мух 12,21,36,37, а также у моделей мух с РАС, вызванных окружающей средой38. 39.

Тест на ухаживание дрозофилы является еще одной поведенческой парадигмой, часто используемой для анализа на изменение социальных и коммуникативных навыков при круговых или генетических манипуляциях, включая гены, связанные с аутизмом 18,19,21,40. Повторяющиеся модели поведения преобладают у пациентов с РАС, которые повторяются у мух путем груминга — серии отчетливых, стереотипных действий, выполняемых для уборки и других целей. Он был успешно использован для анализа влияния мутаций гена РАС у мух 21,41, а также воздействия химических веществ 38,39. Многочисленные усовершенствования и автоматизация в анализе были описаны ранее 16,41,42,43; Здесь мы демонстрируем самую простую схему анализа, которую легко принять и количественно оценить.

Известно, что РАС влияет на способность к привыканию, обучению и памяти у некоторых пациентов 44,45,46,47,48,49,50, модельные организмы РАС 51,52, а также вызывает дефицит различного обонятельного поведения50. Привыкание дрозофил к прыжку при выключении света ранее использовалось для скрининга генов РАС23. Привыкание может быть измерено простым методом анализа обонятельного привыкания 53,54,55. Мы описываем метод индуцирования обонятельного привыкания и анализа результата с использованием классического бинарного анализа выбора запаха56 на основе Y-лабиринта, который может быть использован для выявления дефектов привыкания при мутантном гене РАС или состоянии нокдауна гена. Чтобы оценить, является ли влияние мутации (или нокдауна гена) или фармакологического лечения на поведение мухи фенотипом, подобным РАС, можно использовать комбинацию этих 5 анализов, описанных здесь.

протокол

Подробную информацию обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Анализ на агрессию

  1. Подготовка арены для анализа на агрессию
    1. Возьмите стандартный планшет с 24 лунками (рисунок 1A) и используйте каждую лунку планшета в качестве отдельной «арены» (рисунок 1B) для агрессии мухи. Заполните половину каждой лунки обычным кормом для мух и дайте ему высохнуть в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, на арене может быть предусмотрена точка фокусировки для агрессии, например, точка дрожжевой пасты или обезглавленная самка для обеспечения мужской агрессии.
    2. Возьмите любой прозрачный пластиковый/акриловый лист, достаточно, чтобы покрыть поверхность примерно тремя-четырьмя лунками. Перфорируйте лист, чтобы сделать небольшое отверстие диаметром ~2,5 мм для введения отдельных мушек в лунки через него.
  2. Подготовка аспиратора от мухи
    1. Возьмите резиновую/силиконовую трубку длиной 30-50 см (рисунок 1C1).
    2. Возьмите наконечник пипетки объемом 200 мкл (или 1 000 мкл) и отрежьте его на расстоянии ~1 см от узкого кончика. Вставьте отрезанный конец в один конец резиновой трубки; Этот наконечник будет «ротовым концом», используемым для аспирации через рот.
    3. Возьмите еще один наконечник пипетки и отрежьте узкий конец этого наконечника, чтобы сделать отверстие, достаточное для того, чтобы муха могла проникнуть через него. Вставьте основание этого наконечника для пипетки в хвостовой конец трубки; это будет «конец мухи» аспиратора, откуда муха будет отсасывать (Рисунок 1C2).
    4. Вставьте кусок сетчатой ткани или тонкий слой ваты на «конец мухи» трубки – в место соединения трубки и кончика. Убедитесь, что муха, всасываемая в наконечник пипетки, остается в ловушке наконечника, перед сеткой.
    5. Загерметизируйте места соединения между трубкой и наконечниками пипетки с помощью парапленки.
  3. Подготовка однокорпусных пробирок и групповых пробирок
    1. Подготовка однокорпусных труб
      1. Добавьте почти 500 μл свежеприготовленного корма для мух в микрофуговую пробирку объемом 2 мл (рис. 1D). С помощью мини-центрифуги вытяните продукты на нижнюю часть пробирки.
      2. Дайте пище застыть при комнатной температуре, держа крышку открытой в течение ночи. Накройте трубки тонким куском ткани, чтобы предотвратить попадание в них бродячих мух.
      3. Продырявите крышки микропробирок иглами для циркуляции воздуха и закройте крышки после того, как пища застынет.
    2. Приготовление флаконов с групповым размещением
      1. Возьмите обычные флаконы от мух и наполните минимальное количество флаконов свежеприготовленной пищей (Рисунок 1D).
  4. Подготовка мух перед экспериментом
    1. Поддерживайте линии мух желаемых генотипов в обычных стеклянных/пластиковых бутылках, содержащих стандартный корм для мух, в инкубаторе при температуре 25 °C в течение 12-часового цикла свет/темнота.
    2. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под наркозом углекислого газа с помощью стереомикроскопа.
    3. Вставляйте половину самцов мух по отдельности в «однокорпусные трубки». Держите вторую половину самцов мух в группе из 10 человек, а самок — в обычных «групповых пробирках», создавая социальные условия. Хранить все пробирки и флаконы при температуре 25 °C в течение 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру 24-25 °C и влажность ~50% в комнате поведения. В качестве образцов использовались следующие штаммы мух: w1118 и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Мухи Fmr1 , которые содержались в изоляции в течение 5 дней, демонстрируют значительно сниженные приступы агрессии по отношению к другому самцу (Рисунок 1E).
  5. Проведение эксперимента по агрессивному поведению
    1. Проведите эксперимент с агрессией во временном окне ZT0-ZT3, поскольку мухи демонстрируют пиковую активность в это время суток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ZT = время Zeitgeber в стандартном 12-часовом цикле свет/темнота; ZT0 = загорается, то есть в начале световой фазы, ZT3 = через 3 часа после начала световой фазы и так далее. ZT12 = свет выключен.
    2. Перенесите двух самцов мухи из камер с одиночным или групповым содержанием методом аспирации ртом на арену агрессии через отверстие в крышке; Немедленно отодвиньте отверстие, чтобы мухи не смогли убежать.
    3. Дайте мухам акклиматизироваться в пределах арены в течение 1-2 минут. Запустите таймер на 20 минут. Записывайте на видео мух в течение всех 20 минут, разместив камеру или мобильный телефон точно вертикально над ареной с помощью подставки. Убедитесь, что виды агрессивных схваток видны на видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте четкое освещение арены и избегайте попадания бликов/отражений от крышки непосредственно на объектив камеры.
    4. Повторите эксперимент для 15-20 пар мух для каждого генотипа и каждого типа жилищных условий.
      Примечание: Бессознательная предвзятость может быть сведена на нет двойным ослеплением контрольных и тестовых мух, а также видеофайлов, принадлежащих к нескольким генотипам.
  6. Анализ данных анализа на агрессию
    1. Перенесите видеофайлы на компьютер с достаточно большим экраном, чтобы были видны агрессивные схватки.
    2. Посмотрите видео и посчитайте общее количество агрессивных боев за 20 минут58,59.
    3. Собирайте и систематизируйте данные по каждому генотипу и каждому типу жилья в электронной таблице и выполняйте анализ данных с помощью любого статистического программного обеспечения. Выполните двухсторонний t-критерий и отобразите данные в виде прямоугольника и усов.

2. Анализ социального пространства

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол анализа, арена и анализ, описанные здесь, были описаны ранее60,61.

  1. Подготовка арены для анализа социального пространства (SSA)
    1. Поместите обе треугольные акриловые распорки (высота = 8,9 см, основание = 6,7 см и толщина = 0,3 см) на верхнюю часть прямоугольного стекла (13,5 см x 10,4 см, толщина 0,3 см) таким образом, чтобы прямые углы акриловых распорок совпадали с углами стекла (рис. 2A).
    2. Положите две прямоугольные акриловые распорки (6,7 см х 1,5 см, толщина = 0,3 см) на стеклянную панель, выровненную по основаниям двух треугольных распорок. После этого убедитесь, что четыре акриловые распорки окружают треугольную арену (~2,16 кв. см61) на прямоугольном стекле, которое не закрыто распорками (рис. 2A, B). Поместите наклейку с изображением линейки (рисунок 2C) на одну из треугольных распорок и убедитесь, что она видна сверху.
    3. Теперь поместите второе прямоугольное стекло (13,5 см x 10,4 см, толщина 0,3 см) поверх акриловых распорок так, чтобы оно совпадало со стеклом внизу; Акриловые распорки в конечном итоге оказывались зажатыми между стеклянным пространством, оставляя треугольное пространство посередине между двумя стеклянными панелями. Используйте четыре небольших зажима для крепления стекол и распорок.
  2. Подготовка мух к SSA
    1. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под холодной анестезией с помощью стереомикроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите аппарат для холодной анестезии (можно использовать чашку Петри) в инкубаторе при температуре -20 °C. Поместите мух в пустые флаконы, погрузите эти флаконы в лед (в ведро со льдом) до тех пор, пока мухи не станут неподвижными, поместите их на холодную чашку Петри и начните сортировать.
    2. Храните самцов и самок мух отдельно в течение 24 часов в пищевых флаконах в инкубаторе при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продемонстрированных здесь экспериментов использовались штаммы мух w1118 и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Проведение эксперимента SSA
    1. Поддерживайте те же условия эксперимента, что и при анализе на агрессию (температура: 24-25°C, влажность ~ 50%) и проводите эксперимент во временном окне ZT0-ZT3.
    2. Снимите нижний правый зажим для связующего и слегка сдвиньте прямоугольную распорку наружу, чтобы между двумя прямоугольными распорками образовался зазор (~0,5 см).
    3. Переложите мух (собранных накануне) из флакона с едой в пустой флакон. Перенесите их на арену социального пространства (треугольную область) с помощью мягкого устремления через пространство, созданное между прямоугольными распорками. Немедленно закройте пространство, сдвинув прямоугольную распорку и зажим для связующего вещества на свои места, и убедитесь, что не осталось места для побега мух.
    4. Удерживая камеру в вертикальном положении, осторожно постучите по камере 3 раза по мягкой подушечке, чтобы убедиться, что все мухи находятся у основания камеры в начале эксперимента.
    5. Зажмите камеру SSA в вертикальном положении и запустите таймер. Сделайте четкую фотографию арены через 20 минут, когда мухи сядут на свои места на арене и продемонстрируют минимальное движение. Избегайте бликов и неравномерного освещения.
    6. Повторите эксперимент 3 раза для той же популяции мух, отбивая мух и повторяя шаги из шагов 2.3.5 по 2.3.7 (внутренние репликации). Повторите 3 раза с другой популяцией мух того же генотипа/состояния (независимые повторы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте пробирную камеру, чтобы выбросить мух из камеры. Протрите стеклянные и пластиковые поверхности этанолом, чтобы удалить все запахи после одного раунда эксперимента с одной группой мух.
  4. Анализ данных анализа социального пространства
    1. Проанализируйте изображения в программном обеспечении ImageJ62 и перечислите расстояния между ближайшими соседями, как описано ранее61.
    2. Выполняйте статистический анализ и стройте графики с помощью статистического программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мух, использованные для описанного здесь анализа SSA, были w1118 и трансгетерозиготными мутантными мухами Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Мухи Fmr1 показывают значительно увеличенное расстояние от ближайших соседей (рисунок 2D).

3. Проба на ухаживание

  1. Брачная палата
    1. Соберите все четыре части камеры ухаживания (рисунок 3А) вместе в порядке, показанном на рисунке 3В. Каждая перфорация центрального диска, зажатая между крышкой и основаниями, будет работать как «камера ухаживания» (Рисунок 3C).
  2. Получение спаренных сук
    1. Запустите и обслуживайте несколько бутылок с культурой CS (Canton S, дикий тип) с ~60-100 самцами и самками мух в каждой бутылке с едой.
    2. Когда взрослые особи появятся, выбросьте всех взрослых мух и перенесите мух, выходящих из этих бутылок, каждые 2-3 часа в новые флаконы с пищей, дополненные небольшим количеством дрожжевой пасты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переполнения флаконов. Будьте осторожны, чтобы не перенести старых мух, личинок или куколок в брачный флакон.
    3. Инкубируйте эти «брачные флаконы» в течение 4 дней, чтобы убедиться, что все самки спарились.
  3. Подготовка однокорпусных трубок для самцов
    1. Добавьте около 500 μL корма для мух в каждую микрофуговую пробирку объемом 2 мл. С помощью миницентрифуги вытяните продукты вниз к нижней части пробирки.
    2. Дайте за ночь застыть пище, разрежьте крышку микрофуг-пробирки, накройте ее парапленкой и продырявите парапленку иглой для циркуляции воздуха.
  4. Сбор и изоляция девственных самцов
    1. Установите скрещивание с 10-15 самцами и 20-30 девственными самками желаемых генотипов в отдельные пищевые флаконы.
    2. Соберите из потомства девственных самцов желаемых генотипов и храните их по отдельности в «однокорпусных пробирках» с помощью аспиратора. Каждые 5-6 ч продолжайте собирать только что закрытых самцов (до 40-50 самцов на каждый генотип) и выделять их в отдельные однокорпусные пробирки.
    3. Снова запечатайте крышку тубы с парапленкой.
  5. Проведение эксперимента по брачному анализу
    1. После 5 дней изоляции испытуемых самцов проведите анализ ухаживания в течение временного окна ZT0-ZT3.
    2. Заранее настройте устройства видеозаписи, ориентируясь на рабочее место для анализа.
    3. С помощью аспиратора соберите одну предварительно спаренную самку (возрастом 6-10 дней) из брачных флаконов и вставьте в брачную камеру.
    4. С помощью аспиратора осторожно перенесите самца (контрольную/тестовую) муху из однокорпусной трубки в камеру ухаживания, содержащую одну предварительно спаренную самку, через передаточное отверстие. Быстро поверните крышку, чтобы закрыть камеру.
    5. Видеозапись поведения мух в течение 15 минут.
  6. Анализ видеоданных и статистика
    1. Перенесите видеофайлы на компьютер; Обратите внимание на продолжительность времени, проведенного самцом в ухаживании в течение 15 минут, вручную просмотрев видео.
    2. Рассчитайте индекс ухаживания (ДИ) для каждого самца мухи, который представляет собой долю (или процент) времени, затраченного самцом на ухаживание за самкой в течение 15 минут.
    3. Подсчитайте общее количество попыток совокупления за 15 минут.
    4. Обратите внимание на продолжительность временной задержки, показанную самцом перед его первой попыткой ухаживания, как на латентность ухаживания (CL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется анализировать 40-60 мужчин по каждому состоянию/генотипу для достижения статистической мощности и определения согласованности результатов ДИ.

4. Анализ грумингового поведения

  1. Арена для анализа груминга
    1. Используйте небольшую круглую камеру объемом ~0,4 см3 в качестве арены для записи поведения груминга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Та же самая арена ухаживания, описанная в разделе 3, может быть использована для оценки грумингового поведения.
    2. Поскольку груминг включает в себя запись движений более тонких органов, таких как ноги, используйте видеозапись с высоким разрешением или контрастом. Чтобы следовать этому протоколу, используйте светодиодную панель, покрытую диффузионным стеклом, в качестве равномерно освещенной поверхности размером 20 см х 20 см. Поместите камеру ухаживания на верхнюю часть панели, чтобы свет проходил снизу через камеру.
  2. Подготовка мух перед экспериментом
    1. Поддерживайте экспериментальный генотип мух в пищевых бутылочках при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.
    2. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под холодной анестезией с помощью стереомикроскопа, как описано в анализе социального пространства.
    3. Изолируйте самцов мух в однокорпусных трубках (как это используется в анализе на агрессию) на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продемонстрированного здесь эксперимента использовались следующие штаммы мух: W1118 и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Проведение анализа грумингового поведения
    1. Поддерживать температуру 24-25 °C и влажность ~50%; Проводите эксперимент во временном окне ZT0-ZT316.
    2. Перенесите самца мухи из однокомнатной трубки в арену для груминга с помощью аспиратора. Сразу же сдвиньте отверстие в крышке, чтобы мухи не смогли убежать.
    3. Поместите арену для груминга на диффузную светодиодную панель и дайте мухе акклиматизироваться в пределах арены в течение 1 минуты. Записывайте на видео полет в течение 10 минут, расположив камеру точно вертикально над ареной, установленной на подставке. Убедитесь, что типы схваток по грумингу видны и поддаются количественной оценке на видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение груминга включает в себя трение головы, глаз, усиков, хоботка, живота, гениталий и крыльев ногами (первая пара: Т1, вторая пара: Т2 или третья пара ног: Т3). Поведенческие параметры груминга, которые были учтены в этом исследовании, описаны в Andrew et al. 41 и продемонстрированы на рисунке 4.
    4. Повторите эксперимент для каждого генотипа.
    5. Анализ поведенческих данных груминга
      1. Проанализируйте видео и рассчитайте следующие четыре параметра: индекс груминга (процент времени, затраченного на груминг); задержка груминга (время до первого приступа груминга); номер для груминга; и средняя продолжительность схватки (общая продолжительность боя/количество схваток).
      2. Отметьте один схватку как оконченную, когда муха либо перестает показывать какой-либо из параметров и остается неподвижной в течение 2 с, либо останавливает схватку и проходит не менее 4 шагов.

5. Анализ на привыкание к обонянию

ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 5, окончательная сборка должна быть выполнена в день анализа Y-образного лабиринта54,56.

  1. Подготовка мух к привыканию
    1. Выращивайте мух нужных генотипов для всех экспериментов в инкубаторе с температурой окружающей среды 25 °C и влажностью 70% при стандартном 12 ч световом цикле: 12 ч темнового цикла (LD).
    2. Соберите 0-12 ч старых, только что закрытых мушек и пересадите ~30-40 мух в свежую среднюю бутылку с затянутой хлопчатобумажной пробкой.
    3. Назначьте коды каждой бутылке, чтобы экспериментатор не знал о генотипах, являющихся объектом эксперимента.
  2. Индукция обонятельного привыкания
    1. Поместите 1 мл предпочтительного одоранта, разведенного парафиновой жидкостью (светлая), в микрофужную пробирку объемом 1,5 мл. Для контроля достаточно использовать 1 мл парафиновой жидкости в микрофужеру объемом 1,5 мл. Перемешайте содержимое в тубе в течение 10 минут, чтобы обеспечить равномерное перемешивание, а затем накройте ее равномерно перфорированной полиэтиленовой пленкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В видео будет использоваться 20% этилбутират.
    2. Используйте проволоку для подвешивания трубок, содержащих разбавленный одорант, или только разбавляющую жидкость в отдельных бутылках с мухами.
    3. Хорошо накройте бутылки ватой, а затем оберните крафт-бумагой, чтобы предотвратить диффузию паров одоранта. Пометьте контрольные флаконы и флаконы, содержащие запах, как наивные и подверженные воздействию запаха (привыкшие) соответственно. Выдерживайте эти индукционные флаконы в течение 3 дней в инкубаторе с вышеуказанными условиями.
  3. Подготовка мух и аппарат Y-лабиринта
    1. Переложите мух из индукционных бутылок во флаконы, содержащие только пропитанную водой фильтровальную бумагу.
    2. Морите их голодом в течение примерно 16-18 часов при комнатной температуре до начала эксперимента для повышения мотивации.
    3. Убедитесь, что компоненты аппарата Y-лабиринт чистые и не имеют запаха; Соберите четыре части в вертикальном положении. Прикрепите камеры для скалолазания к Y-образному лабиринту, который затем подключается к верхней части адаптера. Плотно прикрепите дно Y-образного лабиринта к входному флакону, который служит центральным стержнем внизу, как показано на рисунке 5.
    4. Соедините сужающийся конец каждой лазающей камеры с флаконами с реагентами, содержащими одорант (10-3 разбавления дистиллированной водой) с помощью силиконовых трубок без запаха.
    5. С помощью вакуумного насоса накачайте одорант с одинаковой скоростью потока (~120 мл/мин) из газовых баллонов на два плеча Y и дайте ему насытиться в течение 15 минут для консистенции.
  4. Выполнение классического анализа Y-образного лабиринта
    1. Аккуратно введите голодных мух из каждого флакона во входную пробирку Y-образного лабиринта.
    2. Дайте им акклиматизироваться в течение короткого периода времени; соедините входной флакон с адаптером Y-образного лабиринта, чтобы начать тест; и пусть мухи взбираются по рукавам Y-образного лабиринта и попадают в ловушку в двух камерах сбора. Установите продолжительность каждого теста равной 1 минуте.
    3. По завершении опустите мухи обратно на дно входного флакона и поменяйте положение рукавов Y-образного лабиринта, чтобы избежать бокового смещения. Сделайте четыре показания для одного и того же набора мух.
    4. Запишите количество мух, взбирающихся на каждый из двух рукавов Y-образного лабиринта в течение определенного периода времени.
    5. Повторите анализ не менее чем для 8 партий, чтобы получить репрезентативный набор данных.
  5. Анализ и интерпретация собранных данных
    1. Количественно оцените результаты, рассчитав индекс эффективности (PI), который можно представить в виде разницы между числом мух, выбирающих воздушный рукав (A), и числом мух, выбирающих рукав запаха (O), в виде доли от общего числа участвующих мух.
    2. Используйте статистические тесты (непарный t-критерий Стьюдента), чтобы проверить, является ли значимым PI наивных мух по сравнению с мухами, подверженными воздействию запаха.

Результаты

Анализ на агрессию
В качестве модели ASD мухи были использованы мутантные мухи Fmr1 63,64. w1118 самцов использовали в качестве контроля, а Fmr1 трансгетерозиготу Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M - 57 самцов в качестве экспериментальных м...

Обсуждение

Дрозофила используется в качестве прекрасного модельного организма для исследований неврологических расстройств человека из-за высокой степени сохранности последовательностей генов между генами мухи и болезни человека9. Многочисленные устойчивые поведенческие п?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы безмерно благодарны Мани Рамасвами (NCBS, Бангалор) и Баскару Бактавачалу (IIT Mandi) за организацию анализа привыкания и выбора запаха, Павану Агравалу (MAHE) за его ценные предложения по анализу на агрессию, Амитаве Маджумдару (NCCS, Пуна) за то, что поделился прототипом пробирной камеры для ухаживания и линиями мутантных мух Fmr1 , а также Гаураву Дасу (NCCS, Пуна) за то, что поделился линейкой MB247-GAL4. Мы благодарим Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Индиана, США), Национальный институт генетики (NIG, Киото, Япония), Банарасский индуистский университет (BHU, Варанаси, Индия) и Национальный центр биологических наук (NCBS, Бангалор, Индия) за линии дрозофилы . Работа лаборатории поддерживалась грантами от SERB-DST (ECR/2017/002963) AD, стипендией DBT Ramalingaswami, присужденной AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016), и институциональной поддержкой от IIT Kharagpur, Индия. SD и SM получают стипендии для получения степени доктора философии от CSIR-Senior Research Fellowship; Премьер-министр получает стипендию доктора философии от MHRD, Индия.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheetAlternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizesThickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapesi) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambersx2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vialPerspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottlesBorosil #1500017
Gas washing stopperBorosil #1761021
Glass vialOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) lightSRL #18211
Roller clampsPolymed #14098
Silicone tubesOD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pumpHana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-mazeBorosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottlesOD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vialsOD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ softwarehttps://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set upCamcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
CottonAbsorbent, autoclaved
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipette tips200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tubelength= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971

Ссылки

  1. American Psychiatric Association. . American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778 (2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1 (2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477 (2019).
  9. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophilamelanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  10. Coll-Tane, M., Krebbers, A., Castells-Nobau, A., Zweier, C., Schenck, A. Intellectual disability and autism spectrum disorders "on the fly": Insights from Drosophila. DMM Dis Model Mech. 12 (5), 1-16 (2019).
  11. Tian, Y., Zhang, Z. C., Han, J. Drosophila studies on autism spectrum disorders. Neurosci Bull. 33 (6), 737-746 (2017).
  12. Ueoka, I., Pham, H. T. N., Matsumoto, K., Yamaguchi, M. Autism spectrum disorder-related syndromes: Modeling with Drosophila and rodents. Int J Mol Sci. 20 (17), 1-24 (2019).
  13. Yost, R. T., et al. Abnormal social interactions in a Drosophila mutant of an autism candidate gene: Neuroligin 3. Int J Mol Sci. 21 (13), 1-20 (2020).
  14. Wise, A., et al. Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurogenet. 29 (2-3), 135-143 (2015).
  15. Koemans, T. S., et al. Functional convergence of histone methyltransferases EHMT1 and KMT2C involved in intellectual disability and autism spectrum disorder. PLoS Genet. 13 (10), e1006864 (2017).
  16. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated levels of the vesicular monoamine transporter and a novel repetitive behavior in the Drosophila model of fragile X syndrome. PLoS One. 6 (11), e27100 (2011).
  17. Iyer, J., et al. Pervasive genetic interactions modulate neurodevelopmental defects of the autism-associated 16p11.2 deletion in Drosophilamelanogaster. Nat Commun. 9 (1), 1-19 (2018).
  18. Palacios-Muñoz, A., et al. Mutations in trpγ, the homologue of TRPC6 autism candidate gene, causes autism-like behavioral deficits in Drosophila. Mol Psychiatry. 27 (8), 3328-3342 (2022).
  19. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  20. Stessman, H. A. F., et al. Disruption of POGZ is associated with intellectual disability and autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 98 (3), 541-552 (2016).
  21. Hope, K. A., et al. The Drosophila gene sulfateless modulates autism-like behaviors. Front Genet. 10, 574 (2019).
  22. Stessman, H. A. F., et al. Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental-disability biases. Nat Genet. 49 (4), 515-526 (2017).
  23. Fenckova, M., et al. Habituation learning is a widely affected mechanism in Drosophila models of intellectual disability and autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 86 (4), 294-305 (2019).
  24. Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and "loser" effect formation in Drosophilamelanogaster. Learn Mem. 22 (2), 64-68 (2015).
  25. Anderson, D. J. Circuit modules linking internal states and social behaviour in flies and mice. Nat Rev Neurosci. 17 (11), 692-704 (2016).
  26. Flanigan, M. E., Russo, S. J. Recent advances in the study of aggression. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 241-244 (2018).
  27. Sun, Y., et al. Social attraction in Drosophila is regulated by the mushroom body and serotonergic system. Nat Commun. 11 (1), 1-14 (2020).
  28. Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12342-12347 (2004).
  29. Kravitz, E. A., Fernandez, M. d. e. l. a. P. Aggression in Drosophila. Behav Neurosci. 129 (5), 549-563 (2015).
  30. Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (8), 5664-5668 (2002).
  31. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly (Austin). 6 (1), 35-48 (2012).
  32. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J Vis Exp. (2), e155 (2007).
  33. Agrawal, P., Kao, D., Chung, P., Looger, L. L. The neuropeptide Drosulfakinin regulates social isolation-induced aggression in Drosophila. J Exp Biol. 223 (2), 207407 (2020).
  34. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5657-5663 (2008).
  35. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: Measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11 (2), 243-252 (2012).
  36. Corthals, K., et al. Neuroligins Nlg2 and Nlg4 affect social behavior in Drosophilamelanogaster. Front Psychiatry. 8, 113 (2017).
  37. Cao, H., Tang, J., Liu, Q., Huang, J., Xu, R. Autism-like behaviors regulated by the serotonin receptor 5-HT2B in the dorsal fan-shaped body neurons of Drosophilamelanogaster. Eur J Med Res. 27 (1), 1-15 (2022).
  38. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophilamelanogaster behavior - A new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  39. Shilpa, O., Anupama, K. P., Antony, A., Gurushankara, H. P. Lead (Pb)-induced oxidative stress mediates sex-specific autistic-like behaviour in Drosophilamelanogaster. Mol Neurobiol. 58 (12), 6378-6393 (2021).
  40. Dockendorff, T. C., et al. Drosophila lacking dfmr1 activity show defects in crcadian output and fail to maintain courtship interest. Neuron. 34 (6), 973-984 (2002).
  41. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  42. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. (125), e55231 (2017).
  43. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497 (2018).
  44. Webb, S. J., et al. Toddlers with elevated autism symptoms show slowed habituation to faces. Child Neuropsychol. 16 (3), 255-278 (2010).
  45. Kleinhans, N. M., et al. Reduced neural habituation in the amygdala and social impairments in autism spectrum disorders. Am J Psychiatry. 166 (4), 467-475 (2009).
  46. Ethridge, L. E., et al. Reduced habituation of auditory evoked potentials indicate cortical hyper-excitability in Fragile X Syndrome. Transl Psychiatry. 6 (4), e787-e787 (2016).
  47. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neurosci Biobehav Rev. 80, 286-305 (2017).
  48. Kuiper, M. W. M., Verhoeven, E. W. M., Geurts, H. M. Stop making noise! Auditory sensitivity in adults with an autism spectrum disorder diagnosis: physiological habituation and subjective detection thresholds. J Autism Dev Disord. 49 (5), 2116-2128 (2019).
  49. McDiarmid, T. A., et al. Systematic phenomics analysis of autism-associated genes reveals parallel networks underlying reversible impairments in habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 656-667 (2020).
  50. Lyons-Warren, A. M., Herman, I., Hunt, P. J., Arenkiel, B. A systematic-review of olfactory deficits in neurodevelopmental disorders: From mouse to human. Neurosci Biobehav Rev. 125, 110-121 (2021).
  51. Kepler, L. D., McDiarmid, T. A., Rankin, C. H. Habituation in high-throughput genetic model organisms as a tool to investigate the mechanisms of neurodevelopmental disorders. Neurobiol Learn Mem. 171, 107208 (2020).
  52. Huang, T. N., Yen, T. L., Qiu, L. R., Chuang, H. C., Lerch, J. P., Hsueh, Y. P. Haploinsufficiency of autism causative gene Tbr1 impairs olfactory discrimination and neuronal activation of the olfactory system in mice. Mol Autism. 10 (1), 1-16 (2019).
  53. Twick, I., Lee, J. A., Ramaswami, M. Chapter 1 - Olfactory habituation in Drosophila-odor encoding and its plasticity in the antennal lobe. Prog Brain Res. 208, 3-38 (2014).
  54. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (36), E646-E654 (2011).
  55. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  56. Ayyub, C., Paranjape, J., Rodrigues, V., Siddiqi, O. Genetics of olfactory behavior in Drosophilamelanogaster. J Neurogenet. 6 (4), 243-262 (1990).
  57. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  58. Fernandez, M. P., Trannoy, S., Certel, S. J. Fighting flies: quantifying and analyzing Drosophila aggression. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 107985 (2023).
  59. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  60. Simon, A. F., et al. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181 (2), 525-541 (2008).
  61. McNeil, A. R., et al. Conditions affecting social space in Drosophilamelanogaster. J Vis Exp. (105), e53242 (2015).
  62. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  63. Drozd, M., Bardoni, B., Capovilla, M. Modeling Fragile X Syndrome in Drosophila. Front Mol Neurosci. 11, 124 (2018).
  64. Trajković, J., et al. Drosophilamelanogaster as a model to study Fragile X-associated disorders. Genes (Basel). 14 (1), 87 (2022).
  65. Gailey, D. A., Jackson, F. R., Siegel, R. W. Male courtship in Drosophila: the conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102 (4), 771-782 (1982).
  66. Cannon, R. J. C. Drosophila courtship behaviour. Courtship and Mate-finding Insects. , 1-13 (2023).
  67. von Philipsborn, A. C., Shohat-Ophir, G., Rezaval, C. Single-pair courtship and competition assays in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (7), 450-459 (2023).
  68. Keleman, K., Krüttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  69. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. J Vis Exp. (124), e55808 (2017).
  70. Fitzsimons, H. L., Scott, M. J. Genetic modulation of Rpd3 expression impairs long-term courtship memory in Drosophila. PLoS One. 6 (12), e29171 (2011).
  71. Kubli, E. My favorite molecule. The sex-peptide. BioEssays. 14 (11), 779-784 (1992).
  72. Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophilamelanogaster. Nat Protoc. 2 (11), 2712-2718 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены