Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Resumo

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Resumo

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de transtornos do neurodesenvolvimento com sintomas comportamentais comuns, incluindo déficits na interação social e capacidade de comunicação, comportamentos restritos ou repetitivos aprimorados e também, em alguns casos, dificuldade de aprendizagem e déficit motor. Drosophila serviu como um organismo modelo incomparável para modelar um grande número de doenças humanas. Como muitos genes foram implicados no TEA, as moscas-das-frutas surgiram como uma maneira poderosa e eficiente de testar os genes supostamente envolvidos com o distúrbio. Como centenas de genes, com papéis funcionais variados, estão implicados no TEA, um único modelo genético de TEA é inviável; em vez disso, mutantes genéticos individuais, knockdowns de genes ou estudos baseados em superexpressão dos homólogos de moscas de genes associados ao TEA são os meios comuns para obter informações sobre as vias moleculares subjacentes a esses produtos gênicos. Uma série de técnicas comportamentais estão disponíveis em Drosophila , que fornecem fácil leitura de déficits em componentes comportamentais específicos. O ensaio de espaço social e os ensaios de agressão e namoro em moscas têm se mostrado úteis na avaliação de defeitos na interação social ou comunicação. O comportamento de higiene em moscas é uma excelente leitura do comportamento repetitivo. O ensaio de habituação é usado em moscas para estimar a capacidade de aprendizado de habituação, que é afetada em alguns pacientes com TEA. Uma combinação desses paradigmas comportamentais pode ser utilizada para fazer uma avaliação completa do estado da doença semelhante ao TEA humano em moscas. Usando moscas mutantes Fmr1 , recapitulando a síndrome do X frágil em humanos e knockdown de linha homóloga a POGZ em neurônios de moscas, mostramos déficits quantificáveis no espaçamento social, agressão, comportamento de cortejo, comportamento de higiene e habituação. Esses paradigmas comportamentais são demonstrados aqui em suas formas mais simples e diretas, com a suposição de que isso facilitaria seu uso generalizado para pesquisas sobre TEA e outros distúrbios do neurodesenvolvimento em modelos de moscas.

Introdução

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos. Inclui uma série de distúrbios complexos do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits multicontextuais e persistentes na comunicação social e interação social e a presença de padrões e interesses comportamentais e de atividade restritos e repetitivos¹. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 1 em cada 100 crianças é diagnosticada com TEA em todo o mundo, com uma proporção de homens para mulheres de 4,2². A doença torna-se evidente no segundo ou terceiro ano de vida. Crianças com TEA mostram falta de interesse em reciprocidade socioemocional, comunicação não verbal e habilidades de relacionamento. Eles exibem comportamentos repetitivos, como movimento motor estereotipado, rotina inflexível e ritualizada e foco intenso em interesses restritos. Crianças com TEA apresentam um alto grau de resposta ao toque, olfato, som e paladar, enquanto a resposta à dor e à temperatura é comparativamente baixa¹. A penetrância desse distúrbio também é diferente entre diferentes pacientes que sofrem de TEA e, portanto, a variabilidade aumenta.

O diagnóstico clínico atual de TEA é baseado na avaliação comportamental dos indivíduos, pois não há teste genético comum ou baseado em biomarcadores confirmatório que cubra todas as formas de TEA³. Decifrar as bases genéticas e neurofisiológicas seria útil para direcionar estratégias de tratamento. Na última década, um grande corpo de pesquisa resultou na identificação de centenas de genes que são excluídos ou mutados ou cujos níveis de expressão são alterados em pacientes com TEA. Pesquisas em andamento enfatizam a validação da contribuição desses genes candidatos usando organismos modelo como o camundongo ou a mosca-da-fruta, nos quais esses genes são nocauteados ou derrubados, seguidos por testes para déficits comportamentais semelhantes ao TEA e elucidação das vias genéticas e moleculares subjacentes que causam as anomalias. Um modelo de camundongo recapitulando as variações do número de cópias (CNVs) nos loci cromossômicos humanos 16p11.2 mostra alguns dos defeitos comportamentais do TEA ^4,5,6. A exposição pré-natal a um medicamento teratogênico ácido valpróico (VPA) é outro modelo de camundongo que descreve características semelhantes ao TEA humano ^7,8. Além disso, existe uma variedade de modelos de camundongos que exibem autismo associado à síndrome genética, por exemplo, modelos sindrômicos de gene único causados por mutações em Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelos não sindrômicos de gene único causados por mutações em genes como Cntnap2, Shank, Neurexin ou genes Neuroligin ⁵.

A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é outro organismo modelo proeminente para estudar as bases celulares, moleculares e genéticas de uma infinidade de doenças humanas⁹, incluindo TEA. Drosophila e humanos compartilham processos biológicos altamente conservados nos níveis molecular, celular e sináptico. As moscas-das-frutas têm sido usadas com sucesso em estudos de TEA^{10 , 11 , 12} para caracterizar genes ligados a TEAs e decifrar seu papel exato na sinaptogênese, função sináptica e plasticidade, montagem do circuito neural e maturação; descobriu-se que os homólogos de moscas de genes associados ao TEA têm papéis na regulação do comportamento social e / ou repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. A mosca-da-fruta também tem funcionado como modelo para a triagem de genes de TEA e suas variantes 15,22,23. O maior desafio na pesquisa de TEA em moscas é que, ao contrário de outros modelos de doenças, não existe um único modelo de mosca com TEA. Para entender o impacto das mutações ou da derrubada de um gene específico do TEA, um pesquisador precisa validar se os fenótipos comportamentais imitam suficientemente os sintomas de pacientes com TEA e, em seguida, prosseguir para a compreensão dos fundamentos moleculares ou fisiológicos dos fenótipos.

Portanto, a detecção de fenótipos semelhantes ao TEA é vital para a pesquisa de TEA no modelo de mosca. Um punhado de técnicas comportamentais surgiu ao longo dos anos que nos permite detectar anormalidades como déficits no comportamento / interação social, comunicação, comportamentos repetitivos e capacidade de resposta a estímulos. Além disso, várias modificações e atualizações dessas técnicas comportamentais foram feitas em diferentes laboratórios para atender a requisitos específicos, como upscaling, automação de ensaios, leituras, quantificação e métodos de comparação. Neste artigo em vídeo, são demonstradas as versões mais básicas de cinco paradigmas comportamentais, que, em combinação, podem ser usados para detectar resultados comportamentais semelhantes ao TEA da maneira mais fácil.

A agressão é um comportamento inato evolutivamente conservado que afeta a sobrevivência e a reprodução²⁴. O comportamento agressivo em relação aos coespecíficos é influenciado pela 'motivação para a ^{socialização'25,26} e pela '^{comunicação'27}, ambos comprometidos em indivíduos afetados por TEA. O comportamento agressivo é bem descrito em Drosophila e sua quantificabilidade através do robusto ensaio de agressão 28,29,30 e uma base genética e neurobiológica bem compreendida ³¹ o torna um paradigma comportamental adequado³² para avaliar o fenótipo ASD em um modelo de mosca. A agressão é afetada pelo isolamento social longe de um ambiente social, o que leva a uma agressão aumentada; O mesmo foi observado quando as moscas machos são alojadas em isolamento por alguns dias^33,34. Outro ensaio comportamental que quantifica a sociabilidade em moscas é o Social Space Assay³⁵, que mede as distâncias entre os vizinhos mais próximos e as distâncias entre moscas em um pequeno grupo de moscas, tornando-o perfeitamente adequado para testar os papéis dos ortólogos do gene ASD na mosca 12,21,36,37, bem como modelos de moscas ASD induzidos pelo ambiente^{38, 39}.

O ensaio de namoro de Drosophila é outro paradigma comportamental frequentemente usado para testar a alteração nas habilidades sociais e de comunicação em circuito ou manipulação genética, incluindo genes relacionados ao autismo 18,19,21,40. Padrões repetitivos de comportamento são prevalentes em pacientes com TEA, que são recapitulados em moscas pelo comportamento de higiene - uma série de ações distintas e estereotipadas realizadas para limpeza e outros propósitos. Ele tem sido usado com sucesso para testar o impacto de mutações no gene ASD em moscas^21,41, bem como a exposição a produtos químicos ^38,39. Vários avanços e automação no ensaio foram descritos antes 16,41,42,43; Aqui, estamos demonstrando o padrão de ensaio mais básico, que é fácil de adotar e quantificar.

Sabe-se que o TEA afeta a capacidade de habituação, aprendizado e memória em alguns pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA ^51,52 e também causa déficits em diferentes comportamentos olfativos⁵⁰. A habituação de salto light-off de Drosophila foi usada anteriormente para rastrear genes ASD²³. A habituação pode ser testada por um método simples de ensaio de habituação olfativa 53,54,55. Descrevemos o método para induzir a habituação olfativa e analisamos o resultado usando um ensaio clássico de escolha de odor binário baseado em labirinto^{em Y 56} que pode ser usado para detectar defeitos na habituação no gene ASD mutante ou na condição de knockdown do gene. Para avaliar se o impacto de uma mutação (ou knock-down de genes) ou de um tratamento farmacológico no comportamento de uma mosca equivale a um fenótipo semelhante ao TEA, pode-se usar uma combinação desses 5 ensaios descritos aqui.

Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

1. Ensaio de agressão

1. Preparando a arena de ensaio de agressão
   1. Pegue uma placa padrão de 24 poços (Figura 1A) e use cada poço da placa como uma única 'arena' (Figura 1B) para a agressão da mosca. Encha metade de cada poço com comida normal para moscas e deixe secar durante a noite.
      NOTA: Opcionalmente, um ponto focal para agressão pode ser incluído na arena, como um ponto de pasta de fermento ou uma mulher decapitada para garantir a agressão masculina.
   2. Pegue qualquer folha de plástico / acrílico transparente, o suficiente para cobrir a superfície de cerca de três a quatro poços. Perfure a folha para fazer uma pequena abertura de ~ 2,5 mm de diâmetro para inserir moscas individuais nos poços através dela.
2. Preparando o aspirador de moscas
   1. Pegue um tubo de borracha/silicone de 30-50 cm de comprimento (Figura 1C1).
   2. Pegue uma ponta de pipeta de 200 μL (ou 1.000 μL) e corte ~ 1 cm da ponta estreita. Insira a extremidade cortada em uma extremidade do tubo de borracha; Esta ponta será a 'extremidade da boca', usada para aspiração baseada na boca.
   3. Pegue outra ponta de pipeta e corte a extremidade estreita desta ponta para fazer uma abertura suficiente para uma mosca entrar por ela. Insira a base desta ponta de pipeta na extremidade traseira do tubo; esta será a 'extremidade da mosca' do aspirador, de onde a mosca será aspirada (Figura 1C2).
   4. Insira um pedaço de pano de malha ou uma fina camada de algodão na 'extremidade da mosca' do tubo - na junção entre o tubo e a ponta. Certifique-se de que uma mosca aspirada na ponta da pipeta permaneça presa na ponta, na frente da malha.
   5. Sele as junções entre o tubo e as pontas da pipeta usando parafilme.
3. Preparação de tubos de invólucro único e frascos de invólucro de grupo
   1. Preparação de tubos de carcaça única
      1. Adicione quase 500 μL de alimento para moscas preparado na hora a um tubo de microcentrífuga de 2 mL (Figura 1D). Use uma mini centrífuga para puxar os alimentos para a parte inferior do tubo.
      2. Defina os alimentos para solidificar em temperatura ambiente, mantendo a tampa aberta durante a noite. Cubra os tubos com um pano fino para evitar que moscas perdidas entrem nos tubos.
      3. Perfure as tampas dos tubos de microcentrífugas com agulhas para circulação de ar e feche as tampas depois que os alimentos estiverem solidificados.
   2. Preparação de frascos para injetáveis de alojamento de grupo
      1. Pegue frascos regulares para moscas e encha um mínimo dos frascos com alimentos preparados na hora (Figura 1D).
4. Preparando as moscas antes do experimento
   1. Manter linhagens de moscas dos genótipos desejados em garrafas normais de vidro/plástico contendo alimentos padrão para moscas numa incubadora a 25 °C num ciclo claro/escuro de 12 h.
   2. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as sob anestesia com dióxido de carbono usando um estereomicroscópio.
   3. Insira metade das moscas machos individualmente em 'tubos de caixa única'. Mantenha a outra metade das moscas machos em um grupo de 10 com as moscas fêmeas em 'frascos de alojamento em grupo' regulares, criando uma condição social. Conservar todos os tubos e frascos para injetáveis a 25 °C durante 5 dias.
      NOTA: Mantenha uma temperatura de 24-25 °C e ~50% de umidade na sala de comportamento. As linhagens de moscas utilizadas foram: w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. As moscas Fmr1 , que foram mantidas em isolamento por 5 dias, apresentam ataques de agressão significativamente diminuídos em relação a outro macho (Figura 1E).
5. Realizando o experimento de comportamento de agressão
   1. Realize o experimento de agressão durante a janela de tempo ZT0-ZT3, pois as moscas mostram pico de atividade durante esta hora do dia.
      NOTA: ZT=Tempo Zeitgeber em um ciclo padrão de 12 h claro/escuro; ZT0= acende, ou seja, o início da fase de luz, ZT3= 3 h após o início da fase de luz, e assim por diante. ZT12= apaga-se.
   2. Transfira duas moscas machos das câmaras de alojamento único ou em grupo pelo método de aspiração bucal para a arena de agressão através do orifício na tampa; Afaste o buraco imediatamente para garantir que as moscas não escapem.
   3. Deixe as moscas se aclimatarem dentro da arena por 1-2 min. Inicie um cronômetro por 20 min. Grave as moscas durante os 20 minutos inteiros, colocando uma câmera ou um telefone celular exatamente verticalmente acima da arena usando um suporte. Certifique-se de que os tipos de ataques agressivos estejam visíveis no vídeo.
      NOTA: Garanta uma iluminação clara da arena e evite que qualquer brilho/reflexo da tampa caia diretamente na lente da câmera.
   4. Repita o experimento para 15-20 pares de moscas para cada genótipo e cada tipo de condição de alojamento.
      NOTA: O viés inconsciente pode ser negado pelo duplo cegamento das moscas de controle e teste, bem como dos arquivos de vídeo pertencentes a vários genótipos.
6. Analisando os dados do ensaio de agressão
   1. Transfira os arquivos de vídeo para um computador com uma tela suficientemente grande para que as lutas agressivas sejam visíveis.
   2. Reproduza o vídeo e conte o número total de lutas agressivas em um intervalo de tempo de 20 min^58,59.
   3. Compile e organize os dados de cada genótipo e de cada padrão de alojamento em uma planilha e realize a análise de dados usando qualquer software estatístico. Execute um teste t bicaudal e plote os dados como caixa e bigodes.

2. Ensaio de espaço social

NOTA: O protocolo de ensaio, a arena e a análise descritos aqui foram descritos anteriormente^60,61.

1. Preparando a arena de ensaio do espaço social (SSA)
   1. Coloque os espaçadores triangulares de acrílico (altura = 8,9 cm, base = 6,7 cm e espessura = 0,3 cm) planos no topo de um painel de vidro retangular (13,5 cm x 10,4 cm, espessura de 0,3 cm) de forma que os ângulos retos dos espaçadores de acrílico fiquem alinhados com os cantos do painel de vidro (Figura 2A).
   2. Coloque dois espaçadores retangulares de acrílico (6,7 cm x 1,5 cm, espessura = 0,3 cm) planos no painel de vidro, alinhados com as bases dos dois espaçadores triangulares. Após este arranjo, confirme se os quatro espaçadores de acrílico circundam uma arena triangular (~ 2,16 cm²⁶¹) no painel de vidro retangular que não é coberto por espaçadores (Figura 2A, B). Coloque um adesivo de uma régua (Figura 2C) em um dos espaçadores triangulares e certifique-se de que esteja visível de cima.
   3. Agora coloque um segundo painel de vidro retangular (13,5 cm x 10,4 cm, espessura de 0,3 cm) em cima dos espaçadores de acrílico de forma que se alinhe com o painel de vidro na parte inferior; Os espaçadores de acrílico acabariam imprensados entre o espaço de vidro, deixando um espaço triangular no meio entre dois painéis de vidro. Use quatro pequenos clipes de fichário para segurar os painéis e espaçadores.
2. Preparação das moscas para SSA
   1. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as por sexo sob anestesia fria usando um estereomicroscópio.
      NOTA: Resfrie o aparelho de anestesia fria (uma placa de Petri pode ser usada) em uma incubadora a -20 ° C. Coloque as moscas em frascos vazios, mergulhe esses frascos no gelo (em um balde de gelo) até que fiquem imóveis, coloque-os na placa de Petri fria e comece a separar.
   2. Conservar as moscas machos e fêmeas separadamente durante 24 h em frascos para injetáveis de alimentos numa incubadora a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h.
      NOTA: Para os experimentos demonstrados aqui, as linhagens de moscas utilizadas foram w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Executando o experimento SSA
   1. Manter as mesmas condições experimentais do ensaio de agressão (temperatura: 24-25°C, umidade ~ 50%) e realizar o experimento durante a janela de tempo ZT0-ZT3.
   2. Remova o clipe de fichário inferior direito e desloque levemente o espaçador retangular para fora para que uma lacuna (~ 0,5 cm) seja criada entre os dois espaçadores retangulares.
   3. Transfira as moscas (coletadas no dia anterior) do frasco para alimentos para um frasco vazio. Transfira-os para a arena do espaço social (a área triangular) por aspiração suave através do espaço criado entre os espaçadores retangulares. Feche imediatamente o espaço deslizando o espaçador retangular e o clipe de fichário de volta em suas posições e certifique-se de que não haja espaço para as moscas escaparem.
   4. Segurando a câmara na posição vertical, bata suavemente a câmara 3x em uma almofada macia para garantir que todas as moscas estejam na base da câmara no início do experimento.
   5. Clamp a câmara SSA na posição vertical e inicie o temporizador. Tire uma foto nítida da arena após 20 minutos, quando as moscas se acomodarem em suas posições na arena e mostrarem o mínimo de movimento. Evite brilho e iluminação irregular.
   6. Repita o experimento 3x para a mesma população de moscas, batendo nas moscas e repetindo as etapas das etapas 2.3.5 a 2.3.7 (réplicas internas). Repita 3x com uma população diferente de moscas do mesmo genótipo/condição (repetições independentes).
      NOTA: Congele a câmara de ensaio para descartar as moscas da câmara. Limpe as superfícies de vidro e plástico com etanol para remover todos os odores após uma rodada de experimentos com um grupo de moscas.
4. Analisando os dados do ensaio do espaço social
   1. Analise as imagens no software ImageJ⁶² e liste as distâncias entre os voos mais próximos conforme descrito anteriormente⁶¹.
   2. Realize análises estatísticas e gráficos gráficos usando software estatístico.
      NOTA: As cepas de moscas usadas para o ensaio SSA descrito aqui foram w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas Fmr1 (Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M) ⁵⁷ . As moscas Fmr1 mostram uma distância significativamente maior dos vizinhos mais próximos (Figura 2D).

3. Ensaio de namoro

1. A câmara de namoro
   1. Monte todas as quatro peças da câmara de corte (Figura 3A) juntas na ordem mostrada na Figura 3B. Cada perfuração do disco central, imprensada entre a tampa e as peças de base, funcionará como a 'câmara de cortejo' (Figura 3C).
2. Obtenção de fêmeas pré-acasaladas
   1. Inicie e mantenha várias garrafas de cultura de moscas CS (Canton S, tipo selvagem) com ~ 60-100 moscas machos e fêmeas em cada garrafa de alimento.
   2. Quando os adultos emergirem, descarte todas as moscas adultas e transfira as moscas que saem dessas garrafas a cada 2-3 h para novos frascos de alimentos suplementados com uma pequena quantidade de pasta de fermento.
      NOTA: Evite a superlotação dos frascos. Tenha cuidado para não transferir moscas velhas, larvas ou pupas para o frasco de acasalamento.
   3. Incube esses "frascos de acasalamento" por 4 dias para garantir que todas as fêmeas tenham acasalado.
3. Preparação de tubos de caixa única para machos
   1. Adicione quase 500 μL de alimento para moscas a cada tubo de microcentrífuga de 2 mL. Use uma minicentrífuga para puxar os alimentos para a parte inferior do tubo.
   2. Deixe a solidificação dos alimentos durante a noite, corte a tampa do tubo de microcentrífugas, cubra-o com parafilme e perfure o parafilme com uma agulha para circulação de ar.
4. Coleta e isolamento de machos virgens
   1. Configure cruzamentos com 10-15 machos e 20-30 fêmeas virgens dos genótipos desejados em frascos de comida separados.
   2. Colete machos virgens dos genótipos desejados da progênie e mantenha-os individualmente em 'tubos de caixa única' usando o aspirador. Continue coletando machos recém-fechados a cada 5-6 h (até 40-50 machos para cada genótipo) e isole-os em tubos individuais de caixa única.
   3. Feche novamente a tampa do tubo com o parafilme.
5. Realizando o experimento de ensaio de namoro
   1. Após 5 dias de isolamento dos machos de teste, realize o ensaio de namoro durante a janela de tempo ZT0-ZT3.
   2. Configure os dispositivos de gravação de vídeo com bastante antecedência, concentrando-se no espaço de trabalho do ensaio.
   3. Com a ajuda de um aspirador, colete uma fêmea pré-acasalada (6-10 dias de idade) dos frascos de acasalamento e insira em uma câmara de cortejo.
   4. Usando o aspirador, transfira suavemente uma mosca macho (controle/teste) do tubo de carcaça única para a câmara de corte contendo a única fêmea pré-acasalada, através do orifício de transferência. Gire a tampa rapidamente para fechar a câmara.
   5. Gravação de vídeo do comportamento das moscas por 15 min.
6. Análise de dados e estatísticas de vídeo
   1. Transfira os arquivos de vídeo para um computador; Observe a duração do tempo gasto pelo macho no namoro durante 15 minutos, passando manualmente pelo vídeo.
   2. Calcule o índice de namoro (IC) para cada mosca macho, que é a fração (ou porcentagem) do tempo gasto pelo macho cortejando a fêmea durante 15 min.
   3. Conte o número total de tentativas de cópula em 15 min.
   4. Observe a duração do intervalo de tempo mostrado pelo macho antes de sua primeira tentativa de cortejar como a latência do namoro (CL).
      NOTA: Recomenda-se analisar 40-60 machos por condição/genótipo para obter poder estatístico e determinar a consistência dos resultados do IC.

4. Ensaio de comportamento de aliciamento

1. Arena de ensaio de comportamento de aliciamento
   1. Use uma pequena câmara circular com um volume de ~0,4 cm³ como uma arena para registrar o comportamento de limpeza.
      NOTA: A mesma arena de namoro descrita na seção 3 pode ser usada para ensaio de comportamento de higiene.
   2. Como o comportamento de limpeza envolve a gravação do movimento de órgãos mais finos, como pernas, use gravação de vídeo de alta resolução ou alto contraste. Para seguir este protocolo, use um painel de LED coberto de vidro difuso como uma superfície uniformemente iluminada de dimensões 20 cm x 20 cm. Coloque a câmara de namoro em cima do painel para garantir que a luz passe de baixo para cima através da câmara.
2. Preparando as moscas antes do experimento
   1. Manter moscas de genótipo experimentais em garrafas de alimentos a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h.
   2. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as sob anestesia fria usando um estereomicroscópio, conforme descrito no ensaio do espaço social.
   3. Isole as moscas machos em tubos de caixa única (como usados no ensaio de agressão) por 24 h.
      NOTA: Para o experimento aqui demonstrado, as linhagens de moscas utilizadas foram: W¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Realizando o ensaio de comportamento de limpeza
   1. Manter uma temperatura de 24-25 °C e umidade ~ 50%; realizar o experimento durante a janela de tempo ZT0-ZT3¹⁶.
   2. Transfira uma mosca macho de alojamento único de um tubo de alojamento único para a arena de limpeza usando um aspirador. Deslize imediatamente o orifício na tampa para garantir que as moscas não escapem.
   3. Coloque a arena de preparação em um painel de LED difuso e deixe a mosca se aclimatar dentro da arena por 1 min. Gravação de vídeo da mosca por 10 minutos, colocando a câmera exatamente verticalmente acima da arena montada em um suporte. Certifique-se de que os tipos de sessões de preparação sejam visíveis e quantificáveis no vídeo.
      NOTA: O comportamento de limpeza inclui esfregar a cabeça, olhos, antenas, probóscide do tórax, abdômen, genitália e asas com pernas (primeiro par: T1, segundo par: T2 ou terceiro par de pernas: T3). Os parâmetros comportamentais de aliciamento que foram levados em consideração neste estudo são descritos em Andrew et al. ⁴¹ e demonstrados na Figura 4.
   4. Repetir a experiência para cada genótipo.
   5. Analisando os dados comportamentais de higiene
      1. Analise os vídeos e calcule os quatro parâmetros a seguir: Índice de aliciamento (porcentagem do tempo gasto no aliciamento); latência de aliciamento (tempo até a primeira sessão de aliciamento); número de aliciamento; e duração média da sessão de preparação (duração total da luta/número de luta).
      2. Marque uma única sessão de preparação como concluída quando uma mosca parar de mostrar qualquer um dos parâmetros e permanecer imóvel por 2 s ou parar a luta e caminhar pelo menos 4 passos.

5. Ensaio para habituação olfativa

NOTA: Conforme mostrado na Figura 5, a montagem final precisa ser feita no dia do ensaio do labirinto em Y^54,56.

1. Preparando moscas para habituação
   1. Criar moscas dos genótipos desejados para todos os experimentos em uma incubadora com temperatura ambiente de 25 ^oC e 70% de umidade sob luz padrão de 12 h: ciclo escuro de 12h h (LD).
   2. Colete moscas de 0 a 12 h de idade e recém-fechadas e transfira ~ 30-40 moscas em uma garrafa média fresca com uma rolha de algodão apertada.
   3. Atribua códigos a cada frasco para manter o experimentador cego sobre os genótipos em experimentação.
2. Indução de habituação olfativa
   1. Coloque 1 mL do odorante preferido diluído com parafina líquida (light) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para o controle, basta usar 1 mL de parafina líquida light em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vortex o conteúdo do tubo por 10 min para garantir uma mistura uniforme e, em seguida, cubra-o com filme plástico uniformemente perfurado.
      NOTA: No vídeo, será utilizado butirato de etila a 20%.
   2. Use arame para suspender os tubos contendo o odorante diluído ou apenas o líquido diluente em frascos de mídia separados contendo moscas.
   3. Cubra bem as garrafas com algodão e embrulhe com papel kraft para evitar a difusão do vapor odorífero. Rotule os frascos de controle e contendo odor como ingênuos e expostos a odores (habituados), respectivamente. Mantenha esses frascos de indução por 3 dias em uma incubadora com as condições acima mencionadas.
3. Preparação de moscas e o aparelho do labirinto em Y
   1. Transfira as moscas dos frascos de indução para frascos contendo apenas papel de filtro embebido em água.
   2. Deixe-os morrer de fome por aproximadamente 16-18 h em temperatura ambiente antes do experimento para aumentar a motivação.
   3. Certifique-se de que os componentes do aparelho Y-maze estejam limpos e sem odores; Monte as quatro partes na vertical. Conecte as câmaras de escalada ao labirinto em Y, que é então conectado à parte superior do adaptador. Prenda firmemente a parte inferior do labirinto em Y ao frasco de entrada que serve como haste central na parte inferior, conforme mostrado na Figura 5.
   4. Conecte a extremidade cônica de cada câmara trepadeira com os frascos de reagente contendo odor (diluição ^10-3 com água destilada) usando tubos de silicone sem odor.
   5. Bombeie o odor a uma taxa de fluxo igual (~ 120 mL / min) das garrafas de gás para os dois braços do Y com a ajuda de uma bomba de vácuo e deixe-o saturar por 15 min para consistência.
4. Realizando o ensaio clássico do labirinto em Y
   1. Introduza suavemente as moscas famintas de cada frasco no frasco de entrada da configuração do labirinto em Y.
   2. Permita que eles se aclimatem por um breve período; conecte o frasco de entrada com o adaptador Y-maze para iniciar o teste; e deixe as moscas subirem pelos braços do labirinto em Y e ficarem presas nas duas câmaras de coleta. Defina a duração de cada teste para 1 min.
   3. Após a conclusão, bata as moscas de volta no fundo do frasco de entrada e mude a posição dos braços do labirinto em Y para evitar viés lateral. Faça quatro leituras para o mesmo conjunto de moscas.
   4. Registre o número de moscas escalando cada um dos dois braços do labirinto em Y dentro do período de tempo.
   5. Repita o ensaio por pelo menos 8 lotes para obter um conjunto de dados representativo.
5. Análise e interpretação dos dados coletados
   1. Quantifique os resultados calculando o Índice de Desempenho (PI), que pode ser representado como a diferença entre o número de moscas que escolhem o braço de ar (A) e o número de moscas que escolhem o braço de odor (O) como uma fração do número total de moscas participantes.
   2. Use testes estatísticos (teste t de Student não pareado) para verificar se o IP de moscas ingênuas versus expostas ao odor é significativo.

Resultados

Ensaio de agressão
Como modelo de ASD de mosca, moscas mutantes Fmr1 foram usadas^63,64. w¹¹¹⁸ machos foram usados como controle e Fmr1 trans-heterozigoto Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M⁵⁷ moscas machos como moscas experimentais; Os machos adultos foram alojados em tubos de isolamento por 5 dias. Machos homotípicos (mesmo genótipo, mesmas condições de alojamento) foram introduzido...

Discussão

A Drosophila é usada como um organismo modelo fino para pesquisa em distúrbios neurológicos humanos devido a um alto grau de conservação de sequências gênicas entre genes de moscas e doenças humanas⁹. Numerosos paradigmas comportamentais robustos o tornam um modelo atraente para estudar fenótipos manifestados em mutantes que recapitulam doenças humanas. Como centenas de genes estão implicados no transtorno do espectro do autismo (TEA), não existe um modelo comum de TEA em nenh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971