出生後、若年性、および滑走性成体マウスの眼球後洞注射による全身治療

要約

この記事では、出生後、若年性、およびラント成体マウスに対する総容量150μLまでの眼球後洞注射のプロトコルと付随するビデオを提供します。この手順は、尾静脈注射が不可能な場合の小型マウス(15g)の注射に特に適しています。

要約

尾静脈注射は、成体マウスの全身送達経路として頻繁に使用されますが、球後注射は、制限が少ない全身送達の代替方法です。まず、尾静脈注射(TVI)は、尾静脈のサイズがアクセスに適した成体マウスに限定されています。成体マウスの治療に限定されることは、成体まで生存しないマウスモデルを扱うときに問題となる可能性があります。第二に、TVIは、成長遅延表現型を持つマウスモデルでは実現不可能であり、マウスは成体の野生型マウスのサイズを達成することはありません。したがって、球後注射は、若年マウスと小型成体マウスの両方の治療にうまく使用できます。最後に、眼球後注射は麻酔下で行われるため、一般的に麻酔なしで行われるTVIよりもマウスのストレスが少なくなります。この記事では、小型マウスと若いマウスへの全身送達に使用できる球後注射のプロトコルと詳細な手順を紹介します。

概要

遺伝性疾患のマウスモデルは、低分子治療、遺伝治療、および細胞治療の有効性を実証するために一般的に使用されています¹。マウスでは、ヒトへの全身送達を再現するために最も広く使用されている方法は尾静脈注射(TVI)であり、これは通常、静脈がアクセスするのに十分な大きさであることを確認するために、約6〜8週齢の成体マウスで行われます。TVIは、血友病などの遺伝性疾患に関する数多くの前臨床原理証明研究で成功裏に使用されており、遺伝子治療のヒト臨床試験を支援しています²。しかし、遺伝病の多くのマウスモデルには、成長および/または早期致死性の表現型があり、成体マウスの年齢やサイズに達するのを防ぎます(図1)。このようなマウスをTVIで治療することは、致死年齢や動物が達成できる最大サイズによっては、不可能ではないにしても非常に困難です。

対照的に、球後静脈(しばしば誤って眼窩後静脈と呼ばれる)洞注射による治療薬の全身送達は、年齢^{やサイズに関係なく}、マウスで非常に容易に行うことができます3。アデノ随伴ウイルス(AAV)の球後注射は、メチルマロン酸血症(MMA)やニーマンピックC型疾患4,5,6,7,8などの遺伝病の若い成長遅延マウスモデルで成功裏に使用されています。(この手順は、新生児^{3、4、9、10}を注入するためにも使用できるが、この手法は、このプロトコルまたは付随するビデオでは詳述されていない。ドキソルビシンのような毒性の高い物質でさえ、球後注射によって安全に送達することができます^11,12。TVIとは異なり、マウスは球後洞注射中に麻酔をかけられるため、マウスに対する処置のストレスが軽減され、マウスを物理的に拘束する必要がない操作者にとっても容易になる^13,14。さらに、TVIは尾静脈を拡張するためにヒートランプを頻繁に使用するため、若いマウスでは脱水症状を引き起こす可能性があり、熱関連のストレスが疑われる遺伝病のマウスモデルでは問題となる可能性があります。TVIを使用する際に発生する可能性のある別の問題は、高度に色素沈着したマウスでは尾静脈の視覚化が特に困難になることです。ただし、TVIと同様に、球後洞注射は広範な全身生体内分布をもたらします^15,16。

プロトコル

このプロトコルと付随するビデオは、出生後、若年性、および走った成体マウスの球後静脈注射スペース用です。このプロトコルは、National Human Genome Research InstituteのInstitutional Animal Care and Use Committee(ACUC)によってプロトコル番号G-03-4で承認されています。他の機関では、要件や制限が異なる場合があり、このプロトコルは、貴機関での承認のために変更が必要な場合があります。この処置またはその他の動物用処置を行う前に、所属機関のACUCから承認を得てください。

1.プレインジェクションの準備

1. AAVを、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、各注入時に希望の注入量と濃度に希釈します。各注入に50%の容量を追加して、使い捨て滅菌シリンジを正確に充填できるようにします。
   注:ここでは、AAV8-CAG-eGFPレポーターを希釈して、体重1kgあたり1×10¹³ウイルスゲノム(vg / kg)を50μLの容量で送達しています。注入する50μL中のAAVの量は、注入時の動物の体重を用いて算出します。このビデオでは、AAVが球後経路を介して注入され、ヒトでの全身送達を再現しています。この手順を使用して、他の遺伝子治療ベクター(レンチウイルス、アデノウイルスなど)、RNA療法、および低分子を全身に送達できます。
2. 卓上実験動物麻酔システム(LAAS)が適切にセットアップされ、製造元の指示に従って正しく機能していることを確認します。
   注:別の麻酔方法を使用する場合は、注射を開始する前に麻酔が準備されていることを確認してください。球後注射の手順は、ほとんどの麻酔薬と互換性がある必要があります(例:.、ケタミンやキシラジンなどの注射可能な化学的拘束具)。
3. 使い捨て滅菌シリンジ(ここでは、インスリンシリンジ、31 G、長さ8 mm、容量3/10 mL)を充填する前に、プランジャーを数回上下に動かして、プランジャーをスムーズに押し下げることができるようにします。次に、シリンジを希望の量まで充填し、気泡がないことを確認します。
   注:最大150μLの容量を注入できます。当研究室では通常、50 μLの容量を注入します。

2. 実験動物麻酔システム(LAAS)を用いたイソフルランガス投与によるマウス鎮静

1. ガスが誘導チャンバーにのみ流れていることを確認してください。双方向ストップコックを非再呼吸(NRB)回路に閉じます。
2. 流量計の前面にある緑色の酸素フローノブをオンにして、流量が1 L / minになるようにします。
3. 気化器の上部にあるレバーを押し下げ、ダイヤルを希望の濃度に回して、イソフルランを≤4%に回します。
4. マウスを透明な誘導チャンバーに入れます。動物の呼吸と動きを注意深く観察してください。動物が横臥になったら、気化器のノブをイソフルランの2〜2.5%まで下げます。
5. フェイスマスクに取り付けられたNRB回路への双方向活栓を開き、誘導ボックスへのガスの流れを閉じます。
6. 動物を取り外し、NRB回路のフェイスマスクに入れます。
7. イソフルラン濃度設定を1.5%〜1.75%に下げます。これは、刺激に対する反応によって決定されます(例:.、つま先をつまむか、足を絞る)。.
8. マウスの呼吸と粘膜の色を常に監視してください(可能な場合)。動物の呼吸が苦しくなったり、粘膜の色がピンク色でない場合は、麻酔薬の濃度を下げてください。
9. 手順全体を通して動物を暖かく保ちます。ペーパータオルで包んだハンドウォーマーをアンダーパッドの下に置き、マウスの真下に配置します。
10. 手順が完了したら、酸素と気化器の電源を切ります。

3.動物の注射

1. 右利きの場合は、マウスの右目を注入し、鼻を右に向けてマウスを左側に置きます。左利きの場合は、マウスの左目を注入し、鼻を左手に向けてマウスを右側に置きます。
2. 注射する眼球に1〜2滴の眼科麻酔薬を塗布します。次に、滅菌吸収性ガーゼパッドを使用して余分な眼科麻酔液を取り除きます。指先で皮膚の背側と腹側に優しく圧力をかけ、マウスの眼球をソケットから部分的に突き出させます(図2A、B)。
   注:目を突き出すときは、血流や注射を妨げるため、周囲の頸血管に過度の圧力がかからないように注意してください。さらに、気管に圧力をかけると、マウスが呼吸できなくなる可能性があります。手順全体を通してマウスが呼吸できることを確認してください。
3. 針を約30°の角度で斜めの位置に保ち、内側眼角に配置します(図2C)。
   注:球後洞に到達するための針の配置の深さは、動物のサイズによって異なります。注射中に針を斜めの位置にすると、眼の損傷のリスクが減少します。針を深く置きすぎて眼窩に穴を開けないように注意してください。注射は1分もかかりません。
4. シリンジプランジャーにゆっくりとスムーズに圧力をかけ、注射液を送達します。これにより、血管外漏出の可能性が減少します。
5. 針をゆっくりとスムーズに取り外します。
6. マウスからフェイスマスクを取り外して、麻酔からの回復を可能にします。

4. ポストインジェクション

1. 手順が完了したら、酸素と気化器の電源を切ります。
2. 残存出血が発生した場合は、滅菌ガーゼを使用して血液を抜いてください。
3. マウスが暖かい場所(約37°C)にあることを確認してくださいが、過度に暑くならないようにして、麻酔からの回復中の低体温症を防ぎます。
4. マウスを完全に回復するまでマウスを単独で観察してから、マウスをケージとラックに戻します。
   注意: 回復中にマウスを分離すると、回復中にケージメイトが鎮静剤を打ったマウスを傷つけるのを防ぎます。

結果

球後洞注射は、低分子、抗体、およびアデノ随伴ウイルス (AAV) 4,5,9,15,16 を全身的に送達するために成功裏に使用されています。図3では、PBS(ビヒクル)処理マウスの肝臓とAAV8処理マウスの肝臓を、AAV注射と球後注射後の発現の例として示しています。AAV8は、多くの天然に存在するAAVベクターと同様に、肝栄養性です。したがって、5 × 10¹²vg/kg¹⁷の全身投与を受けたマウスでは、かなりの肝臓形質導入が期待されます。図3に見られるメチルマロニルCoAムターゼ(MMUT)RNAを発現する多数の肝細胞は、AAV導入遺伝子によって発現されており、眼窩後注射が成功したことを示しています。

図1:プロピオン酸血症の発育遅延マウス。 これは、遺伝病のマウスモデルで起こりうる極端な成長遅延の一例です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:眼球後洞注射の画像と図(A)眼球が突き出た毛皮に指を配置した画像(白矢印で表示)。(B)針を留置して注射する前に毛皮に下向きの圧力をかけた後の眼球(白矢印で示す)の突出の画像。(C)針の斜角の向き(眼球に対して斜角を下向き)、針の角度(30°)、および球後洞の針の配置の図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:AAV8による球後洞注射後のRNA in situハイブリダイゼーション。 MMUT RNAについて染色した(A)ビヒクル処理肝臓10倍、(B)AAV8処理肝臓10倍、(C)ビヒクル処理肝臓20倍、および(D)AAV8処理肝臓20倍、MMUT RNAで染色した画像。メチルマロン酸血症のマウスは、生後1か月で5×10¹² vg / kgのAAV8-LPS-MMUTまたはビヒクルコントロール(PBS)の用量で治療されました。.肝臓組織は治療後1か月で採取されました。 MMUT のRNAは茶色に染色されています(黒色の矢印は陽性染色の領域を示しています)。肝臓をヘマトキシリンで対比染色。スケールバー = 100 μm 画像の場合は 10x、20x 画像の場合は 50 μm (B)。略語:AAV =アデノ随伴ウイルス;LPS = 肝臓特異的プロモーター;MMUT = メチルマロニル-CoAムターゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

球後注射は、低分子、タンパク質、およびゲノム療法を送達するための信頼性の高い方法ですが、信頼性と再現性のある全身送達を確実に達成するには、色素を用いた技術の実践が必要です。この送達経路を実験で使用する前に、マウスで球後バー注射を練習するために色素の使用を強くお勧めします。マウス組織で色素を目視で確認し、一貫した全身送達を確保できます。

球後注射法のデモンストレーションでは、イソフルランガスを使用して、手順の前にマウスに麻酔をかけました。処置の前に他の形態の麻酔を使用することもできますが、注射が完了する前にマウスが鎮静から回復しないようにすることが重要です。幸いなことに、実際の注射は通常1分もかからず、マウスを完全に麻酔する必要がある時間は短いです。注射中はマウスを完全に鎮静させる必要があり、注射前にマウスが意識がある場合は麻酔を再投与する必要があります。.麻酔の使用にはリスクが伴うため、マウスを鎮静する時間は最小限に抑える必要があります。イソフルランを使用して、メチルマロン酸血症およびプロピオン酸血症の小さな病気のマウスを鎮静させるのに問題はありませんでした。ただし、一部のマウスモデルは、鎮静や特定の麻酔に対してより敏感である場合があります。この潜在的な問題は、研究で鎮静剤を使用しようとする前に考慮する必要があります。最後に、鎮静剤を球後バー注射と組み合わせて使用すると、鎮静剤が一般的に使用されないTVIと比較して、注射プロセス中にマウスが示す明らかな苦痛が大幅に減少します。

注射後の問題は観察されていませんが、どの注射でも感染は潜在的なリスクです。感染の可能性を減らすために、滅菌された使い捨ての使い捨てシリンジと、精製されたAAVを希釈するための滅菌PBSが使用されます。私たちの動物施設のすべてのマウスは、潜在的な健康問題の兆候がないか毎日チェックされ、必要に応じて健康問題に対処するために獣医のケアを受けています。

球後洞注射の代替手段であり、若年マウスおよび成体マウスへの全身送達のより広く使用されている方法はTVIです。TVIおよび球後洞注射は、低分子および抗体の場合と同様の生体内分布をもたらし、外挿により、ウイルスベクターについても同じことが予想される^15,16。しかし、TVIによる遺伝子治療ベクターの全身送達と球後洞注射を比較した例は文献には見つからなかった。私たちの意見では、球後洞注射は、成長表現型および/または早期致死率が低下したマウスで実施するのが簡単です。

TVIは 、人間には 眼球後洞があるが 尾がないにもかかわらず、ヒトの全身分娩とより類似しているとよく考えられています。ある側面では、眼球後洞注射は、注射剤が末梢に挿入された中心カテーテル(PICCライン)または腕に配置された静脈内カテーテルによって人間に送達された場合と同じように、注射剤が上部静脈系に入るという点で人間の全身送達に似ています。逆に、注射剤は尾静脈注射後にマウスの下静脈系に入ります。残念ながら、これらの方法はいずれもヒトの全身送達に用いられた方法を正確に再現するものではありませんが、マウスにおける全身送達の効果的な方法です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV8-CAG-eGFP	Univ. Penn. Vector Core	Special order	alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available
Barrier (Filter) Tips, 20 μL size	ThermoFisher	AM12645	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile)	ThermoFisher	AM12648	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Dual Prodedure Circuit	VetEquip	921400	alternative anesthesia method can be used
Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette	Gilson	F123600	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Gilsen PIPETTEMAN Classic  P100 pipette	Gilson	F123615	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Hand warmers (HOTHANDS)	ULINE	S-1497B	to keep mouse warm while anesthesized
Insulin syringes, 31 G,  8 mm length, 3/10 mL capacity	Becton Dickson	328438	used in video; one syringe per injection
Isoflurane (Fluriso)	VETONE	502017	alternative anesthesia can be used
Medline Protection Plus Disposable Underpads	ThermoFisher	23-666-062	to place mouse on durring injection
Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid	ThermoFisher	22-730-434	for needle disposal
Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4	Gibco	10010023	To dilute AAV to desired concencentration and volume
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile)	ThermoFisher	3451	for diluting AAV to disire injection volume and conentration
Sterile gauze sponge 4"x"4	Covidien	3033
Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)	Ocenanside Pharmaceuticals	AK102D5DS	local  anesthetic
Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller)	Any	N/A	alternative to insulin syringe used in video
VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System.	VetEquip	chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf	link to users guide and manual