Systemische Behandlung von postnatalen, juvenilen und adulten Mäusen durch retrobulbäre Sinus-Injektion

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält ein Protokoll und ein begleitendes Video für die retrobulbäre Sinus-Injektion von bis zu einem Gesamtvolumen von 150 μl für postnatale, juvenile und adulte Mäuse. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut für die Injektion von kleinen Mäusen (15 g), wenn eine Injektion in die Schwanzvene nicht möglich ist.

Zusammenfassung

Während Schwanzveneninjektionen bei erwachsenen Mäusen häufig als systemischer Verabreichungsweg verwendet werden, sind retrobulbäre Injektionen eine alternative Methode zur systemischen Verabreichung mit weniger Einschränkungen. Erstens sind Schwanzveneninjektionen (TVIs) auf erwachsene Mäuse beschränkt, bei denen die Größe der Schwanzvene für den Zugang geeignet ist. Die Beschränkung auf die Behandlung adulter Mäuse kann problematisch sein, wenn es sich um Mausmodelle handelt, die nicht bis zum Erwachsenenalter überleben. Zweitens sind TVIs für Mausmodelle mit Wachstumsverzögerungsphänotypen, bei denen die Mäuse nie die Größe adulter Wildtyp-Mäuse erreichen, nicht durchführbar. Daher können retrobulbäre Injektionen erfolgreich zur Behandlung sowohl junger als auch kleiner erwachsener Mäuse eingesetzt werden. Schließlich werden retrobulbäre Injektionen unter Narkose durchgeführt, was für die Mäuse weniger belastend ist als TVIs, die üblicherweise ohne Anästhesie durchgeführt werden. In diesem Artikel werden ein Protokoll und detaillierte Anweisungen für retrobulbäre Injektionen vorgestellt, die für die systemische Verabreichung an kleine und junge Mäuse verwendet werden können.

Einleitung

Mausmodelle genetischer Krankheiten werden häufig verwendet, um die Wirksamkeit von niedermolekularen, genetischen und Zelltherapien zu demonstrieren¹. Bei Mäusen ist die am weitesten verbreitete Methode zur Replikation der systemischen Verabreichung an den Menschen die Schwanzveneninjektion (TVI), die typischerweise bei erwachsenen Mäusen im Alter von etwa 6-8 Wochen durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Vene groß genug ist, um Zugang zu erhalten. TVI wurde erfolgreich in zahlreichen präklinischen Proof-of-Principle-Studien zu genetischen Krankheiten wie Hämophilie eingesetzt, die klinische Studien zur Gentherapie am Menschen unterstützt haben². Viele Mausmodelle genetischer Erkrankungen weisen jedoch Wachstums- und/oder frühe Letalitätsphänotypen auf, die sie daran hindern, das Alter oder die Größe einer erwachsenen Maus zu erreichen (Abbildung 1). Die Behandlung solcher Mäuse mittels TVI kann je nach Alter der Letalität und/oder der maximalen Größe, die die Tiere erreichen können, äußerst schwierig, wenn nicht gar unmöglich sein.

Im Gegensatz dazu kann die systemische Verabreichung eines Therapeutikums durch retrobulbäre (häufig und fälschlicherweise als retroorbitale Sinusinjektion bezeichnet) bei Mäusen unabhängig von Alter oder Größe³ recht einfach durchgeführt werden. Retrobulbäre Injektionen von Adeno-assoziierten Viren (AAV) wurden erfolgreich in jungen, wachstumsverzögerten Mausmodellen genetischer Erkrankungen wie Methylmalonazidämie (MMA) und Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit^eingesetzt 4,5,6,7,8. (Dieses Verfahren kann auch zur Injektion von Neugeborenen 3,4,9,10 verwendet werden; diese Technik wird jedoch weder in diesem Protokoll noch im begleitenden Video ausführlich beschrieben.) Selbst hochgiftige Substanzen wie Doxorubicin können durch retrobulbäre Injektion sicher abgegeben werden^11,12. Im Gegensatz zur TVI werden Mäuse während der retrobulbären Sinus-Injektionen anästhesiert, was das Verfahren für die Maus weniger belastend und für den Bediener einfacher macht, da er die Maus nicht physisch fixieren muss^13,14. Ein weiteres Problem ist, dass TVI häufig eine Wärmelampe verwendet, um die Schwanzvene zu erweitern, was bei jungen Mäusen möglicherweise zu Dehydration führen könnte und in Mausmodellen für genetische Krankheiten, die eher auf hitzebedingten Stress zurückzuführen sind, problematisch sein könnte. Ein weiteres Problem, das bei der Verwendung von TVI auftreten kann, ist, dass die Schwanzvene bei hochpigmentierten Mäusen besonders schwierig zu visualisieren sein kann. Wie bei der TVI führt die retrobulbäre Sinus-Injektion jedoch zu einer breiten systemischen Biodistribution^15,16.

Protokoll

Dieses Protokoll und das dazugehörige Video gelten für den retrobulbären Injektionsraum von postnatalen, juvenilen und adulten Mäusen durch retrobulbäre Sinus-Injektion; Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) des National Human Genome Research Institute unter der Protokollnummer G-03-4 genehmigt. Andere Institutionen können andere Anforderungen und Einschränkungen haben, und dieses Protokoll muss möglicherweise geändert werden, damit es in Ihrem Institut genehmigt werden kann. Holen Sie die Genehmigung des ACUC Ihrer Institution ein, bevor Sie dieses oder ein anderes Tierverfahren durchführen.

1. Vorbereitung vor der Injektion

1. Verdünnen Sie die AAV bei jeder Injektion auf das gewünschte Injektionsvolumen und die gewünschte Konzentration mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie für jede Injektion ein zusätzliches Volumen von 50 % hinzu, um eine genaue Befüllung der sterilen Einwegspritze zu ermöglichen.
   HINWEIS: Hier verdünnen wir einen AAV8-CAG-eGFP-Reporter, um eine Dosis von 1 ×^{10 13}viralen Genomen pro kg Körpermasse (vg/kg) in einem Volumen von 50 μl zu verabreichen. Die Menge an AAV in den zu injizierenden 50 μl wird anhand des Gewichts des Tieres zum Zeitpunkt der Injektion berechnet. In diesem Video wird AAV über den retrobulbären Weg injiziert, um die systemische Verabreichung beim Menschen zu replizieren. Andere Gentherapievektoren (z. B. Lentivirus, Adenovirus), RNA-Therapien und kleine Moleküle können mit diesem Verfahren systemisch verabreicht werden.
2. Stellen Sie sicher, dass das Tischanästhesiesystem für Labortiere (LAAS) ordnungsgemäß eingerichtet ist und gemäß den Anweisungen des Herstellers ordnungsgemäß funktioniert.
   HINWEIS: Wenn eine alternative Anästhesiemethode verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die Anästhesie vor Beginn der Injektionen vorbereitet ist. Das retrobulbäre Injektionsverfahren sollte mit den meisten Anästhesien kompatibel sein (z. B. mit einer injizierbaren chemischen Fixierung wie Ketamin und Xylazin).
3. Bewegen Sie den Kolben vor dem Befüllen der sterilen Einwegspritze (hier eine Insulinspritze, 31 G, 8 mm lang, 3/10 ml Fassungsvermögen) mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass der Kolben sanft gedrückt werden kann. Füllen Sie dann die Spritze bis zum gewünschten Volumen und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
   HINWEIS: Volumina bis zu 150 μl können injiziert werden; Unser Labor injiziert in der Regel ein Volumen von 50 μl.

2. Sedierung der Maus durch Verabreichung von Isoflurangas mit einem Anästhesiesystem für Labortiere (LAAS)

1. Stellen Sie sicher, dass das Gas nur in die Induktionskammer strömt. Schließen Sie den Zweiwege-Absperrhahn zum nicht-rückatmenden Kreislauf (NRB).
2. Schalten Sie den grünen Sauerstoffdurchflussknopf an der Vorderseite des Durchflussmessers ein, so dass eine Durchflussmenge von 1 l/min erreicht wird.
3. Drehen Sie Isofluran auf ≤4%, indem Sie den Hebel oben am Verdampfer drücken und den Drehknopf auf die gewünschte Konzentration drehen.
4. Legen Sie die Maus in die durchsichtige Induktionskammer. Beobachten Sie die Atmung und Bewegung des Tieres genau. Sobald das Tier im Liegen liegt, drehen Sie den Verdampferknopf auf 2-2,5% Isofluran herunter.
5. Öffnen Sie den Zweiwegehahn zum NRB-Kreislauf, der an der Gesichtsmaske befestigt ist, und schließen Sie den Gasfluss zur Induktionsbox.
6. Entfernen Sie das Tier und legen Sie es in die Gesichtsmaske des NRB-Kreislaufs.
7. Verringern Sie die Einstellung der Isoflurankonzentration auf 1,5 % bis 1,75 %, je nach Reaktion auf Reize (z. B. Zehenkneifen oder Pfotendrücken).
8. Überwachen Sie die Atmung und die Schleimhautfarbe der Maus immer kontinuierlich (wenn möglich). Wenn die Atmung des Tieres erschwert wird oder die Schleimhautfarbe nicht rosa ist, verringern Sie die Anästhesiekonzentration.
9. Halten Sie das Tier während des gesamten Eingriffs warm. Verwenden Sie einen Handwärmer, der in ein Papiertuch gewickelt ist, das unter das Unterpolster gelegt wird und sich direkt unter der Maus befindet.
10. Schalten Sie den Sauerstoff und den Verdampfer nach Abschluss des Vorgangs aus.

3. Injektion des Tieres

1. Wenn Sie Rechtshänder sind, injizieren Sie das rechte Auge der Maus und positionieren Sie die Maus auf der linken Seite, wobei die Schnauze zur rechten Hand zeigt. Wenn Sie Linkshänder sind, injizieren Sie das linke Auge der Maus und positionieren Sie die Maus auf der rechten Seite, wobei die Schnauze zur linken Hand zeigt.
2. Tragen Sie ein oder zwei Tropfen Augenanästhetikum auf den Augapfel auf, der injiziert werden soll. Entfernen Sie dann überschüssige ophthalmische Anästhesielösung mit einem sterilen saugfähigen Mullkissen. Üben Sie mit den Fingerspitzen sanften Druck auf die Haut aus, dorsal und ventral zum Auge, um den Augapfel der Maus teilweise aus der Augenhöhle herauszuragen (Abbildung 2A, B).
   HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen übermäßigen Druck auf die umgebenden Halsgefäße auszuüben, wenn Sie das Auge hervorstehen, da dies den Blutfluss und die Injektion behindert. Außerdem könnte das Ausüben von Druck auf die Luftröhre die Maus am Atmen hindern. Stellen Sie sicher, dass die Maus während des gesamten Eingriffs atmen kann.
3. Halten Sie die Nadel in einer abgeschrägten Position in einem Winkel von ca. 30° und platzieren Sie sie in den medialen Canthus (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die Tiefe der Nadelplatzierung, um den retrobulbären Sinus zu erreichen, hängt von der Größe des Tieres ab. Wenn sich die Nadel während der Injektion in der abgeschrägten Position befindet, verringert sich das Risiko von Augenschäden. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu tief zu platzieren und die Augenhöhle zu durchstechen. Die Injektion sollte weniger als eine Minute dauern.
4. Üben Sie langsam und gleichmäßig Druck auf den Spritzenkolben aus, um das Injektor abzugeben. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer Extravasation.
5. Entfernen Sie die Nadel langsam und sanft.
6. Entfernen Sie die Gesichtsmaske von der Maus, um sich von der Narkose erholen zu können.

4. Nach der Injektion

1. Schalten Sie den Sauerstoff und den Verdampfer nach Abschluss des Vorgangs aus.
2. Verwenden Sie sterile Gaze, um Blut zu entfernen, wenn Restblutungen auftreten.
3. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus an einem warmen Ort (ca. 37 °C), aber nicht übermäßig heiß befindet, um eine Unterkühlung während der Genesung von der Narkose zu vermeiden.
4. Beobachten Sie die Maus isoliert, bis sie vollständig wiederhergestellt ist, bevor Sie sie wieder in den Käfig und das Rack einsetzen.
   HINWEIS: Durch das Isolieren der Maus während der Wiederherstellung wird verhindert, dass Käfigkameraden die sedierte Maus während der Wiederherstellung verletzen.

Ergebnisse

Die retrobulbäre Sinus-Injektion wurde erfolgreich eingesetzt, um kleine Moleküle, Antikörper und Adeno-assoziierte Viren (AAV) systemisch zu verabreichen4,5,9,15,16. In Abbildung 3 ist die Leber einer mit PBS (Vehikel) behandelten Maus und einer mit AAV8 behandelten Mausleber als Beispiel für die AAV-Injektion und -Expression nach einer retrobulbären Injektion dargestellt. AAV8 ist, wie viele natürlich vorkommende AAV-Vektoren, lebertrophisch. Daher ist eine signifikante Lebertransduktion bei einer Maus zu erwarten, die eine systemische Dosis von 5 ×^{10 12}vg/kg¹⁷ erhielt. Die große Anzahl von Hepatozyten, die Methylmalonyl-CoA-Mutase (MMUT)-RNA exprimieren (MMUT), die in Abbildung 3 zu sehen ist und vom AAV-Transgen exprimiert wird, deutet auf eine erfolgreiche retroorbitale Injektion hin.

Abbildung 1: Eine wachstumsverzögerte Maus mit Propionazidämie. Dies ist ein Beispiel für die extreme Wachstumsverzögerung, die in Mausmodellen genetischer Krankheiten auftreten kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Bilder und Diagramm der retrobulbären Sinus-Injektion. (A) Bild der Fingerplatzierung auf dem Fell zum hervortretenden Augapfel (gekennzeichnet durch einen weißen Pfeil). (B) Bild des Augapfels (gekennzeichnet durch einen weißen Pfeil) nach Anwendung von Abwärtsdruck auf das Fell vor dem Platzieren der Nadel und der Injektion. (C) Diagramm der Ausrichtung der Nadelfase (Abschrägung relativ zum Augapfel), des Nadelwinkels (30°) und der Platzierung der retrobulbären Sinussinusnadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: RNA-in-situ-Hybridisierung nach retrobulbärer Sinus-Injektion mit AAV8. Bilder von (A) 10x vehikelbehandelter Leber, (B) 10x AAV8-behandelter Leber, (C) 20x vehikelbehandelter Leber und (D) 20x AAV8-behandelter Leber, gefärbt mit MMUT-RNA. Mäuse mit Methylmalonazidämie wurden im Alter von 1 Monat mit einer Dosis von 5 ×¹² vg/kg AAV8-LPS-MMUT oder einer Vehikelkontrolle (PBS) behandelt. Lebergewebe wurde 1 Monat nach der Behandlung entnommen. MMUT RNA braun gefärbt (schwarze Pfeile zeigen Bereiche mit positiver Färbung an). Leber mit Hämatoxylin gegengefärbt. Maßstabsleisten = 100 μm 10x für Bilder, 50 μm für 20x Bilder (B). Abkürzungen: AAV = Adeno-assoziiertes Virus; LPS = leberspezifischer Promotor; MMUT = Methylmalonyl-CoA-Mutase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Während die retrobulbäre Injektion eine zuverlässige Methode zur Verabreichung von kleinen Molekülen, Proteinen und genomischen Therapien ist, ist das Üben der Technik mit einem Farbstoff notwendig, um sicherzustellen, dass eine zuverlässige und replizierbare systemische Verabreichung erreicht wird. Die Verwendung eines Farbstoffs wird dringend empfohlen, um retrobulbäre Injektionen bei Mäusen zu üben, bevor dieser Verabreichungsweg in Experimenten verwendet wird. Farbstoffe können im Mausgewebe visuell überprüft werden, um eine konsistente systemische Verabreichung zu gewährleisten.

Bei unserer Demonstration der retrobulbären Injektionstechnik wurde Isoflurangas verwendet, um die Mäuse vor dem Eingriff zu betäuben. Andere Formen der Anästhesie können vor dem Eingriff angewendet werden, aber es ist wichtig sicherzustellen, dass sich die Maus nicht von der Sedierung erholt, bevor die Injektion abgeschlossen ist. Glücklicherweise dauert die eigentliche Injektion in der Regel weniger als eine Minute und die Zeit, für die die Maus vollständig betäubt werden muss, ist kurz. Die Maus sollte während der Injektion vollständig sediert werden, und die Anästhesie sollte erneut verabreicht werden, wenn die Maus vor der Injektion das Bewusstsein erlangt. Da mit der Anwendung einer Anästhesie Risiken verbunden sind, sollte die Zeit, in der die Maus sediert wird, minimiert werden. Wir hatten keine Probleme bei der Verwendung von Isofluran zur Sedierung kleiner kranker Mäuse mit Methylmalon- und Propionazidämie. Einige Mausmodelle können jedoch empfindlicher auf Sedierung und bestimmte Anästhesie reagieren. Dieses potenzielle Problem sollte vor dem Versuch, eine Sedierung in einer Studie anzuwenden, in Betracht gezogen werden. Schließlich reduziert die Anwendung der Sedierung in Kombination mit der retrobulbären Injektion die scheinbare Belastung, die die Maus während des Injektionsprozesses zeigt, im Vergleich zur TVI, bei der die Sedierung nicht üblich ist, erheblich.

Wir haben keine Probleme im Zusammenhang mit der Nachinjektion beobachtet, obwohl eine Infektion bei jeder Injektion ein potenzielles Risiko darstellt. Um das Risiko einer Infektion zu verringern, werden eine sterile Einwegspritze und steriles PBS zur Verdünnung des gereinigten AAV verwendet. Alle Mäuse in unserer Tieranlage werden täglich auf Anzeichen möglicher Gesundheitsprobleme untersucht und erhalten tierärztliche Versorgung, um bei Bedarf gesundheitliche Probleme zu beheben.

Die Alternative zur retrobulbären Sinus-Injektion und die weiter verbreitete Methode der systemischen Verabreichung an juvenile und adulte Mäuse ist die TVI. TVI und retrobulbäre Sinus-Injektion führen zu einer ähnlichen Bioverteilung bei kleinen Molekülen und Antikörpern, und durch Extrapolation wäre dasselbe für virale Vektoren zu erwarten^15,16. In der Literatur konnten jedoch keine Beispiele gefunden werden, die die systemische Verabreichung von Gentherapievektoren durch TVI und retrobulbäre Sinusinjektion vergleichen. Unserer Meinung nach sind retrobulbäre Sinus-Injektionen bei Mäusen mit einem verminderten Wachstumsphänotyp und/oder einer frühen Letalität einfacher durchzuführen.

TVI wird oft als analoger zur systemischen Verabreichung beim Menschen angesehen, obwohl der Mensch einen retrobulbären Sinus, aber keinen Schwanz hat. In einem Aspekt ähnelt die retrobulbäre Sinus-Injektion der systemischen Verabreichung beim Menschen insofern, als das Injektor in das obere Venensystem eintritt, so als ob ein Injektor einem Menschen durch einen peripher eingeführten Zentralkatheter (PICC-Leitung) oder einen intravenösen Katheter im Arm verabreicht würde. Umgekehrt gelangt das Injektor nach der Injektion in die Schwanzvene in das untere Venensystem einer Maus. Leider repliziert keine dieser Methoden genau die Methode(n), die für die systemische Verabreichung beim Menschen verwendet werden, aber beide sind wirksame Methoden der systemischen Verabreichung bei Mäusen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV8-CAG-eGFP	Univ. Penn. Vector Core	Special order	alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available
Barrier (Filter) Tips, 20 μL size	ThermoFisher	AM12645	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile)	ThermoFisher	AM12648	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Dual Prodedure Circuit	VetEquip	921400	alternative anesthesia method can be used
Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette	Gilson	F123600	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Gilsen PIPETTEMAN Classic  P100 pipette	Gilson	F123615	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Hand warmers (HOTHANDS)	ULINE	S-1497B	to keep mouse warm while anesthesized
Insulin syringes, 31 G,  8 mm length, 3/10 mL capacity	Becton Dickson	328438	used in video; one syringe per injection
Isoflurane (Fluriso)	VETONE	502017	alternative anesthesia can be used
Medline Protection Plus Disposable Underpads	ThermoFisher	23-666-062	to place mouse on durring injection
Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid	ThermoFisher	22-730-434	for needle disposal
Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4	Gibco	10010023	To dilute AAV to desired concencentration and volume
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile)	ThermoFisher	3451	for diluting AAV to disire injection volume and conentration
Sterile gauze sponge 4"x"4	Covidien	3033
Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)	Ocenanside Pharmaceuticals	AK102D5DS	local  anesthetic
Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller)	Any	N/A	alternative to insulin syringe used in video
VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System.	VetEquip	chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf	link to users guide and manual