Системное лечение постнатальных, ювенильных и взрослых мышей методом инъекции ретробульбарного синуса

Резюме

В этой статье представлен протокол и сопроводительное видео для инъекции ретробульбарного синуса общим объемом до 150 мкл для постнатальных, ювенильных и взрослых мышей. Эта процедура особенно хорошо подходит для инъекций маленьким мышам (15 г), когда инъекция в хвостовую вену невозможна.

Аннотация

В то время как инъекции в хвостовую вену часто используются в качестве системного пути доставки у взрослых мышей, ретробульбарные инъекции являются альтернативным методом системной доставки с меньшими ограничениями. Во-первых, инъекции в хвостовую вену (TVI) ограничены взрослыми мышами, размер которых подходит для доступа. Ограничение лечением взрослых мышей может быть проблематичным при работе с мышиными моделями, которые не доживают до взрослого возраста. Во-вторых, TVI неприменимы для мышиных моделей с фенотипами задержки роста, где мыши никогда не достигают размера взрослых мышей дикого типа. Поэтому ретробульбарные инъекции можно с успехом применять для лечения как молодых, так и маленьких взрослых мышей. Наконец, ретробульбарные инъекции проводятся под анестезией, что вызывает меньший стресс у мышей, чем ТВИИ, которые обычно проводятся без анестезии. В этой статье представлен протокол и подробная инструкция по ретробульбарным инъекциям, которые можно использовать для системной доставки маленьким и молодым мышам.

Введение

Мышиные модели генетических заболеваний обычно используются для демонстрации эффективности низкомолекулярной, генетической и клеточной терапии¹. У мышей наиболее широко используемым методом репликации системной доставки человеку является инъекция в хвостовую вену (TVI), которая обычно выполняется взрослым мышам в возрасте примерно 6-8 недель, чтобы убедиться, что вена достаточно велика для доступа. TVI успешно используется в многочисленных доклинических исследованиях генетических заболеваний, таких как гемофилия, которые поддерживали клинические испытания генной терапии^на людях. Тем не менее, многие мышиные модели генетических заболеваний имеют фенотипы роста и/или ранней летальности, которые не позволяют им достичь возраста или размера взрослой мыши (рис. 1). Лечение таких мышей с помощью TVI может быть чрезвычайно сложным, если не невозможным, в зависимости от возраста летальности и/или максимального размера, которого могут достичь животные.

Напротив, системная доставка терапевтического агента с помощью ретробульбарной (часто и неправильно называемой ретроорбитальной) синусовой инъекции может быть осуществлена довольно легко у мышей независимо от возраста или размера³. Ретробульбарные инъекции аденоассоциированного вируса (AAV) были успешно использованы в моделях генетических заболеваний у молодых мышей с задержкой роста, таких как метилмалоновая ацидемия (ММА) и болезнь Нимана-Пика типа С 4,5,6,7,8. (Эта процедура также может быть использована для инъекций новорожденным 3,4,9,10; однако эта техника не подробно описана в данном протоколе или прилагаемом видео.) Даже высокотоксичные вещества, такие как доксорубицин, могут быть безопасно доставлены с помощью ретробульбарной инъекции^11,12. В отличие от TVI, мышей обезболивают во время инъекций ретробульбарного синуса, что делает процедуру менее стрессовой для мыши и более легкой для оператора, которому не приходится физически удерживать мышь^13,14. Дополнительная проблема заключается в том, что TVI часто использует тепловую лампу для расширения хвостовой вены, что потенциально может вызвать обезвоживание у молодых мышей и может быть проблематичным в мышиных моделях генетических заболеваний, которые более подозрительны к стрессу, связанному с жарой. Еще одна проблема, которая может возникнуть при использовании TVI, заключается в том, что хвостовую вену может быть особенно сложно визуализировать у мышей с высокой пигментацией. Однако, как и ТВИ, инъекции ретробульбарного синуса приводят к широкому системному биораспределению^15,16.

протокол

Этот протокол и сопровождающее его видео предназначены для ретробульбарного инъекционного пространства постнатальных, ювенильных и взрослых мышей с помощью инъекции ретробульбарного синуса; протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Национального научно-исследовательского института генома человека под номером G-03-4. Другие учреждения могут иметь другие требования и ограничения, и этот протокол может потребоваться изменить для утверждения в вашем учреждении. Получите одобрение от ACUC вашего учреждения перед выполнением этой или любой другой процедуры на животных.

1. Прединъекционная подготовка

1. Разбавляйте AAV до желаемого объема и концентрации для инъекции стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл для каждой инъекции. Добавляйте дополнительные 50% объема для каждой инъекции, чтобы обеспечить точное наполнение одноразового стерильного шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы разбавляем репортер AAV8-CAG-eGFP для доставки дозы 1 ×^{10 13}вирусных геномов на кг массы тела (vg/кг) в объеме 50 μл. Количество AAV в 50 μл, которые будут вводиться, рассчитывается с использованием веса животного на момент инъекции. В этом видео AAV вводится ретробульбарным путем для репликации системной доставки у людей. Другие векторы генной терапии (например, лентивирус, аденовирус), РНК-терапия и малые молекулы могут быть доставлены системно с помощью этой процедуры.
2. Убедитесь, что настольная система анестезии лабораторных животных (LAAS) правильно настроена и функционирует в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется альтернативный метод анестезии, убедитесь, что анестезия подготовлена до начала инъекций. Процедура ретробульбарной инъекции должна быть совместима с большинством анестезий (например, с инъекционными химическими ограничителями, такими как кетамин и ксилазин).
3. Перед наполнением одноразового стерильного шприца (в данном случае инсулиновый шприц, 31 г, длина 8 мм, емкость 3/10 мл) несколько раз переместите поршень вверх и вниз, чтобы обеспечить плавное нажатие на поршень. Затем наполните шприц до нужного объема, следя за тем, чтобы в нем не было пузырьков воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно впрыскивать объемы до 150 μл; Наша лаборатория обычно вводит объем 50 μл.

2. Седация у мышей путем введения газообразного изофлурана с помощью системы анестезии лабораторных животных (LAAS)

1. Следите за тем, чтобы газ подавал только в индукционную камеру. Закройте двусторонний запорный кран на цепь без повторного дыхания (NRB).
2. Включите зеленую ручку подачи кислорода на передней части расходомера так, чтобы расход составлял 1 л/мин.
3. Поверните изофлуран до ≤4%, нажав на рычаг в верхней части испарителя и повернув диск до нужной концентрации.
4. Поместите мышь в прозрачную индукционную камеру. Внимательно следите за дыханием и движениями животного. Как только животное ляжет, поверните ручку испарителя вниз до 2-2,5% изофлурана.
5. Откройте двусторонний запорный кран к цепи NRB, прикрепленной к лицевой маске, и закройте поток газа к впускной коробке.
6. Снимите животное и поместите его в лицевую маску цепи NRB.
7. Уменьшите концентрацию изофлурана до 1,5%-1,75% в зависимости от реакции на раздражители (например, сжатие пальца ноги или сжатие лапы).
8. Всегда постоянно следите за дыханием мыши и цветом слизистых оболочек (если это возможно). Если дыхание животного становится затрудненным или цвет слизистой оболочки не розовый, уменьшите концентрацию анестетика.
9. Держите животное в тепле на протяжении всей процедуры. Используйте грелку для рук, завернутую в бумажное полотенце, которое кладут под пеленку и располагают непосредственно под мышью.
10. После завершения процедуры выключите кислород и испаритель.

3. Инъекция животному

1. Если вы правша, введите правый глаз мыши и расположите мышь на левой стороне так, чтобы морда была направлена в правую руку. Если вы левша, введите левый глаз мыши и расположите мышь на правой стороне так, чтобы морда была направлена в левую руку.
2. Нанесите одну или две капли офтальмологического анестетика на глазное яблоко, которое будет вводиться инъекционно. Затем удалите излишки раствора офтальмологического анестетика с помощью стерильной абсорбирующей марлевой салфетки. Осторожно надавите кончиками пальцев на кожу с тыльной и вентральной стороны глаза, чтобы глазное яблоко мыши частично выступило из глазницы (рис. 2A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не оказывайте чрезмерного давления на окружающие шейные сосуды при выпячивании глаза, так как это затруднит кровоток и инъекцию. Кроме того, давление на трахею может помешать мыши дышать. Убедитесь, что мышь может дышать на протяжении всей процедуры.
3. Держите иглу в скошенном положении под углом примерно 30° и поместите в медиальный кантус (Рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина размещения иглы для достижения ретробульбарного синуса будет варьироваться в зависимости от размера животного. Нахождение иглы в скошенном положении во время инъекции снижает риск повреждения глаз. Будьте осторожны, чтобы не поместить иглу слишком глубоко и не проколоть глазницу. Инъекция должна занять не более минуты.
4. Медленно и плавно надавите на поршень шприца, чтобы подать инъекцию. Это снизит вероятность экстравазации.
5. Извлекайте иглу медленно и плавно.
6. Снимите лицевую маску с мыши, чтобы дать возможность восстановиться после анестезии.

4. Последующая инъекция

1. После завершения процедуры выключите кислород и испаритель.
2. Используйте стерильную марлю для удаления крови при возникновении остаточного кровотечения.
3. Убедитесь, что мышь находится в теплом месте (примерно 37 °C), но не в чрезмерно горячем, чтобы предотвратить переохлаждение во время восстановления после анестезии.
4. Наблюдайте за мышью изолированно до полного восстановления, прежде чем возвращать мышь в клетку и стойку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция мыши во время восстановления предотвращает травмирование мыши соседями по клетке во время восстановления.

Результаты

Инъекция ретробульбарного синуса успешно используется для системной доставки малых молекул, антител и аденоассоциированного вируса (AAV)4,5,9,15,16. На рисунке 3 показана печень мыши, получавшей PBS (носитель) и печень мыши, получавшей AAV8, в качестве примера инъекции и экспрессии AAV после ретробульбарной инъекции. AAV8, как и многие природные векторы AAV, является трофиком печени. Таким образом, ожидается существенная печеночная трансдукция у мышей, получавших системную дозу 5 ×^{10 12}vg/кг¹⁷. Большое количество гепатоцитов, экспрессирующих РНК метилмалонил-КоА-мутазы (MMUT), показанную на рисунке 3, которая экспрессируется трансгеном AAV, указывает на успешную ретроорбитальную инъекцию.

Рисунок 1: Мышь с задержкой роста и пропионовой ацидемией. Это пример экстремальной задержки роста, которая может иметь место в мышиных моделях генетических заболеваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Изображения и схема инъекции ретробульбарного синуса. (A) Изображение расположения пальца на шерсти для выступающего глазного яблока (обозначено белой стрелкой). (B) Изображение выступа глазного яблока (обозначено белой стрелкой) после приложения давления вниз на шерсть перед уколом и инъекцией. (C) Диаграмма ориентации скоса иглы (скос вниз относительно глазного яблока), угла наклона иглы (30°) и расположения иглы ретробульбарного синуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Гибридизация РНК in situ после инъекции ретробульбарного синуса с AAV8. Изображения (A) 10-кратной печени, обработанной транспортным средством, (B) 10-кратной печени, обработанной AAV8, (C) 20-кратной печени, обработанной транспортным средством, и (D) 20-кратной печени, обработанной AAV8, окрашенной на MMUT RNA. Мышей с метилмалоновой ацидемией лечили дозой 5 ×^{10 12} вг/кг AAV8-LPS-MMUT или контрольным носителем (PBS) в возрасте 1 месяца. Ткань печени собирали через 1 месяц после лечения. ММУТ РНК окрашена в коричневый цвет (черными стрелками обозначены участки положительного окрашивания). Печень контрокрашивается гематоксилином. Масштабные линейки = 100 μм 10x для изображений, 50 μm для 20x изображений (B). Сокращения: AAV = аденоассоциированный вирус; ЛПС = печеночный специфичный промотор; MMUT = метилмалонил-КоА-мутаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В то время как ретробульбарная инъекция является надежным методом доставки малых молекул, белков и геномной терапии, практика этой техники с помощью красителя необходима для обеспечения надежной и воспроизводимой системной доставки. Использование красителя настоятельно рекомендуется для отработки ретробульбарных инъекций у мышей перед использованием этого пути доставки в экспериментах. Красители могут быть визуально проверены в тканях мыши, чтобы обеспечить стабильную системную доставку.

В нашей демонстрации техники ретробульбарной инъекции газ изофлуран использовался для обезболивания мышей перед процедурой. Перед процедурой можно использовать другие формы анестезии, но важно убедиться, что мышь не оправится от седации до завершения инъекции. К счастью, фактическая инъекция обычно занимает менее минуты, а время, в течение которого мышь должна быть полностью обезболиваена, невелико. Во время инъекции мышь должна быть полностью успокоена, а анестезия должна быть введена повторно, если мышь приходит в сознание до инъекции. Поскольку существуют риски, связанные с использованием анестезии, продолжительность нахождения мыши под действием седативных препаратов должна быть сведена к минимуму. У нас не было проблем с использованием изофлурана для успокоения мелких больных мышей с метилмалоновой и пропионовой ацидемией. Тем не менее, некоторые модели мышей могут быть более чувствительны к седации и определенной анестезии. Эту потенциальную проблему следует учитывать, прежде чем пытаться использовать седативный препарат в исследовании. Наконец, использование седации в сочетании с ретробульбарной инъекцией значительно уменьшает кажущееся дистресс, которое мышь проявляет в процессе инъекции, по сравнению с TVI, где седация обычно не используется.

Мы не наблюдали каких-либо проблем, связанных с инъекцией, хотя инфекция представляет потенциальный риск при любой инъекции. Для снижения вероятности инфицирования используется стерильный одноразовый шприц и стерильный PBS для разбавления очищенного AAV. Все мыши в нашем животноводческом хозяйстве ежедневно проверяются на наличие признаков потенциальных проблем со здоровьем и получают ветеринарную помощь для решения любых проблем со здоровьем, когда это оправдано.

Альтернативой инъекции ретробульбарного синуса и более широко используемым методом системной доставки молодым и взрослым мышам является TVI. TVI и инъекция ретробульбарного синуса приводят к аналогичному биораспределению в случае малых молекул и антител, и при экстраполяции то же самое можно было бы ожидать для вирусных векторов^15,16. Однако в литературе не найдено примеров, сравнивающих системную доставку векторов генной терапии с помощью TVI и инъекцию ретробульбарного синуса. По нашему мнению, инъекции ретробульбарного синуса легче проводить у мышей со сниженным фенотипом роста и/или ранней летальностью.

TVI часто считается более аналогом системной доставки у людей, несмотря на то, что у людей есть ретробульбарный синус, но нет хвоста. С одной стороны, инъекция ретробульбарного синуса похожа на системную доставку человека в том смысле, что инъекционный ввод поступает в верхнюю венозную систему так же, как если бы инъектор был доставлен человеку с помощью периферически вставленного центрального катетера (ПВЦК) или внутривенного катетера, помещенного в руку. И наоборот, инъекционный препарат поступает в нижнюю венозную систему мыши после введения в хвостовую вену. К сожалению, ни один из этих методов в точности не повторяет метод(ы), используемый для системной доставки у людей, но оба являются эффективными методами системной доставки у мышей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV8-CAG-eGFP	Univ. Penn. Vector Core	Special order	alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available
Barrier (Filter) Tips, 20 μL size	ThermoFisher	AM12645	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile)	ThermoFisher	AM12648	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Dual Prodedure Circuit	VetEquip	921400	alternative anesthesia method can be used
Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette	Gilson	F123600	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Gilsen PIPETTEMAN Classic  P100 pipette	Gilson	F123615	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Hand warmers (HOTHANDS)	ULINE	S-1497B	to keep mouse warm while anesthesized
Insulin syringes, 31 G,  8 mm length, 3/10 mL capacity	Becton Dickson	328438	used in video; one syringe per injection
Isoflurane (Fluriso)	VETONE	502017	alternative anesthesia can be used
Medline Protection Plus Disposable Underpads	ThermoFisher	23-666-062	to place mouse on durring injection
Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid	ThermoFisher	22-730-434	for needle disposal
Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4	Gibco	10010023	To dilute AAV to desired concencentration and volume
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile)	ThermoFisher	3451	for diluting AAV to disire injection volume and conentration
Sterile gauze sponge 4"x"4	Covidien	3033
Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)	Ocenanside Pharmaceuticals	AK102D5DS	local  anesthetic
Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller)	Any	N/A	alternative to insulin syringe used in video
VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System.	VetEquip	chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf	link to users guide and manual