Tratamento sistêmico para camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados por injeção de seio retrobulbar

Resumo

Este artigo fornece um protocolo e um vídeo de acompanhamento para a injeção de seio retrobulbar de até um volume total de 150 μL para camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados. Este procedimento é particularmente adequado para a injeção de camundongos pequenos (15 g) quando a injeção da veia da cauda não é viável.

Resumo

Embora as injeções na veia da cauda sejam frequentemente usadas como uma via sistêmica de entrega em camundongos adultos, as injeções retrobulbares são um método alternativo para entrega sistêmica com menos limitações. Primeiro, as injeções de veias da cauda (TVIs) são limitadas a camundongos adultos, onde o tamanho da veia da cauda é adequado para acesso. Ficar restrito ao tratamento de camundongos adultos pode ser problemático ao lidar com modelos de camundongos que não sobrevivem até a idade adulta. Em segundo lugar, os TVIs não são viáveis para modelos de camundongos com fenótipos de retardo de crescimento, onde os camundongos nunca atingem o tamanho de camundongos adultos do tipo selvagem. Portanto, as injeções retrobulbares podem ser usadas com sucesso para tratar camundongos adultos jovens e pequenos. Por fim, as injeções retrobulbares são realizadas sob anestesia, o que é menos estressante para os camundongos do que as TVIs que são comumente realizadas sem anestesia. Este artigo apresenta um protocolo e instruções detalhadas para injeções retrobulbares que podem ser usadas para entrega sistêmica a camundongos pequenos e jovens.

Introdução

Modelos murinos de doenças genéticas são comumente usados para demonstrar a eficácia de terapias de pequenas moléculas, genéticas e celulares¹. Em camundongos, o método mais amplamente utilizado para replicar a entrega sistêmica a humanos é a injeção na veia da cauda (TVI), que normalmente é realizada em camundongos adultos com aproximadamente 6-8 semanas de idade para garantir que a veia seja grande o suficiente para acessar. A TVI tem sido usada com sucesso em vários estudos pré-clínicos de prova de princípio de doenças genéticas, como hemofilia, que apoiaram ensaios clínicos em humanos para terapia gênica². No entanto, muitos modelos murinos de doenças genéticas têm fenótipos de crescimento e/ou letalidade precoce, o que os impede de atingir a idade ou o tamanho de um camundongo adulto (Figura 1). Tratar esses camundongos via TVI pode ser extremamente difícil, se não impossível, dependendo da idade de letalidade e / ou do tamanho máximo que os animais podem atingir.

Em contraste, a administração sistêmica de um agente terapêutico por injeção de seio retrobulbar (freqüente e incorretamente chamada de retro-orbital) pode ser feita prontamente em camundongos, independentemente da idade ou tamanho³. Injeções retrobulbares de vírus adeno-associado (AAV) têm sido usadas com sucesso em modelos murinos jovens com retardo de crescimento de doenças genéticas, como acidemia metilmalônica (MMA) e doença de Niemann-Pick tipo C 4,5,6,7,8. (Este procedimento também pode ser usado para injetar neonatos 3,4,9,10; no entanto, esta técnica não é detalhada neste protocolo ou no vídeo que o acompanha.) Mesmo substâncias altamente tóxicas como a doxorrubicina podem ser administradas com segurança por injeção retrobulbar^11,12. Ao contrário do TVI, os camundongos são anestesiados durante as injeções do seio retrobulbar, o que torna o procedimento menos estressante para o camundongo e mais fácil para o operador, que não precisa conter fisicamente o camundongo^13,14. Uma preocupação adicional é que o TVI freqüentemente usa uma lâmpada de calor para dilatar a veia da cauda, o que poderia causar desidratação em camundongos jovens e pode ser problemático em modelos murinos de doenças genéticas que são mais suspeitas de estresse relacionado ao calor. Outro problema que pode surgir ao usar o TVI é que a veia da cauda pode ser particularmente difícil de visualizar em camundongos altamente pigmentados. No entanto, assim como o TVI, as injeções de seios retrobulbares resultam em uma ampla biodistribuição sistêmica^15,16.

Protocolo

Este protocolo e o vídeo que o acompanha são para o espaço de injeção retrobulbar de camundongos adultos pós-natais, juvenis e runados por injeção de seio retrobulbar; o protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano sob o número de protocolo G-03-4. Outras instituições podem ter requisitos e restrições diferentes, e este protocolo pode precisar ser modificado para aprovação em seu instituto. Obtenha a aprovação do ACUC da sua instituição antes de realizar este ou qualquer outro procedimento em animais.

1. Preparação pré-injeção

1. Dilua o AAV até o volume e concentração de injeção desejados com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para cada injeção. Adicione um volume extra de 50% para cada injeção para permitir o enchimento preciso da seringa estéril de uso único.
   NOTA: Aqui estamos diluindo um repórter AAV8-CAG-eGFP para fornecer uma dose de 1 × 10¹³genomas virais por kg de massa corporal (vg / kg) em um volume de 50 μL. A quantidade de AAV nos 50 μL a injetar é calculada utilizando o peso do animal no momento da injeção. Neste vídeo, o AAV está sendo injetado por via retrobulbar para replicar a entrega sistêmica em humanos. Outros vetores de terapia gênica (ou seja, lentivírus, adenovírus), terapias de RNA e pequenas moléculas podem ser administrados sistemicamente usando este procedimento.
2. Certifique-se de que o sistema de anestesia para animais de laboratório (LAAS) de mesa esteja configurado corretamente e funcionando corretamente de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Se um método de anestesia alternativo for usado, certifique-se de que a anestesia seja preparada antes de iniciar as injeções. O procedimento de injeção retrobulbar deve ser compatível com a maioria das anestesias (por exemplo, uma restrição química injetável como cetamina e xilazina).
3. Antes de encher a seringa estéril de uso único (aqui, uma seringa de insulina, 31 G, 8 mm de comprimento, capacidade de 3/10 mL), mova o êmbolo para cima e para baixo várias vezes para garantir que o êmbolo possa ser pressionado suavemente. Em seguida, encha a seringa até o volume desejado, garantindo que não haja bolhas de ar.
   NOTA: Volumes de até 150 μL podem ser injetados; nosso laboratório normalmente injeta um volume de 50 μL.

2. Sedação de camundongos por meio da administração de gás isoflurano com um sistema de anestesia em animais de laboratório (LAAS)

1. Certifique-se de que o gás esteja fluindo apenas para a câmara de indução. Feche a torneira bidirecional para o circuito sem reinalação (NRB).
2. Ligue o botão verde de fluxo de oxigênio na frente do medidor de vazão para que haja uma vazão de 1 L/min.
3. Gire o isoflurano para ≤4% pressionando a alavanca na parte superior do vaporizador e girando o botão para a concentração desejada.
4. Coloque o mouse na câmara de indução transparente. Observe a respiração e o movimento do animal com cuidado. Quando o animal estiver deitado, gire o botão do vaporizador para baixo para 2-2,5% de isoflurano.
5. Abra a torneira bidirecional para o circuito NRB conectado à máscara facial e feche o fluxo de gás para a caixa de indução.
6. Retire o animal e coloque-o na máscara facial do circuito NRB.
7. Diminua a configuração de concentração de isoflurano para 1,5% -1,75%, conforme determinado pela reação a estímulos (por exemplo, beliscar o dedo do pé ou apertar a pata).
8. Sempre monitore continuamente a respiração do mouse e a cor da membrana mucosa (se possível). Se a respiração do animal ficar difícil ou a cor da membrana mucosa não for rosa, diminua a concentração do anestésico.
9. Mantenha o animal aquecido durante todo o procedimento. Use um aquecedor de mãos embrulhado em uma toalha de papel que é colocada embaixo da almofada e localizada diretamente embaixo do mouse.
10. Desligue o oxigênio e o vaporizador após a conclusão do procedimento.

3. Injeção do animal

1. Se for destro, injete o olho direito do mouse e posicione-o do lado esquerdo com o focinho apontando para a mão direita. Se for canhoto, injete o olho esquerdo do mouse e posicione-o do lado direito com o focinho apontando para a mão esquerda.
2. Aplique uma ou duas gotas de anestésico oftálmico no globo ocular, que deve ser injetado. Em seguida, remova qualquer excesso de solução anestésica oftálmica usando uma gaze absorvente estéril. Aplique uma leve pressão com as pontas dos dedos na pele, dorsal e ventral ao olho para projetar parcialmente o globo ocular do camundongo da cavidade (Figura 2A, B).
   NOTA: Tenha cuidado para não aplicar pressão excessiva nos vasos cervicais circundantes ao projetar o olho, pois isso impedirá o fluxo sanguíneo e a injeção. Além disso, aplicar pressão na traqueia pode impedir o camundongo de respirar. Certifique-se de que o mouse possa respirar durante todo o procedimento.
3. Mantenha a agulha em uma posição chanfrada para baixo em um ângulo de aproximadamente 30 ° e colocada no canto medial ( Figura 2C ).
   NOTA: A profundidade da colocação da agulha para alcançar o seio retrobulbar varia de acordo com o tamanho do animal. Ter a agulha na posição de chanfro para baixo durante a injeção diminui o risco de danos oculares. Tenha cuidado para não colocar a agulha muito fundo e perfurar a órbita ocular. A injeção deve demorar menos de um minuto.
4. Aplique pressão lenta e suavemente no êmbolo da seringa para administrar o injetado. Isso reduzirá a chance de extravasamento.
5. Remova a agulha lenta e suavemente.
6. Remova a máscara facial do mouse para permitir a recuperação da anestesia.

4. Pós-injeção

1. Desligue o oxigênio e o vaporizador após a conclusão do procedimento.
2. Use gaze estéril para remover o sangue se ocorrer sangramento residual.
3. Certifique-se de que o mouse esteja em uma área quente (aproximadamente 37 ° C), mas não excessivamente quente, para evitar hipotermia durante a recuperação da anestesia.
4. Observe o mouse isoladamente até que esteja completamente recuperado antes de retornar o mouse à gaiola e ao rack.
   NOTA: Isolar o mouse durante a recuperação evita que os companheiros de gaiola machuquem o mouse sedado durante a recuperação.

Resultados

A injeção do seio retrobulbar tem sido usada com sucesso para fornecer sistemicamente pequenas moléculas, anticorpos e vírus adeno-associados (AAV)4,5,9,15,16. Na Figura 3, o fígado de um camundongo tratado com PBS (veículo) e um fígado de camundongo tratado com AAV8 são mostrados como um exemplo de injeção e expressão de AAV após uma injeção retrobulbar. AAV8, como muitos vetores AAV de ocorrência natural, é trófico hepático. Portanto, espera-se uma transdução hepática substancial em um camundongo que recebeu uma dose sistêmica de 5 × 10¹²vg / kg¹⁷. O grande número de hepatócitos expressando RNA de metilmalonil-CoA mutase (MMUT) visto na Figura 3, que está sendo expresso pelo transgene AAV, indica uma injeção retroorbital bem-sucedida.

Figura 1: Um camundongo com retardo de crescimento com acidemia propiônica. Este é um exemplo do retardo extremo de crescimento que pode ocorrer em modelos murinos de doenças genéticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens e diagrama da injeção do seio retrobulbar. (A) Imagem da colocação do dedo no pelo para o globo ocular saliente (indicado pela seta branca). (B) Imagem da protrusão do globo ocular (indicada pela seta branca) após a aplicação de pressão para baixo no pelo antes da colocação da agulha e injeção. (C) Diagrama da orientação do chanfro da agulha (chanfro para baixo em relação ao globo ocular), ângulo da agulha (30°) e colocação da agulha do seio retrobulbar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Hibridização in situ de RNA após injeção de seio retrobulbar com AAV8. Imagens de (A) 10x fígado tratado com veículo, (B) 10x fígado tratado com AAV8, (C) 20x fígado tratado com veículo e (D) 20x fígado tratado com AAV8 corado para RNA MMUT. Camundongos com acidemia metilmalônica foram tratados com uma dose de 5 × 10¹² vg/kg de AAV8-LPS-MMUT ou um veículo controle (PBS) com 1 mês de idade. O tecido hepático foi coletado 1 mês após o tratamento. MMUT RNA corado marrom (setas pretas indicam áreas de coloração positiva). Fígado contracorado com hematoxilina. Barras de escala = 100 μm 10x para imagens, 50 μm para imagens 20x (B). Abreviaturas: AAV = vírus adeno-associado; LPS = Promotor específico do fígado; MMUT = metilmalonil-CoA mutase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Embora a injeção retrobulbar seja um método confiável para fornecer pequenas moléculas, proteínas e terapias genômicas, é necessário praticar a técnica com um corante para garantir que a entrega sistêmica confiável e replicável seja alcançada. O uso de um corante é altamente recomendado para a prática de injeções retrobulbares em camundongos antes de usar essa via de entrega em experimentos. Os corantes podem ser verificados visualmente nos tecidos do camundongo para garantir uma entrega sistêmica consistente.

Em nossa demonstração da técnica de injeção retrobulbar, o gás isoflurano foi usado para anestesiar os camundongos antes do procedimento. Outras formas de anestesia podem ser usadas antes do procedimento, mas é importante garantir que o camundongo não se recupere da sedação antes que a injeção seja concluída. Felizmente, a injeção real geralmente leva menos de um minuto e o tempo pelo qual o mouse precisa ser totalmente anestesiado é breve. O camundongo deve ser completamente sedado durante a injeção e a anestesia deve ser readministrada se o camundongo ficar consciente antes da injeção. Como existem riscos associados ao uso de anestesia, a duração do tempo em que o camundongo fica sedado deve ser minimizada. Não tivemos problemas com o uso de isoflurano para sedar pequenos camundongos doentes com acidemia metilmalônica e propiônica. No entanto, alguns modelos de camundongos podem ser mais sensíveis à sedação e a certas anestesias. Esse problema potencial deve ser considerado antes de tentar usar sedação em um estudo. Por fim, o uso de sedação em combinação com a injeção retrobulbar reduz muito o sofrimento aparente que o camundongo exibe durante o processo de injeção em comparação com o TVI, onde a sedação não é comumente usada.

Não observamos nenhum problema relacionado à pós-injeção, embora a infecção seja um risco potencial com qualquer injeção. Para reduzir a chance de infecção, uma seringa descartável estéril de uso único e PBS estéril para diluir o AAV purificado são usados. Todos os ratos em nossas instalações para animais são verificados diariamente quanto a sinais de possíveis problemas de saúde e recebem cuidados veterinários para resolver quaisquer problemas de saúde quando necessário.

A alternativa à injeção do seio retrobulbar e o método mais amplamente utilizado de entrega sistêmica a camundongos jovens e adultos é o TVI. A TVI e a injeção do seio retrobulbar resultam em uma biodistribuição semelhante no caso de pequenas moléculas e anticorpos, e por extrapolação, o mesmo seria esperado para vetores virais^15,16. No entanto, não foram encontrados na literatura exemplos comparando a entrega sistêmica de vetores de terapia gênica por TVI e injeção de seio retrobulbar. Em nossa opinião, as injeções de seios retrobulbares são mais fáceis de realizar em camundongos com fenótipo de crescimento diminuído e/ou letalidade precoce.

A TVI é frequentemente considerada mais análoga ao parto sistêmico em humanos, apesar de os humanos terem um seio retrobulbar, mas não terem cauda. Em um aspecto, a injeção do seio retrobulbar é como a administração sistêmica humana, pois o injetante entra no sistema venoso superior da mesma forma que se um injetante fosse administrado a um ser humano por um cateter central inserido perifericamente (PICC Line) ou um cateter intravenoso colocado no braço. Por outro lado, o injetante entra no sistema venoso inferior de um camundongo após a injeção na veia da cauda. Infelizmente, nenhum desses métodos replica exatamente o(s) método(s) usado(s) para entrega sistêmica em humanos, mas ambos são métodos eficazes de entrega sistêmica em camundongos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV8-CAG-eGFP	Univ. Penn. Vector Core	Special order	alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available
Barrier (Filter) Tips, 20 μL size	ThermoFisher	AM12645	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile)	ThermoFisher	AM12648	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Dual Prodedure Circuit	VetEquip	921400	alternative anesthesia method can be used
Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette	Gilson	F123600	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Gilsen PIPETTEMAN Classic  P100 pipette	Gilson	F123615	for diluting AAV to disire injection volume and concentration
Hand warmers (HOTHANDS)	ULINE	S-1497B	to keep mouse warm while anesthesized
Insulin syringes, 31 G,  8 mm length, 3/10 mL capacity	Becton Dickson	328438	used in video; one syringe per injection
Isoflurane (Fluriso)	VETONE	502017	alternative anesthesia can be used
Medline Protection Plus Disposable Underpads	ThermoFisher	23-666-062	to place mouse on durring injection
Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid	ThermoFisher	22-730-434	for needle disposal
Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4	Gibco	10010023	To dilute AAV to desired concencentration and volume
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile)	ThermoFisher	3451	for diluting AAV to disire injection volume and conentration
Sterile gauze sponge 4"x"4	Covidien	3033
Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)	Ocenanside Pharmaceuticals	AK102D5DS	local  anesthetic
Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller)	Any	N/A	alternative to insulin syringe used in video
VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System.	VetEquip	chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf	link to users guide and manual