DREAMインプラント:頭部固定マウスと自由行動マウスの慢性電気生理学のための軽量でモジュール式で費用対効果の高いインプラントシステム

要約

ここでは、使いやすさ、プローブの回収率、実験の汎用性、および行動との適合性が最適化された、げっ歯類の慢性電気生理学用の軽量で費用対効果の高いプローブインプラントシステムを紹介します。

要約

げっ歯類の慢性的な電気生理学的記録は、ニューロンのダイナミクスとその行動関連性についての理解を大幅に改善しました。しかし、プローブを慢性的に埋め込むための現在の方法では、コスト、使いやすさ、サイズ、適応性、および長期安定性の間に大きなトレードオフがあります。

このプロトコルは、現在利用可能なオプションに関連するトレードオフを克服するように設計された、DREAM(Dynamic、Recoverable、Economical、Adaptable、およびModular)と呼ばれるマウス用の新しい慢性プローブインプラントシステムを導入します。このシステムは、標準化されたハードウェア要素を組み合わせた、モジュール式で費用対効果の高いソリューションを提供し、簡単な手順で組み合わせて埋め込むことができ、プローブの回収と複数回の再利用のために安全に抽出できるため、実験コストを大幅に削減できます。

DREAMインプラントシステムは、3つのハードウェアモジュールを統合しています:(1)すべての標準シリコンプローブを運ぶことができるマイクロドライブにより、実験者は最大7mmの移動距離で記録深度を調整できます。(2)電気シールド、衝撃保護、およびコネクタ配置のための銅メッシュで覆われたウェアラブルファラデーケージの3次元(3D)プリント可能なオープンソース設計、および(3)動物福祉の向上と使いやすさのための小型化された頭部固定システム。対応する手術プロトコルは、速度(合計時間:2時間)、プローブの安全性、および動物福祉のために最適化されました。

インプラントは、動物の行動レパートリーへの影響が最小限に抑えられ、自由に動いたり頭を固定したりした状況で容易に適用でき、インプラント後の数週間のデータ収集において、明確に識別可能なスパイク波形と健康なニューロン反応を提供しました。感染症やその他の手術合併症は非常にまれでした。

このように、DREAMインプラントシステムは、マウスの慢性電気生理学のための汎用性と費用対効果の高いソリューションであり、動物の健康を向上させ、より倫理学的に健全な実験を可能にします。その設計により、さまざまな研究ニーズにわたる実験手順が簡素化され、げっ歯類の慢性電気生理学が幅広い研究ラボにアクセスできるようになります。

概要

慢性的に埋め込まれたシリコンプローブを用いた電気生理学は、その遺伝的および実験的^{扱いやすさから}、行動する動物、特にマウスの神経活動と接続性を調査するための強力な技術として浮上しています1。特に層状シリコンプローブは、皮質カラム^内の 機能的関係を同定し2^{、以前は不可能}だった方法で大規模なニューロン集団のダイナミクスを行動に関連付けるための非常に貴重なツールであることが証明されています3。

2つの補完的なアプローチは、in vivoで神経活動を記録するための現在のゴールドスタンダードです:2光子顕微鏡^4,5と細胞外電気生理学⁶。記録方法の選択は、取得できる読み出しの性質を制限します:二光子顕微鏡法は、経時的な大規模な集団における個々に識別可能なニューロンの縦断的研究に特に適していますが、高い機器コストに悩まされ、無傷の脳の皮質の表面層に限定されます。さらに、~30Hzの典型的な時間分解能は、進行中のニューロンダイナミクスを捕捉する能力を制限する^7,8。

対照的に、電気生理学的記録は、ニューロンの活動を刻一刻と追跡するための高い時間分解能(最大40kHz)を提供し、種間だけでなく皮質の深さ全体にも広く適用でき、2光子顕微鏡と比較して比較的低コストのセットアップを備えています。しかし、個々のニューロンの同定や、ニューロン集団の縦断的追跡は困難です。これは特に、四極管などのワイヤー電極や、急性電極の挿入に当てはまります。記録セッション⁹全体でニューロンを追跡する能力を欠くだけでなく、急性挿入を繰り返すと、免疫応答¹¹を開始する局所的な外傷¹⁰を引き起こし、感染や神経膠症の可能性を高める。これにより、最終的に、記録されたニューロン活動の安定性と実験動物の平均余命が減少し、急性電気生理学的記録を特徴とする縦断的研究の範囲がわずか数日に制限されます¹²。

慢性高密度シリコンプローブ記録は、急性電気生理学と2光子イメージングの優れた特性のいくつかを組み合わせることを目的としています。彼らは、2光子イメージングと比較して、個々のニューロンを識別する能力がわずかに低下するだけで、セッション間で神経集団のダイナミクスを追跡できます¹³。これらの記録は、記録された信号の空間配置と正確な時間分解能に高い柔軟性を提供するだけでなく、急性記録と比較して実験動物の寿命と健康状態を改善します¹⁴。さらに、急性記録とは対照的に、慢性電気生理学は単一の着床イベントのみを必要とし、感染および組織損傷のリスクを効果的に低減し、動物へのストレスを最小限に抑える¹⁵。これらの利点を総合すると、慢性電気生理学は神経系の組織と機能を調査するための強力なツールになります。

しかし、マウスに一般的に使用される慢性移植技術は、研究者が行動記録との適合性、インプラントの重量、インプラントの再現性、金銭的コスト、および全体的な使いやすさとの間に大きなトレードオフを強いることを余儀なくされています。多くのインプラントプロトコルは、プローブ¹⁶の再利用を容易にするように設計されておらず、個々の実験の実効コストを急激に上昇させ、したがって、一部の研究室が慢性的な電気生理学を使用することを財政的に困難にしている。また、社内で広範なプロトタイピングや設計作業が必要になることもよくありますが、そのための専門知識やリソースが存在しない可能性があります。

一方、統合インプラントシステム¹⁷ は、げっ歯類の慢性電気生理学に対してより広くアクセス可能な解決策を提供する。これらのシステムは、プローブを保持するマイクロドライブとインプラントの残りの部分を統合するように設計されており、インプラントの取り扱いと外科的処置を簡素化します。しかし、いったん埋め込まれると、このようなシステムはトップヘビーになり、実験者が異なるターゲット座標に柔軟に適応する実験者の能力を制限する可能性があります。多くの場合、その重量は小動物へのインプラントを妨げ、動物の動きを潜在的に損ない、ストレスを誘発します¹⁸。これは、体重制限がこれらのグループに影響を与える可能性が高いため、少年と女性のコホートに関する研究に不釣り合いに影響を与える可能性があります。

さらに、すべての統合システムが埋め込み後の電極位置の調整を可能にするわけではありません。これは、プローブの挿入¹⁹による神経膠症または瘢痕化、特に移植²⁰後の最初の48時間において、記録されたニューロン活動の質を低下させる可能性があるため、関連性がある。プローブの挿入深さを微調整することで、シグナルインテグリティに対するこれらの悪影響を制限できます。したがって、一般にマイクロドライブと呼ばれるマイクロポジショニングメカニズムは、電極の数が多く長さに分散しているプローブでも有益です。

このようなトレードオフを克服するために、軽量で費用対効果の高いモジュール式ソリューションを提供することで、従来の設計の限界に対処するマウス用の新しい慢性電気生理学インプラントシステムを導入します。DREAMインプラントシステムは、マウスの典型的な体重の10%(~2.1g)未満の重量で設計されており、動物福祉を確保し、行動への影響を最小限に抑えます。DREAMインプラント設計の検証では、頭蓋骨に負荷がかかるとげっ歯類で大きな影響を受ける可能性のある移動運動などの行動主要指標への影響が最小限に抑えられていることが示されています。これは、動物の健康状態を高め、より病理学的に健全な実験を可能にすることにより、自由に動く動物と頭に固定された動物を利用する実験パラダイムに利益をもたらすことができます。

このシステムには、最大7 mmの記録深度を柔軟に調整できるマイクロドライブが含まれており、さまざまなタイプのプローブや記録デバイスに適合させることができ、研究者にさまざまな実験アプリケーション向けの費用対効果の高い汎用性の高いツールを提供します。このシステムは、金属製のマイクロドライブ²¹と日常的に組み合わされており、他のシステムと比較して一貫したプローブの回復を提供し(予想される平均回復率:プローブごとに約3回の信頼性の高い再利用)、個々の実験のコストを大幅に削減する。

この設計は、3Dプリントされた保護ファラデーケージを備えており、電気生理学的ノイズ、機械的衝撃、感染性物質から安価でありながら堅牢な保護を可能にし、感染率を最小限に抑えながら安定したノイズフリーの録音を可能にします。この埋め込み型ケージは、衝撃保護のために設計されたいわゆる「クラウン」と、ファラデーケージの導電性金属メッシュコーティングの構造を提供するように設計されており、埋め込み型アンプやプローブコネクタのマウントとして機能するクラウンリングで構成されています ( 図1を参照)。

最後に、モジュラーインプラントシステムに含まれるヘッドプレートは、インプラントに余分なかさばりを追加することなく、斬新で効率的な頭部固定システムと互換性があるように設計されています。他の既存のシステムとは対照的に、インプラントの近くで小さなネジを締める必要がないため、実験装置でのマウスの固定が速くなり、実験者と動物の関係が改善され、行動の順守も改善されます。同時に、ヘッドプレートは、DREAM慢性電気生理学システムの他のモジュールを構築するためのベースとして使用されます。

DREAMインプラントの設計ファイルは、https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ でオープンソースハードウェアとして公開されています。次のセクションでは、DREAMインプラントシステムの設計と製造について説明し、マウスモデルでの成功例を実証し、既存のシステムと比較したその潜在的なアプリケーションと利点について説明します。

プロトコル

すべての実験手順は、マックス・プランク協会の制度ガイドラインに従って実施され、地方自治体の倫理委員会によって承認された(Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Project approval code: F149-2000)。

図1:インプラントの設計(A)シリコンプローブをプローブコネクタに接続されたマウスの頭蓋骨に重ね合わせたインプラントの3Dレンダリング。ヘッドプレートの中央開口部はスケールのために約10mmです。ドライブの高さは約17mmです。ファラデークラウンの外側を形成する銅メッシュ、およびアース/参照線は示されていません。(B)(A)と同じで、プローブコネクタの代わりにアンプボードに接続されています。(C)インプラントの分解された技術図面、そのコンポーネントを示しています。(D)マイクロドライブの下に埋め込むことができる角度付きスペーサーのレンダリングにより、事前定義された角度(ここでは20°)でマイクロドライブを一貫して埋め込むことができます。(E)統合された頭部固定メカニズムのレンダリング、ファラデークラウン付きの埋め込みヘッドプレート、周囲の頭部固定クランプ、およびセットアップへのダブテール接続を示しています。(F)インプラントの統合された頭部固定機構を使用してトレッドミルに頭を固定したマウスの画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

注:セクション1と2では、術前の準備について説明します

1. シリコンプローブの調製

1. プローブを再利用する場合は、プローブ供給業者の推奨に従ってシリコンプローブを清掃してください。プローブを酵素クリーナー( 材料の表を参照)に5〜10分間浸し、脱塩水ですすいでください。これは、摘出後できるだけ早く行ってください。(再)移植の前日に、プローブを70%エタノールに少なくとも30分間浸して消毒します。
2. チャンネルインピーダンスを測定して、記録された信号の仕様内にあることを確認します。Neuropixelsユーザーマニュアル²²のノイズレベルをテストするためのプロトコルに従い、目的の記録ソフトウェア(https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing など)を介してインピーダンスを測定し、シリコンプローブの製造元またはデータシートのターゲットチャネルインピーダンスに従います。インピーダンスが高すぎる場合は、電極サイト²³の再コーティングを検討してください。
3. 0.05インチのはんだテールソケット( 材料の表を参照)をプローブのアース(GND)ワイヤーにはんだ付けします。手術中にソケットをGNDピンに接続します(次のステップ)。
   メモ:このプロトコルでは、GNDとREFが使用するヘッドステージで短絡するため、個別のリファレンス(REF)ピンは使用されません。したがって、プロトコルの残りの部分では GND ピンのみについて説明します。別の REF を使用する場合は、REF ピンに対して次の手順を繰り返します。
4. GNDピンを準備するには、0.05インチのはんだテールソケット( 材料の表を参照)のピン側をGND 0.05インチのはんだテールソケットに繰り返し挿入します。金メッキのピンを使用すると、この平滑化ステップの必要性を減らすことができます。これにより、手術中にGNDピンとソケットを簡単に接続でき、過度の圧力をかける必要がなくなり、動物の怪我やプローブの損傷のリスクが軽減されます。
5. シリコンプローブ用の埋め込み型プリアンプを使用する場合は、サプライヤーの手順に従って慢性的な埋め込みに備えてください。次に、シリコン石膏を使用してファラデーケージのリングにリファイア/コネクタを接着し、リファイアを保持するように設計されたファラデーリングの領域にリファイア/コネクタを取り付けます( 図1を参照)。
   注意: サプライヤーの手順に従って、シリコンプローブ用の埋め込み型プレアンプを準備するには、湿気による電子機器の損傷を防ぐためにシリコンまたはエポキシでコーティングすること、およびアンプコネクタを繰り返し嵌合して、録音中にアンプを録音システムに接続する際の嵌合力を減らすことが含まれる場合があります。これは、Omneticsのユーザーにとって特に便利です。

2. マイクロドライブとヘッドギアの準備

1. マイクロドライブ本体のネジを回して、マイクロドライブシャトルがほぼ完全に上向きに引っ込められるようにします。
2. オプションで、シアノアクリレート接着剤または歯科用セメントを使用してマイクロドライブの底部に角度付きスペーサー( 図1Dを参照)を取り付けます。これにより、たとえば、中央溝内の領域の皮質層を介して記録する場合や、垂直でないアプローチが必要になる可能性のある深い構造内で記録する場合など、特定の程度の傾きを使用できます(角度付きスペーサーの場合、 資料の表を参照)。
3. マイクロドライブをマイクロドライブホルダーに水平に置きます(補足図1)。
4. マイクロドライブホルダーのヘッドステージコネクタが配置されるマイクロドライブからの距離に、小さな接着剤パテ( 材料の表を参照)を置きます。この距離は、シリコンプローブをヘッドステージコネクタに接続するフレックスケーブルの長さによって異なります。
5. シャトルにシリコン石膏の小さな滴( 材料の表を参照)を置きます。
6. シリコンプローブをパッケージから取り出し、鈍くて先端が柔らかい鉗子を使用します。これらは、標準的なニードルノーズ鉗子を直径3mmの熱収縮チューブでコーティングして作成します( 材料の表を参照)。フレックスケーブル付きのプローブを最初にマイクロドライブのシャトルに置き、フレックスケーブルの下端がマイクロドライブシャトルの下端にわずかにぶら下がるようにします。
7. フレックスケーブルの下端がマイクロドライブシャトルの下端に接するまで、フレックスケーブルをマイクロドライブの上部に向かってゆっくりと引っ張ります。この手順では、フレックスケーブルをマイクロドライブシャトルの左端に押し付けて、マイクロドライブの端に正確に垂直に配置されるようにしてください。この時点で、シリコンプローブのシャンクがマイクロドライブの下端から突き出ていない(または最小限にしか出ていない)ことを確認します(プローブシャンクの正確な長さとターゲットの脳領域の深さによって異なります)。
8. プローブのヘッドステージコネクタをホルダー上部の接着剤パテに配置して、プローブが脱落するのを防ぎます。
9. 27 Gシリンジ針を使用して、フレックスケーブルとシャトルの間にシアノアクリレート接着剤( 材料表を参照)を少量塗布し、プローブを所定の位置に固定します。接着剤がマイクロドライブに流れたり、シャトルを超えてフレックスケーブルに沿って流れたりしないことを確認します(これは非常に重要です)
10. フレックスケーブルが所定の位置に接着されたら、シリコン絆創膏を使用してアンプをクラウンリング( 材料の表を参照)に取り付けます。次に、フレックスケーブルを取り付けます amplifier接続とケーブルをシリコンプラスターの薄い層で覆います。
11. 5分後、石膏がセットされたら、マイクロドライブとプローブを次の使用まで安全に保管します。
12. 銅メッシュの断片( 材料の表を参照)を開いたドーナツ形状にカットします( 補足図2のカットパターンを参照)ファラデーケージを覆います。
13. 銅メッシュの切り欠きをエポキシ樹脂の小滴でファラデーケージに固定します( 材料の表を参照)。このステップでは、エポキシを歯科用セメントに置き換えることもできます。
    注意: ファラデーケージには、プローブコネクタまたはアンプを収納するスペースがあります。このスペースは、デザインファイルではXでマークされており、アンプ/コネクターのサポートベースと、ケージの隣接する2つのスポーク間の距離が広くなっています。周囲に十分なスペースを作るために amplifier/コネクタは、隣接する2つのスポークの間に少量の余分なメッシュを固定し、突起を作成します。これにより、アンプ/コネクタを後でファラデーケージに触れることなく、この「ポケット」に配置できます。反りを抑えてしっかりと密着させるには、リューズに直接置いたリューズリングを使用して形状を保ち、リューズの細いスポークを支えます。さらに、はんだ付けの助けの手を使用して、乾燥中にクラウンとメッシュを固定します。施術中にクラウンの形状を維持するのが難しい場合は、反りを防ぐために一度に2つだけクラウンアームをエポキシ化してみてください。
14. ファラデーケージの個別の接地が必要な場合は、小さなヘッダーピンを30 mmの接地線( 材料の表を参照)にはんだ付けし、導電性エポキシを使用してワイヤを銅メッシュの切り欠きに接着します。
    注:この手順はラボでは遵守されていません。
15. この時点で、準備したパーツは安全に保管し、後から手術を行います。
    注:セクション3〜6では、マイクロドライブとヘッドギアの埋め込みについて説明します。

3.手術:プローブとワークスペースの準備

1. 手術器具を滅菌し、承認された手順に従って手術室に設置します。
   注:これには、ビーズ滅菌器の使用、オートクレーブ器具の使用、または承認された実験プロトコルに応じて、30%過酸化物または90%エタノールですすいでいることが含まれます。
2. 歯科用セメントキットの指示に従って、歯科用セメントの準備に使用したセラミック皿をアイスボックス、冷蔵庫、または冷凍庫に入れます( 材料の表を参照)。セメントの混合中に冷却したセラミック皿を使用して、セメントが可鍛性になる時間を増やします。より長いセメンチングステップが必要な場合は、常に冷却した皿を使用してください。
3. 実験終了時のプローブ配置の組織学的検証が必要な場合は、手術の直前にマイクロドライブのネジを反時計回りに回してシリコンプローブを伸ばし、プローブを少量の染料に浸して親油性染料( 材料の表を参照)をプローブに塗布します。市販のジメチルスルホキシド(DMSO)またはエタノール(EtOH)で希釈したストック溶液( 材料の表を参照)から親油性染料を調製し、PBSなどの適切な緩衝液で1〜5μMの濃度で希釈します。

4.手術:動物の準備

1. 承認された麻酔プロトコルに従って、無菌条件下での2〜4時間のげっ歯類手術を行います。これには、全身麻酔および局所麻酔、鎮痛、眼軟膏の塗布、生理食塩水の注射が含まれます。ここでは、注射麻酔(ケタミン100[mg / kg]/メデトミジン0.5[mg / kg])を局所鎮痛クリームと眼軟膏( 材料の表を参照)と一緒に使用し、動物を温熱パッドの上に置いて体温を調節します。
2. 動物が完全に麻酔されたら、別の非滅菌シェービングエリアに移動します。
   1. 動物が十分に温められていることを確認してください。たとえば、加熱パッドの上に置きます。頭蓋骨上部の毛を取り除きます。これを行うには、電気シェーバーまたは脱毛クリーム( 材料の表を参照)を使用するか、70%エタノールで覆われたメスで頭のてっぺんを繰り返し剃ります。
   2. 抜け毛は慎重に取り除き、後で露出した組織に接触しないようにします。毛を取り除くには、例えば、70%エタノールで濡らしたティッシュやスクイーズボールポンプなどを使用します。脱毛クリームを使用する場合は、綿棒と生理食塩水を使用してこれを十分に取り除いてください。
3. 剃った部分をヨウ素ベースの消毒剤( 材料の表を参照)と綿棒を使用したアルコールで複数回消毒し、頭の中心から側面に移動して、切開部位から残っている抜け毛をブラッシングします。
4. ベタジンを使用して頭の上と周りの毛皮を消毒します。これにより、無菌の作業領域が確保され、手術器具や材料が未滅菌の毛皮と接触するのを防ぎます。
5. イヤーバーとノーズホルダーを使用して動物を定位フレームに置きます( 材料の表を参照)。
6. 小さな手術用ハサミ( 材料の表を参照)を使用して、頭蓋骨の上の皮膚にアーモンド型の開口部を切り取り、ラムダ縫合糸のすぐ後部から目の間まで到達します。
7. 濡れたまま皮下膜と骨膜を切り取って除去し、メスの刃で頭蓋骨を引っ掻いて、歯科用セメントの接着を妨げる可能性のある頭蓋骨表面の軟膜組織を取り除きます。
8. オプション:頭蓋骨から膜組織を取り除いたら、0.5%過酸化物の薄層を短時間塗布し、水性ヨウ素消毒剤(ベタジンなど)で洗い流してから、頭蓋骨の表面を粗くして、頭蓋骨へのプライマーの接着性を向上させます。
9. メスの先端を逆さまにして十字形の模様を引っ掻くなど、頭蓋骨の表面を丁寧に粗くします。これにより、歯科用セメントが後で頭蓋骨に付着するのに役立ちます。
   注:縫合糸の上部を強く引っ掻きすぎると、縫合糸が破裂して頭蓋内液が漏れ、歯科用セメントの接着が損なわれる可能性があります。
10. メスの刃と滅菌綿棒を交互に使用して、ラムダ縫合糸の側面に取り付けられた首の筋肉を優しく引っ掻いたり押したりして、筋肉が小脳の上の頭蓋骨の「端」に押し戻されるまで押し戻します。これにより、ニューロンの記録における筋肉のノイズを最小限に抑えることができます。
11. 1 mLのシリンジに27 Gの針( 材料の表を参照)に少量の外科用シアノアクリレート接着剤( 材料の表を参照)を入れます。.次に、注射器を使用して皮膚を頭蓋骨の端に接着し、瞬間接着剤の小さな滴を塗ります。組織を頭蓋骨にできるだけ平らに接着して、インプラント用のスペースを確保します。この手順により、皮膚や筋肉がインプラントの一部に直接接触することがなくなり、録音中の筋肉のノイズが回避され、歯科用セメントの接着性が向上します。
12. 頭蓋骨全体にデンタルセメントプライマーを塗布して接着力を高め、UV光で硬化させます( 材料の表を参照)。これにより、歯科用セメントの接着性が向上し、頭蓋縫合糸が漏れて時間の経過とともに頭蓋セメントの結合が弱くなるのを防ぎます。
13. ブレグマまたはラムダに対するプローブの埋め込みの目標位置を見つけ、その周囲の開頭術の輪郭を外科マーカーで概説します。ヘッドプレートを頭蓋骨に配置して、開頭術が頭蓋骨の内側にくるようにし、開頭術の片側にマイクロドライブ用のスペースを確保し、1〜2本の接地ピンを取り付けます。
14. デンタルセメントを使用してヘッドプレートを埋め込みます。指定された冷却されたセラミック皿で歯科用セメントを混合します(手順3.2を参照)。ヘッドプレートがすべての側面で頭蓋骨に付着し、水密の「井戸」を形成していることを確認します。
15. 歯科用ドリル(サイズUS 1/2 HP)を使用して、ステップ1.4で準備したヘッダーピンの幅に小さなバリ穴をGND/REFとして使用する脳領域にドリルで穴を開けます。ファラデーケージを接地したい場合は、ファラデーケージの端近くに別の小さなバリ穴を開けて、ファラデー-GNDヘッダーピン用に穴を開けます。
    注意: GND/REFヘッダーピンの場合、開頭術をケージの端から十分な距離に置いて、ヘッダーピン自体を後でファラデーケージに触れずにケージ内に配置できるようにします。
16. 開頭術をシリンジで滅菌生理食塩水を優しく滴下し、脱落しないワイプで取り除いて、開頭術を清掃します( 材料の表を参照)。すべての血液とゆるい組織が除去されるまで繰り返します。
17. 生理食塩水に0.7%寒天溶液( 材料の表を参照)を調製し、わずかに冷却し、1mLシリンジに27Gの針を使用して開頭術に導入します。
18. GNDピン(手順1.3を参照)を、前の手順でドリルで開けた各開頭術にそっと挿入します。ピンは、すべての側面が寒天で囲まれます(ステップ4.17を参照)。ヘッダーピンの周囲にセメントを塗布して固定し、電気的絶縁を提供します。
19. セラミック皿を掃除し、冷蔵庫/冷凍庫に戻します。
20. 歯科用ドリルを使用して、より大きな開頭術(円形または正方形)の輪郭を、安定した動きで端を動かしてドリルで開けます。開頭術が1 mm x 1 mmから2 mm x 2 mmであることを確認して、プローブの配置を微調整して、皮質を露出しすぎずに血管を回避できるようにします。可能であれば、縫合糸の上に開頭術を置かないでください。20〜30秒のラウンドでドリルし、ドリルラウンドの合間に生理食塩水で頭蓋骨を冷やします。
    注:穴あけを開始するときは、マイクロドライブの先端をマーカーでマークすると便利です。これにより、穴あけ時にマイクロドライブの先端と平行に直線エッジを形成できます。これにより、マイクロドライブを所定の位置に固定する際に開頭術でセメントが付着するのを防ぐだけでなく、接着性が向上し、マイクロドライブが開頭術にオーバーハングするのを防ぎ、マイクロドライブを最終的な記録部位の位置に対して配置する際の横方向の操作性が向上します。
21. 最初のドリルを数回行った後、細い鉗子(サイズ5以上、 材料の表を参照)で骨のドリルアウト部分をそっと押して、骨の穴あけ部分の抵抗をテストします。
    1. 押されたときに骨が鉗子の下で「跳ね返る」ようになるまで、穴あけラウンドの合間にテストを続けます。このような場合は、開頭術の上に生理食塩水を一滴垂らして骨を柔らかくし、鉗子を使用してドリルで穴を開けた骨片をそっと取り除きます。
    2. 骨を優しく取り除くことができない場合は、骨がまだ強く付着しているポイントに焦点を当てて、もう一度穴を開けます。一般に、頭蓋骨を完全に穴を開ける前に、鉗子から穏やかな圧力で頭蓋骨を取り除くことを目指します。
       注:硬膜の表面が定期的に湿っていることを確認してください、温度を下げるための穴あけ中と骨皮弁の除去後の両方で。これにより、硬膜が乾燥して浸透しにくくなるのを防ぎ、プローブの挿入が容易になる可能性が高まります。硬膜が硬すぎて貫通できないことが判明した場合、または鈍器プローブまたはマルチシャンクプローブが使用されている場合は、27G針で硬膜を持ち上げ、生理食塩水浸漬下で小さな切開を行うことにより硬膜切開術が行われ、硬膜が脳表面に付着するのを防ぎます。
22. 硬膜と脳を保護するために、冷たく滅菌された生理食塩水に浸した止血スポンジ( 材料の表を参照)で開頭術を覆います。

5.手術:プローブ埋め込み

1. カスタムマイクロドライブホルダー( 材料の表を参照)を定位装置のアームに取り付けます。プローブの準備後にマイクロドライブをマイクロドライブホルダーから取り外した場合は、シリコンプローブが取り付けられたマイクロドライブをマイクロドライブホルダーに入れます。必要に応じてステレオタックスアームを傾けて、目的のターゲット脳領域に到達します。アンプが取り付けられたクラウンリングを、マイクロドライブホルダーの背面にある3本の垂直ピンに配置します( 補足図1を参照)。
2. マイクロドライブを開頭術から~0.5 mm以内に下げてから、鉗子を使用してプローブに取り付けられたGND/REFヘッダーピンを頭蓋骨に埋め込まれた対応するGND/REFピンに接続します(手順4.14-4.15を参照)。ドライブ、開頭術、および GND/REF ピンの配置の例については、 補足図 3 と 補足図 4 を参照してください。
3. 所定の位置に設置したら、オプションでピンを導電性銀エポキシの滴で固定します( 材料の表を参照)より堅牢に接続します。銀エポキシが硬化したら、接続されたピンを少量の歯科用セメントで覆い( 材料の表を参照)、接続が長期間にわたって安定し、周囲の組織やインプラント要素と電気的に接続されていないことを確認します。
4. 止血スポンジを開頭術から取り外します(手順4.22を参照)。
5. 定位アームをマイクロドライブで開頭術の上に置きます。
   注意: プローブが引っ込められている場合は、プローブが大きな血管を含まない開頭術の部分に接地するようにマイクロドライブが配置されていることを確認してください。
6. 必要に応じて、プローブシャンクがターゲット領域の硬膜または脳の表面(ステップ4.21を参照)に触れるまで位置と角度を調整して、マイクロドライブを下げます。
7. 指定されたセラミック皿(ステップ3.2を参照)で歯科用セメントを混合し、電極に面していないマイクロドライブベースの3つの側面に焦点を当てて、マイクロドライブのベースを所定の位置にセメントで固定します。セメントが取り外し可能な「ベース」の上のマイクロドライブに触れないようにしてください( 図1Dを参照)。
   1. ベースと頭蓋骨の間のスペースが歯科用セメントで完全に覆われていることを確認してください。セラミック皿を掃除し、冷蔵庫/冷凍庫に戻します。セメントが硬化するのを約10〜15分待ちます。
      注:マイクロドライブベースと頭蓋骨の間には小さな隙間が残されており、セメントは最も流動的な形で埋められています。セメントがわずかに厚くなると、マイクロドライブベースの壁と頭蓋骨の間のセメントが蓄積されます。物質の流れは予測不可能であり、望ましくない領域に大量のセメントが流れ込む可能性があるため、常に非常に少量のセメントが使用されます。生理食塩水に浸した少量の止血スポンジを使用して、開頭術の一部を覆うことができます。セメントが誤って開頭術に流れ込んだ場合は、フィルム状の粘稠度に入ったら、鉗子でセメントを取り除きます。
8. シリコンプローブを脳に下ろし、顕微鏡でプローブの位置を注意深く監視します。プローブのシャンクが脳に触れたら、プローブを~250μm(ネジを1回転させると282μm)すばやく下げて、プローブが硬膜/皮質表面の抵抗を突破することを確認します。
   1. これを視覚的に確認します。プローブが皮質に侵入していない場合は、5分間待ってから、硬膜/皮質がプローブ先端から張力を受けている間にプローブを数十マイクロメートルずつ繰り返し上下させることにより、シャンク先端で硬膜をエッチングしようとします。
9. プローブが皮質の表面を突き破ったら、ターゲット座標に到達するか、プローブが1000μm以上移動するまで、ゆっくりとしたペース(100〜200μm/分)で徐々に下げます。ターゲットがプローブを1000μm以上移動する必要がある場合は、ターゲット座標に到達するまで、次の記録セッションで最大1000μm /セッションのステップでプローブを進めます。
   注:シリコンプローブを下げながらニューロン信号をモニタリングすることが望ましい場合は、この手順をスキップしてください。この手順については、セクション 7 で説明します。
10. 指示に従ってシリコーンエラストマーを調製し( 材料の表を参照)、1mLのシリンジを使用して開頭術に少量の滴を分注します( 材料の表を参照)。
11. 乾いたら、シリコンエラストマーをボーンワックスとミネラルオイルの50/50混合物で覆います。このステップにより、プローブがさらに保護され、開頭術上の破片や乾燥血漿の蓄積が防止され、抽出がより簡単かつ安全になります。プローブを下げた状態でプローブの周りで作業すると、破損する可能性があるため、注意してください。

6.手術:ファラデーケージの埋め込み

1. 歯科用セメントが完全に固まったら、六角レンチでドライブを固定している横方向のネジを緩めて、マイクロドライブホルダーを緩めます( 補足図1を参照)。マイクロドライブが自立するように、ホルダーを~1cmゆっくりと引っ込めますが、プローブアンプ/コネクタはフレックスケーブルを伸ばさずにインプラントホルダーに固定されたままになります。
2. 既製のクラウンとファラデーメッシュをヘッドプレートの周りに配置するには、開口部でケージを伸ばし、マイクロドライブとフレックスケーブルに水平にスロットしてから、デンタルセメントでヘッドプレートに固定します。
   注意: インプラントを汚染から保護するために、ファラデーケージと頭蓋骨の間のすべてのスペースを歯科用セメントで閉じてください。
3. プローブコネクタ/ヘッドステージ付きのファラデークラウンリング( 材料の表を参照)をクラウンの上に置き、プローブアンプ/コネクタの一体型ホルダーをファラデークラウンのインデントされた「X」でマークされた領域に合わせます(手順2.13を参照)。
4. 各スポークリング接合部にシアノアクリレート接着剤または歯科用セメントを少量垂らして、リングをファラデーケージに固定します。
5. プローブアンプ/コネクタが統合されたファラデーリングが所定の位置に固定されたら、マイクロドライブホルダーで定位アームを完全に引っ込めます。これらのコンポーネントの組み立てに関するステップバイステップのガイドについては、 補足図3 を参照してください。

7. 術後検査記録

1. プローブを接続します amplifier/コネクタを録音ハードウェアに取り付けて、録音を開始します。
2. 最初の挿入時にプローブがまだ目標位置に達していない場合(ステップ5.9を参照)、ニューロン信号を監視しながら、マイクロドライブのネジをゆっくりと反時計回りに回してプローブを下げます。
   注:信号は、a)電極が開頭術の上のシリコーンエラストマーの層に触れたとき、およびb)電極が脳に移動し始めたときに変化する必要があります(ステップ7.2を参照)。高周波のニューロン活動は、脳に完全に挿入された電極によって記録されますが、脳表面のCSFと接触している電極は、通常、スパイク活動(EEGトレースに類似)のないローパスフィルタリングされたニューロン集団信号を示し、空気中の記録部位は電気ノイズの増加を記録します。テスト記録後に個々のチャンネルのインピーダンスを測定することにより、プローブの挿入深さを追加で確認することが可能です。空気と接触するチャネルは、高インピーダンス(開回路を示す)と、CSFに接触しているチャネルまたはすでに脳内にあるチャネルに対して手術前に測定されたインピーダンスのようなインピーダンスを示す必要があります。シリコンプローブをセッションごとに最大合計距離約1000μm、最大速度約75μm / minで進めます(手順5.5を参照)。
3. プローブ全体に神経局所電位が見える場合、および/またはプローブが最大1000μm進んだ場合は、テスト記録を終了し、ヘッドステージコネクタを外します。

8. リカバリー

1. ファラデーケージを自己接着性の獣医用ラップで覆います( 材料の表を参照)。
2. 麻酔を終了し、承認された実験ガイドラインに従って数日間動物を回復させます。
3. シリコンプローブの電極がまだ目的の位置にない場合は、マイクロドライブのネジを小さなステップで回し、セッションごとに最大4回転(または~1000μm)します。必要に応じて、目標に達するまでこの手順を数日間繰り返します。プローブの動きと同時記録を組み合わせて、横方向の領域の電気生理学的活動を評価することをお勧めします。

9. 行動実験と慢性的な記録

1. タスクパフォーマンス中の慢性的な頭部固定記録の場合は、手動でクランプを開き、埋め込まれたヘッドプレートをクランプすることにより、ファラデーケージの基部にあるヘッドプレートを頭部固定クランプに取り付けます( 図1C、E、Fを参照)。
   注:頭部固定が不要な場合、このインプラントシステムは自由に動く録音にも使用できます。録音を自由に移動する場合は、手順9.1と9.7をスキップします。
2. インプラントから自己接着性の獣医用ラップをはがします。
   注:動物の不快感を最小限に抑えるために、実験者がインプラントで作業している間、気晴らしとしてこのステップの前にシンプルでやりがいのある行動タスクを開始することをお勧めします。
3. アンプ/コネクタを録音機器に取り付けます。
4. 動物がタスクを実行するときにニューロンの記録を行います。
   注:記録される細胞外ユニットの数を最大化することが目標である場合は、ある場所での神経収量が減少するたびにシャトルを数十マイクロメートル動かします。プローブを動かした後、信号が安定するまでに数分から数時間かかる場合があることに注意してください。したがって、セッションの終了時にプローブを移動して、次のセッションの開始まで信号が回復できるようにすると便利な場合があります。
5. 記録装置を取り外し、行動記録の最後に新しい獣医用ラップでインプラントを覆います。
6. 頭部固定クランプを開いて、動物を頭部固定から外します。

10. プローブの回復

1. 最終録音の最後に、ネジを時計回りに回して、シリコンプローブをマイクロドライブにできるだけ引っ込めます。これは、動物が頭を固定して行動しているとき、または手術のセットアップで動物を麻酔した状態で行います。ニューロン信号を同時に監視し、脳に浸されている、脳表面に触れている、または空気と接触している電極のシグネチャを確認することにより、脳からのプローブの出口をグラフ化します(ステップ7.3を参照)。
   注:組織学のプロトコルとプローブに応じて、プローブを引っ込める前に電解病変を行い、プローブ上の一部の電極の正確な位置を決定します。ニューロン記録によるプローブ出口のモニタリングが必要ない場合は、動物が終了した後にプローブを引っ込めることも可能です。
2. 承認されたガイドラインに従って動物を終了します(これには、その後の組織学のために脳を固定することが計画されている場合、動物を灌流することが含まれます)。
3. 動物が死んでから~10分待ちます。次に、ステレオタックスで動物を頭部固定し、外植片中に動物の頭部が動かないようにして、プローブの破損を防ぎます。
4. 開頭術の上に生理食塩水を一滴垂らし、数分間浸してプローブシャンクの乾燥した生体組織を柔らかくし、シャンクの破損の可能性を減らします。
5. 定位固定ホルダーをマイクロドライブの約0.5cm上に置きます。次に、ファラデーケージのスポークの上端を小さな手術用ハサミで切断します( 材料の表を参照)ファラデーリングを固定しています amplifier/コネクタを保持しているファラデーリングを解放し、リングを定位ホルダーの上部にある垂直ピンに戻します(ステップ5.1および 補足図1を参照)。
6. ファラデークラウンのスポーク間のメッシュのU字型の領域を切り取ることにより、同じ手術用ハサミで銅メッシュを慎重に切り取ります。次に、リューズのプラスチック製スポークをベースで切り取ります。
   注意: 印刷されたプラスチックスポークは、折れてプラスチックの破片がプローブに向かって飛んでくる可能性があるため、カットするときに曲げないでください。
7. ホルダーの横ネジを使用してマイクロドライブをホルダーに固定できるようになるまで定位ホルダーを下げ、マイクロドライブを固定してから、マイクロドライブ本体をマイクロドライブベースに接続しているT1ネジを緩めます。
8. インプラントホルダーで定位アームをゆっくりと引っ込めて、マイクロドライブをベースから持ち上げます。マイクロドライブがベースから垂直な角度(つまり、ベースから「垂直」)に離れていることを確認します。
   注意: マイクロドライブ本体とベースが簡単に分離しない場合は、定位アームの動きがマイクロドライブの向きに比べて斜めになっていないことを確認してください。必要に応じて、動物の頭の固定をわずかに緩め、それに応じて再配置することにより、ホルダーとマイクロドライブを互いに再配置します。正しい位置合わせは、マイクロドライブを簡単に回復するための重要な側面の1つです。また、マイクロドライブとマイクロドライブベースを接続している歯科用セメントが残っていないか確認してください(手順5.5を参照)。その場合、セメントの量に応じて、メスや歯科用ドリルでセメントを慎重に削り取ります。
9. 付属のプローブで定位アームを持ち上げ、その下に十分なスペースを作ります。
10. 動物を定位固定から取り出し、必要に応じて承認された組織学プロトコルに従って脳を準備します。埋め込まれたマイクロドライブベースを回復し、後で再利用するためにアセトンに数時間浸して清掃します。
11. 清潔なマイクロドライブベースを接着パテ( 材料の表を参照)に置き、マイクロドライブをベースに下ろしてネジを締めます。破損を防ぐために、プロセス全体を通して顕微鏡でプローブの位置を監視します。この手順は、埋め込み型マイクロドライブベースを最初に再利用するためにクリーニングする必要がある場合は、後で完了できます。
    注:このプロトコルでは、ベースのプラットフォームとして接着剤パテを使用することが求められており、ベースを固定すると同時にある程度のギブを持ち、ベースが滑ってプローブと衝突しないようにするために重要です。パテは、プローブが下降するマイクロドライブベースの側面で垂直の「崖面」に形作られている必要があります。これにより、プローブがベースを超えて下がった場合でも、プローブが下のパテに接触しないようにします。パテの「タワー」は、マイクロドライブのベースを超えて下げると、プローブがパテが置かれているテーブル面に接触しないように、十分な高さにする必要があります。最後に、パテが滑ったり落ちたりしないように、パテを表面にしっかりと固定します。パテで保持されているマイクロドライブベースにマイクロドライブを下げるときは、プローブが下がるときにプローブがベースまたはパテに衝突しないように、顕微鏡からの側面図を確認して進行状況を監視します。
12. 製造元の指示に従ってプローブを洗浄および滅菌します。最も一般的に入手可能なプローブについては、酵素クリーナー( 材料の表を参照)に12時間浸した後、脱塩水ですすぎ、アルコールで消毒します。これを行うには、プローブを酵素クリーナーが入った大きなビーカーに下げ、定位アームのマイクロドライブホルダーに取り付けたままにします。
    注意: 必要に応じて、クリーニング後にプローブ上の電極のインピーダンスを測定して、個々の電極の電位劣化を監視します。
13. クリーニングしたプローブを入れたマイクロドライブは、次の実験まで安全に保管してください。

結果

このプロトコルは、研究者が行動するマウスに軽量で費用対効果が高く、安全な慢性電気生理学記録を実装できるようにする慢性移植システムを示しています(図1)。このアプローチの適用が成功するかどうかを決定する主な要因には、頭蓋骨の完全なセメント被覆、低侵襲で適切に保護された開頭術、マイクロドライブと配線の頭蓋骨への安全な取り付け、および保護ファラデー材料の完全な連続性が含まれます。これらのポイントを考慮すると、高品質の録音に一貫して到達できます。ここでは、手術の成功の次の主要な側面に関連する代表的な結果を示します。

1) インプラントは動物の行動や健康を妨げていますか?
2) 信号品質は高く、長期間にわたって信号を維持できるか?
3) 録画をタスクのパフォーマンスと簡単に組み合わせることはできますか?

インプラントが動物の行動に与える影響を評価するために、移植された5匹の動物の追跡された移動パターンを分析しました。 図2A は、移植の10分前と移植後1週間、プレイケージ内を自由に移動する動物の例を示しています。動きのパターンが変わらないことがわかります。この観察結果は、動物間の移動速度と頭の方向の分布を示す 図2B、C によって確認されています。着床前と移植後では、走行速度と頭の向きはほとんど変わらず、どちらかといえば、手術後に走行速度がわずかに上昇したように見えました。 補足ビデオ1 は、着床手術の6日後の動物の短いビデオ録画を示しています。移動、グルーミング、飼育、家庭環境での採餌などの典型的なホームケージの行動はすべて目に見え、手術からの回復が成功し、一般的な健康状態を示しています。インプラントの行動への影響が少ないのは、その軽量性と扱いやすい高さによるものと思われます。

図2:手術前後の移動運動 (A)移植前(左パネル)と移植後(右パネル)の動物の移動例。x / y座標はセンチメートルで、ポイントは10分間の各時点における動物の位置を示します(B)5匹の動物に移植前の5セッションと移植後の3セッションの移動速度の分布(cm / s)。(C) (B) で分析したのと同じセッションについて、異なる方向への移動の確率のカーネル密度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

次に、ローカル電界電位(LFP)の信号品質と、記録サイト間のスパイク活動を評価します。ここでは、一次視覚野(V1)の皮質記録からの代表的なデータを示します。検証のために、Kilosort 3を使用して、覚起しているマウスのV1に記録された広帯域ニューロン信号から推定される単一ユニット活性を抽出しました( 図3を参照)。 図3A はプローブシャンク上で抽出された単一ユニットの位置を示し、 図3B は対応するスパイク波形を示し、 図3C は電流源密度(CSD)プロトコルに対する同じニューロンのスパイク応答を示しています。このパラダイムでは、広視野フラッシュを1Hzの周波数で300msの持続時間(すなわち、300msオン、700msオフ)で200回にわたって提示しました。最後に、 図3D は、灰色の背景にランダムに選択された黒と白の正方形の2000フレームで構成され、それぞれが16.6ミリ秒にわたって提示された、視覚的受容フィールドマッピングプロトコルに対する同じユニットの応答を示しています。正方形はそれぞれ12度の視角をカバーし、マッピングパラダイムが合計で-90〜+90度の方位角と-30〜+40度の仰角の視覚空間をカバーするように、15 x 5の可能な位置のフィールドから選択されました。各刺激フレームに対する発火率応答は、40〜140ミリ秒の遅延を条件とする16.6msのウィンドウ全体の最大発火率を分析することによって抽出され、各ウィンドウの最大活性に基づいてチャネルごとに最適であると特定されました。このタイプの記録は、各電極の挿入深さの調整をガイドし、インプラント手術後の信号品質を評価するために使用できます。

図3:記録されたニューロン信号。 (A)プローブの電極接点に沿ったKilosort 3スパイクソーティングパッケージによってソートされた単一ユニットの推定位置。(B)Aに示されているのと同じ単位の5msの時間にわたるスパイク波形。細い線:個々のスパイク波形。太い線:平均スパイク波形。(C)電流源密度(CSD)パラダイムに応答したスパイクのラスタープロットで、300ミリ秒の広視野フラッシュとそれに続く700ミリ秒のブラックスクリーンが表示されます。回答は、AおよびBと同じ単位で表示されます。重ね合わされた色付きの線は、同じ応答の刺激周囲時間ヒストグラム(PSTH)を表します。PSTHの発火率は10msビンで計算され、PSTH全体の最大発火率で正規化されました。時間 0 は、広視野フラッシュ刺激を中心としています。(D)スパースノイズ受容フィールドマッピングパラダイムによって測定された、ACと同じユニットの推定受容フィールド。各プロットは、白と黒の四角形の刺激の開始(左パネル)またはオフセット(右パネル)に応答した、16.6msの分析ウィンドウにわたる平均発火率アクティビティを示しています。刺激は、水平方向に180度、垂直方向に70度の視角にまたがる5×15の正方形のグリッド全体にランダムに配置され、16.6ミリ秒の持続時間で提示されました。発火率活動は、受容野グリッド全体にわたってzスコア化されました(カラーバーを参照)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

録音品質は、数週間から数か月にわたって繰り返し録音しても高いままでした。図4Aは、15週間にわたる1匹の動物の縦断的LFP記録を示しています。LFPは、上記のCSDパラダイムに対応して記録されました(図3A-Cを参照)。図 4A は、フラッシュ開始から 500 ミリ秒後の平均 LFP 応答を示しています。この例では、電極間距離が25μmの32チャンネルのリニアプローブを使用しました。18日目に、プローブの深さを調整し、プローブを600μm下方に移動させたことに注意してください。この調整の前後でも、LFP信号は録音日間で安定していました。

これと一致して、推定される単一ユニットのスパイク波形は、多くの録音で識別できました。 図4B は、1か月にわたる3つの録音セッションからの代表的なスパイク波形の例を示しており、1つのユニットのアクティビティが時間の経過とともに正常に識別できることを示しています。 図4C は、最大100日間のウィンドウにわたる6匹の動物の慢性記録から抽出された推定される単一ユニットの総数を示しています。単一単位は、キロソート 3.0 のデフォルト基準に従って定義されました ( 補足表 1 を参照)。ご覧のとおり、明確に定義された単一ユニットの数は、通常、着床後1週間で~40に達し、その後徐々に減少し、~20ユニットの明らかに安定した漸近線に向かって移動しました。これらの記録が線形32チャンネルプローブを使用して行われたことを考えると、これは、注入直後の電極あたり約1.25単一ユニットの期待収率に相当し、長期記録では電極あたり約0.65単一単位に減少します。アンプ/コネクタを保持するファラデークラウンは、標準コネクタに必要な最大嵌合力よりも桁違いに大きい10ニュートンを超える繰り返しの力に耐えることができるため、セッション中にインプラントのアンプ/コネクタに繰り返し接続しても、録音品質やインプラントの安定性に影響を与えるようには見えませんでした( 補足ビデオ2を参照)。

図4:ニューロン記録の経時的な安定性。 (A)移植後3〜110日で慢性的に移植されたプローブの32チャネルすべてで示された、広視野フラッシュCSD刺激に応答した平均LFP活性。赤い縦線は、手術後18日目までに脳の外部からチャンネル0〜8が記録されるため、プローブが新しい位置に下げられていることを示しています。(B)同じ慢性インプラントからの3つの例のユニットのスパイク波形を4週間にわたって繰り返し記録した。細い線:個々のスパイク波形。太い重ね線:平均スパイク波形。(C)6匹の動物の記録日間でKilosort 3によって検出された推定単一ユニットの数(挿入図の凡例を参照)。赤い四角は、プローブが移動した日を示しています。点線は、これらの記録で使用されたインプラントあたりの電極の数を示しています(32)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

最後に、マイクロドライブ、ウェアラブルファラデーケージ、インプラントベースと頭部固定用デバイスを兼ねるヘッドプレートを含むモジュラーシステムを提供することにより、このプロトコルは、慢性電気生理学と頭部固定行動の統合を可能にします。ここでは、球状トレッドミルで仮想環境を横断するマウスのデータ例を示します。 図5A は、例の試行における20ユニットのランニング関連のスパイク活動を示しています。 図5B は、個々のスパイクソートユニットの走行速度とスパイク活動との間の多様だが頑健な関係を示しており、 図5Cの同じ効果の集団平均を示しており、げっ歯類V1²⁴のニューロン活動に対する自発運動活動の十分に確立された効果を確認しています。

図5:頭部固定行動中のニューロン反応 (A)例の試行における単一ユニットの反応のラスタープロットで、走行速度(紫色の線)とすべての単一ユニットの平均発火率(水色の線)を重ね合わせたもの。(B)異なる走行速度カテゴリーでの単一ユニットの活動、6つの例で示されています。(ハ) 1つのサンプルセッションにおけるすべての単一ユニットの平均スパイクアクティビティを、走行速度分布の5つの五分数にわたってプロット。このセッションでの走行速度は、0〜0.88メートル/秒の範囲でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:図3、図4、および図5に示す記録で単一のユニットを識別するときにKilosort 3が使用するデフォルトパラメータを示す表。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:移植後の動物の自発運動を示すビデオ。 5日間の回復期後に撮影されたビデオは完了し、正常な自発運動行動と、インプラントのサイズと重量への適応を示しています。動物は、環境エンリッチメントを含むプレイケージを普通に探索しているのを見ることができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ2:組み立てられたファラデークラウンに力が加えられているビデオ。 ファラデークラウンが耐える力は、4ピン分極ナノコネクタなどの標準コネクタに必要な接続力よりも約1桁大きいです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:ドライブホルダーの画像を示す図。 印刷可能なデザインファイルは、対応するGithubリポジトリ(https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/)にあります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:銅メッシュのテンプレート。 元のスケーリングでテンプレートを印刷し、ステンシルを使用して銅メッシュを切り抜きます(手順2.12)。スケールバーを使用して、プリントのスケーリングを確認し、必要に応じて調整します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:手術中のインプラントの組み立て手順を示す写真シリーズ。 この場合、2つのマイクロドライブと2つのアンプが取り付けられています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:マウスの頭蓋骨の図で、ドライブ、開頭術(緑)、GND/REFピン(赤)の配置例が示されています。 ピンの位置は、皮質の記録を妨げる可能性が低い小脳に配置されているため、推奨されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この原稿では、プローブを迅速、安全、かつ標準化された移植するためのプロトコルを示しており、これにより、実験終了時のプローブの回収と再利用も可能になります。このアプローチでは、インプラントコンポーネントのモジュラーシステム、特にすべての一般的なシリコンプローブおよび記録システムと互換性のあるマイクロドライブ、頭部固定行動実験に使用できるヘッドプレート、およびインプラントを保護するためのウェアラブルファラデーケージを利用します。このコンステレーションにより、ユーザーは、ヘッド固定型と自由に動く動作、インプラントの小型化(ファラデーケージなし)と長期的な信号ロバスト性の向上(ファラデーケージ付き)など、さまざまな実験パラダイムにインプラントを柔軟に適応させることができます。

このアプローチにより、慢性電気生理学的記録の標準化が進み(手作業による組み立てを必要としないプレハブの要素を使用)、コストが削減され(プローブの回収が可能)、時間がかからず(手術手順が簡素化される)、動物の福祉や行動との互換性が容易になります(インプラントサイズの縮小とストレスフリーな頭部固定による)。そのため、このプロトコルは、行動するげっ歯類の電気生理学的インプラントを、この分野の最先端にいる先駆的な研究室を超えて、より幅広い研究者が達成できるようにすることを目的としています。

この目的を達成するために、ここで紹介するプロトコルは、マイクロドライブインプラントのいくつかのしばしば等しく重要な側面、すなわち柔軟性、モジュール性、インプラントの容易さ、安定性、全体的なコスト、挙動との互換性、およびプローブの再利用性との間のトレードオフを最小限に抑えます。現在、利用可能なアプローチは、多くの場合、これらの側面の一部で優れていますが、他の機能には大きなコストがかかります。例えば、長期間にわたる絶対的なインプラント安定性を要求するユースケースの場合、最良のインプラントアプローチは、プローブを直接頭蓋骨²⁵にセメントで固めることであり得る。しかし、これによりプローブの再利用が妨げられるだけでなく、記録品質が悪い場合に記録部位の再配置が妨げられ、標準化されたインプラント埋入とは互換性がありません。同様に、AMIEドライブは、プローブの回復可能な埋め込みのための軽量で低コストのソリューションを提供する一方で、単一のプローブに限定され、ターゲット座標¹⁷の配置に制限される。スペクトルの対極にあるいくつかの市販のナノドライブ(表1 16,17,21,26,27,28,29,30を参照)は、非常に小さく、頭蓋骨に自由に配置でき、単一の動物に埋め込むことができるプローブの数を最大化する¹⁶.しかし、他のソリューションに比べて高価であり、インプラント手術を成功させるためには実験者に高いスキルが必要であり、プローブの再利用が禁止されています。Vöröslakosらによって開発されたマイクロドライブ²¹は、このプロトコルの一部でもある軽量バージョンで、使いやすさ、低価格、プローブの再利用性を向上させるために、小さなインプラントサイズを犠牲にしています

表1:げっ歯類の慢性プローブインプラントの一般的な戦略の比較。可用性:マイクロドライブがオープンソース(研究者が自分で構築する)であるか、市販されているか、またはその両方であるか。 モジュール性:統合システムは、互いに固定された関係にある1つまたは少数のコンポーネントで構成されていますが、モジュラーシステムでは、インプラントの製造後(手術時など)に、保護(ヘッドギア/ファラデーケージ)に対してプローブ/マイクロドライブを自由に配置できます。モジュール性は、リストされたインプラントの公開された情報または移植プロトコルから決定されました。 ヘッドフィックス: はい:インプラントには、その設計に統合された頭部固定のメカニズムがあります、 X: インプラントは、大きな問題なしに固定用の追加のヘッドプレートを追加するためにスペースを残します、 いいえ:インプラントの設計は、スペースの問題を引き起こすか、頭部固定で使用するために大幅な設計変更を必要とする可能性があります。 プローブの配置: 制限付き:インプラント設計段階では、プローブの位置は制限されています。 柔軟性:手術中でもプローブの位置を調整できます。 Number of probes: 埋め込むことができるプローブの数。マウスに>2プローブを埋め込むことは、選択したインプラントシステムとは無関係に重大な課題をもたらすことに注意してください。 プローブの再利用性:はい、理論的にはプローブを再利用できる場合。 重量/サイズ:インプラントの重量とかさばり。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

これらの異なる要件をよりシームレスに調和させるシステムを作成するために、DREAMインプラントはVöröslakosインプラント²¹に基づいて設計されましたが、いくつかの基本的な変更が加えられています。まず、インプラント全体の重量を減らすために、ここで使用されているマイクロドライブは3Dプリントされたステンレス鋼ではなく機械加工されたアルミニウムで製造され、ファラデークラウンは小型化され、ヘッドプレートの材質の選択に応じて1.2〜1.4gの全体的な重量削減が達成されています(表2を参照)。次に、マイクロドライブを囲むヘッドプレートは、ファラデーケージのベースとしても機能し、ニューロン記録のほとんどの潜在的なターゲット領域へのアクセスを可能にし、インプラントに最小限の重量を追加するだけで、迅速でストレスのない頭部固定を可能にする統合ヘッド固定メカニズムを可能にするように設計されています。固定機構の平らな形状と突起の欠如は、動物の視野または移動の障害を最小限に抑えることも保証し(図2A-Cを参照)、以前のシステム^31,32よりも明らかに改善されている。ヘッドプレートに固定されるファラデークラウンとリングも、従来のデザインに比べて大幅に変更されました。現在では、その場しのぎの適応(コネクタの配置など)や手術中のはんだ付けが不要になり、インプラントの損傷やインプラント品質の予測不可能なばらつきの潜在的な原因が排除されます。その代わり、DREAMインプラントは、各コネクタを事前に定義された4つの位置のいずれかに配置できる複数の標準化されたクラウンリングのバリエーションを提供し、手術中のばらつきと労力を最小限に抑えます。最後に、プローブの回収のためにインプラントシステムを最適化することにより、DREAMインプラントは、マイクロドライブとプローブを通常一緒に回収、洗浄、再利用できるため、実験者はインプラントあたりのコストと準備時間を大幅に削減できます。

さまざまなインプラントシステムによってもたらされるトレードオフのより包括的な概要については、 表1を参照してください。ここで紹介するアプローチは、サイズ、安定性、コストなど、他のすべての戦略と比較して一般的に最大のパフォーマンスを提供するわけではありませんが、これらすべてのパラメーターで上限で動作するため、幅広い実験に容易に適用できます。

プロトコルの3つの側面は、それぞれの特定のユースケースに適応するために特に重要です:グランドとリファレンスのコンステレーション、マイクロドライブをセメントで固定する技術、ニューロン記録によるインプラントの検証。まず、グランドピンとリファレンスピンを埋め込む際の目標は、機械的/電気的安定性と侵襲性の間のスイートスポットを特定することでした。一方、例えば、寒天に埋め込まれた浮遊銀線は、骨ねじ³³よりも侵襲性が低いが、それらは、時間の経過とともに外れる傾向がある可能性が高い。ピンの使用と寒天の組み合わせにより、安定した電気接続が保証されると同時に、挿入時の制御が容易で、組織の外傷を回避できるという利点があります。頭蓋骨にセメントで固定されたアースピンが外れる可能性は低く、ワイヤーがピンから分離した場合、埋め込まれたピンの表面積が大きく、安定性が高いため、通常、再取り付けは簡単です。

表 2: DREAM インプラントと Vöröslakos et ^al.21 によって記述されたインプラントとの間のコンポーネント重量の比較。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

次に、マイクロドライブのセメンチングは、通常、プローブを脳に挿入する前に行う必要があります。これにより、挿入時にマイクロドライブが定位ホルダーに完全に固定されていない場合に、脳内でのプローブの横方向の動きが防止されます。マイクロドライブを所定の位置に固定する前にプローブの配置を確認するには、プローブシャンクの先端を短時間下げて、顕微鏡の視差シフトを考えるとタッチダウン位置を外挿するのが難しいため、プローブシャンクの先端を短く下げて脳に接触する場所を確認できます。マイクロドライブの位置が確立されると、オプションで、マイクロドライブをセメントで固定する前に開頭術をシリコンエラストマーで保護して、セメントが誤って開頭術に接触しないようにすることができます。ただし、シリコーンエラストマーを介してプローブを下げることは、シリコーンエラストマーの残留物が脳に引き込まれ、炎症や神経膠症を引き起こす可能性があるため、お勧めしません。

第三に、使用される実験プロトコルに応じて、手術直後の検査記録が有用である場合とそうでない場合があります。主に、プローブ挿入直後に記録されたニューロン活動は、一時的な脳の腫れやプローブ周囲の組織の動きなどの要因により、慢性的に記録された活動を直接表していないため、挿入深さとスパイク波形の両方が直接安定する可能性は低いことを意味します。そのため、即時録音は、主に一般的な信号品質とインプラントの完全性を確認するのに役立ちます。可動式マイクロドライブスレッドは、脳が安定したら、手術後の数日間、位置を微調整するために使用することをお勧めします。これにより、プローブが1日あたり1000μm以上動くのを防ぎ、記録部位への損傷を最小限に抑え、記録部位の寿命を延ばすことができます。

最後に、ユーザーは、複数のターゲット位置から記録するようにシステムを適応させたいと思うかもしれません。このシステムはモジュール式であるため、ユーザーはコンポーネントを互いに関連付けて組み立てて配置する方法について多くの自由度があります(上記および 補足図3 および 補足図4を参照)。これには、水平方向に伸びたシャトルをマイクロドライブに取り付けることができる変更が含まれ、複数のプローブまたは大きなマルチシャンクプローブを埋め込むことができるだけでなく、複数の個別のマイクロドライブを埋め込むこともできます( 補足図3 および 補足図4を参照)。このような変更には、適合したクラウンリングを使用するだけで、コネクタ/インターフェースボード/ヘッドステージの取り付けゾーンの数が増えます。ただし、この設計のスペース制限は動物モデル(この場合はマウス)によって決定されるため、複数のプローブを1つのマイクロドライブに積み重ねる方が、複数のマイクロドライブを互いに独立して埋め込むよりもフットプリントの点で魅力的です。ここで使用されるマイクロドライブはスタックプローブをサポートできるため、唯一の実際の制限は、動物モデルによって定義されたスペースと重量の制約に適合できるヘッドステージまたはコネクタの数です。スペーサーを使用して、非垂直の取り付けおよび挿入パスをさらに増やすこともできます。

結論として、このプロトコルは、プローブの回復を優先するマイクロドライブ設計の利点に加えて、安価で軽量で、重要なことに調整可能なプローブの埋め込みを可能にします。これは、シングルユースプローブの法外なコスト、手術および移植技術の高い障壁、および慢性移植のための商用ソリューションが独自のユースケースに適応するのが難しいことが多いという事実の問題に取り組んでいます。これらの問題は、すでに急性電気生理学を使用している研究室にとっては問題点であり、電気生理学実験をまだ行っていない研究室にとっては抑止力となります。このシステムは、これらの制限を超えて慢性電気生理学研究の幅広い取り込みを促進することを目的としています。

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Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05" Solder Tail Socket	Mill-Max	853-93-100-10-001000
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))	ThermoFisher	D282	Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location
Adhesive Putty (Blu-Tack)	Bostik	308590110	Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store
Agar	Sigma Aldrich	A1296	Make with saline for conductivity.
Amplifier (Miniamp-64)	Cambridge Neurotech		Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible.
Analgesic Cream (EMLA Cream)	Aspen	39699/0088	Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine.
Angled Spacer	3DNeuro		Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blue light curing LED	B.A. International	818223	Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength
Bone wax	SMI	Z046	Wax to protect craniotomy and probe post surgery.
Buprenorphine	Elanco Europe LTD	401513	Injectable Buprenorphine solution (0.3 mg/mL)
Copper mesh	Dexmet	3CU6-050FA	Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy.
Cyanoacrylate glue (Loctite)	Loctite	1363589	Cyanoacrylate gel glue
Dental Cement (SuperBond C&B)	Sun Medical	K058E	Dental cement (SuperBond)
Depilation Cream (Veet)	Veet	310000091434	Hair removal cream for removal of hair around surgical site.
Enrofloxacin (Baytril)	Elanco Europe LTD	00879/4117	Injectable enrofloxacin solution (25 mg/mL)
Faraday crown	3DNeuro		3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faraday ring	3DNeuro		3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Haemostatic Sponge	SMI	ZHG101010	Absorbable gelatin haemostatic sponge
Heat Shrink Tubing	HellermannTyton	TA32-9/3 BK	Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps
Iodine	Braunol	9322507	Aqueous povidone-iodine solution.
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	4527098	Injectable Metamizole (500mg/mL)
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	1553758	Metamizole solution
Microdrive (R2Drive)	3DNeuro		Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310-100ML	Oil used as solvent to create craniotomy protection gel.
Non-Shedding Wipes (Kimtech)	Kimtech	7552	Non-shedding wipes
Primer	Bisco	B-7202P	Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto.
R2Drive holder	3DNeuro		Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Self-adherent wrap	3M	VB050	Protective wrap for implant post surgery
Silicon probe (H2)	Cambridge Neurotech		Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible.
Silicone Elastomer (Duragel)	Cambridge Neurotech		Silicone Elastomer
Silicone Plaster (Kwikcast)	WPI	KWIK-CAST
Silver conductive epoxy	MG Chemicals	8331D-14G	Silver epoxy
Size 5 Dumont forceps	FSTools	11251-10	Small forceps for lifting bone flap.
Stainless steel wire, Teflon coated	Science Products GmBH	SS-3T	Ground wire
Stereotax (RWD)	RWD	68803	Stereotax for surgical procedures on mice.
Tergazyme	Alconox	1304	A possible enzymatic cleaner to clean probe
Two Part Fast setting Epoxy Resin	Gorilla	EP3	Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts.
Vannas Spring Scissors Round Handle	FSTools	15403-08	0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors.
Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond)	3M	70-0068-5256-3	Veterinary cyanoacrylate glue