がん遺伝子由来の転写-複製コンフリクトを研究するための近接ライゲーションアッセイ

要約

ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、がん遺伝子によって誘導される転写複製コンフリクト(TRC)を検出するための高感度で特異的な方法を紹介します。このアプローチでは、PCNAおよびリン酸化CTD RNAPIIを標的とする特異的抗体を活用し、RNAポリメラーゼII転写とDNA複製機構との間のTRCの有病率の評価を可能にします。

要約

DNA複製とRNA転写はどちらもゲノムDNAをテンプレートとして利用するため、これらのプロセスを空間的および時間的に分離する必要があります。複製機構と転写機構との間の対立は、転写-複製競合(TRC)と呼ばれ、がん発生の重要な要素であるゲノムの安定性にかなりのリスクをもたらします。これらの衝突を制御するいくつかの要因が特定されていますが、直接的な視覚化と明確な解釈のためのツールが限られているため、主な原因を特定することは依然として困難です。本研究では、PCNAに特異的な抗体とRNAポリメラーゼIIのリン酸化CTDを活用して、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いてTRCを直接可視化します。このアプローチにより、RNAポリメラーゼIIによって媒介される複製プロセスと転写プロセスの間のTRCの正確な測定が可能になります。この方法は、これらの抗体に共有結合したDNAプライマーと蛍光プローブを使用したPCR増幅を組み合わせることでさらに強化され、内因性TRCを検出するための高感度で特異的な手段を提供します。この技術は、直接的なTRC可視化のギャップを埋め、細胞内のゲノム不安定性を引き起こす根本的なプロセスのより包括的な分析と理解を可能にします。

概要

ゲノムは、複製や転写などの重要な生物学的プロセスのテンプレートとして機能します。健康な細胞では、RNA転写機構とDNA複製機構は通常協力し、空間的および時間的に分離されています1,2,3,4。しかし、がん遺伝子の過剰発現などの病理学的条件下では、この調和のとれた協力が損なわれる可能性があります。

がん遺伝子はしばしば転写レベルを上昇させ、転写機構と複製機構との間の衝突の可能性を高めます⁵。一部のがん遺伝子はクロマチンの構造を変化させ、転写に利用しやすくしますが、複製フォークの進行を妨げる可能性があります⁵。さらに、がん遺伝子の活性化は、細胞周期を加速することにより複製ストレスを誘発することができます⁶。RNAポリメラーゼII(RNAPII)の活性は、Rbのサイクリン依存性キナーゼ(CDK)リン酸化によりG1/S相移行中に有意に上昇し、サイクリン、CDK、ハウスキーピング遺伝子などの必須タンパク質の転写を促進するE2F転写因子を放出^{します7。}ヒストン遺伝子の発現はS期にピークに達し、DNA複製と一致します⁸。さらに、いくつかの非常に長い遺伝子の完全長転写産物を転写するには、複数の細胞周期が必要です⁹。S期に入るたびに、同じゲノム領域での転写機構と複製機構の同時活動により、有害な出会いが発生し、競合が発生する可能性があります。これらの対立は、ゲノム不安定性の主要な内因性の原因であり、腫瘍形成と密接に関連しています。複製機構がRNAPII転写とどのように連携して有害な衝突を防ぎ、ゲノムの安定性を維持するかは、依然として重要な問題です。したがって、RNAPIIに関連する転写複製コンフリクト(TRC)の直接的な可視化は、これらのコンフリクトを解決する分子メカニズムを理解するために不可欠であり、最終的にはこれらのコンフリクトを治療目的で利用するための基礎を築く可能性があります。

転写複製コンフリクト(TRC)は、転写と複製が互いに進行する「正面」と、同じ方向に進む「共方向」の2つの方向で発生する可能性があります。正面衝突は、同方向の衝突よりもはるかに破壊的です10,11,12,13。DNA-RNAハイブリッド(Rループ)の形成は、TRCの主要なドライバーとして特定されています。したがって、かなりの量の研究が、調節不全の複製および/または転写に応答するRループおよびそれらの領域の発生を評価することにより、TRCの存在を推測してきた^10,11。しかし、転写由来のRループの蓄積が複製の比例障害となり、TRCと直接相関するかどうかは未解決の問題です。研究者はまた、複製フォークのダイナミクスを分析することにより、TRCを調査しています。例えば、レポーター遺伝子の二次元ゲル電気泳動は、遺伝子座特異的なレプリソームの一時停止^{を明らかにすることができ12}、DNAファイバーアッセイは、研究者が複製フォーク速度、起源密度、およびフォーク非対称性の変化を調べることを可能にする¹³。次世代シーケンシング技術の進歩は、岡崎フラグメントシーケンシング(Ok-seq)^14,15、開始部位シーケンシング(ini-seq)^16,17、短新生鎖シーケンシング(SNS-seq)¹⁸、Repli-seq19、ポリメラーゼ使用シーケンシング(Pu-seq)²⁰など、いくつかの革新的な方法の開発につながっています.これらの技術により、複製の起源の使用、フォークの方向性、および複製の終了に関するゲノムワイドなプロファイルが提供され、複製と転写の調整に関与する主要な要因が明らかになりました。TRIPn-seqは、転写および複製の共占有を直接検出できる数少ない方法の1つであり、生理学的および病理学的条件下でのDNA複製および転写の動的組織化についての理解を大幅に拡大する²¹。これらのシーケンシングベースの方法によって提供される貴重な洞察にもかかわらず、その高コストと時間のかかる性質により、より広範なアプリケーションが制限されます。したがって、シングルセルレベルでTRCを可視化および定量するためには、より決定的で、高感度で、便利で、迅速な検出方法を確立することが重要です。

in situ近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、Duolink PLAテクノロジーとも呼ばれ、組織切片や細胞培養物における標的タンパク質の物理的近接性を評価するための強力な方法です。この手法は、2つのタンパク質またはタンパク質複合体が互いに40 nm以内にある場合にのみシグナルを生成します。これには、それぞれ異なる種(マウス/ウサギ、ウサギ/ヤギ、マウス/ヤギなど)由来の標的タンパク質に対する2つの一次抗体が必要です。これらの一次抗体とサンプルをインキュベートした後、PLAプローブ(1つはPLUSおよび1つはMINUS)と呼ばれる二次抗体を塗布します。一次抗体の定常領域に結合する通常の二次抗体とは異なり、PLAプローブは特定のDNAプライマーに共有結合しています。標的タンパク質が近接している(40 nm未満)場合、コネクターオリゴヌクレオチドは両方のPLAプローブとハイブリダイズでき、結合したオリゴヌクレオチドの完全長DNA分子への酵素ライゲーションが容易になります。この新しく形成されたDNAは、検出されたタンパク質相互作用の代理マーカーとして機能し、増幅のテンプレートとして機能します。次に、増幅された生成物は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して視覚化されます。タンパク質が40 nm以上離れている場合、PLAプローブはDNAテンプレートを形成できず、検出可能なシグナルは得られません。PLAの概略図を図1に示します。近接性および/または相互作用は、蛍光顕微鏡法によって蛍光ドットとして視覚化され、これらのドットの数と強度を定量化できます。2002年の発明以来、PLAはその高い感度と特異性により、タンパク質相互作用のモニタリングに人気を博しています。シーケンシングベースのアッセイとは異なり、PLAは少量のサンプルしか必要としないため、希少なサンプルの分析に適しています。

研究は、発癌性KRAS G12D変異の発現が転写複製コンフリクト(TRC)^22,23を引き起こすことを実証しています。例えば、Mengらによって発表された研究²³は、ヒト膵管上皮(HPNE)細胞におけるKRAS G12Dの異所性発現がTRCおよびTRC関連Rループを増強することを示しています。細胞株におけるRNAPII転写と複製機構との間の衝突の検出を可能にするために、この目的のために特別に開発されたプロトコルを提供しています。KRAS(G12D)プラスミドとベクターコントロールをヒト肺上皮BEAS-2B細胞にトランスフェクションし、KRAS(G12D)の発現とDNA損傷(γH2AX)をウェスタンブロットで検証します。Rループの蓄積はS9.6ドットブロット解析によって確認され、KRASを発現する細胞(G12D)における複製障害の蓄積とゲノムの不安定性がまとめて示されています。最後に、細胞をスライド上に固定してPLAアッセイを行います。衝突を局所的に検出するために、まず細胞をRNAPIIおよびPCNA一次抗体で染色し、次にPLAプローブで標識した二次抗体で染色します。ライゲーションが成功すると環状DNA分子が形成され、その後のローリングサークル増幅(RCA)のテンプレートとして機能します。次に、スライドを適切な封入剤にマウントし、蛍光顕微鏡で可視化します。ImageJを使用して画像を解析できます。

プロトコル

1. レンチウイルスの産生と標的細胞株への形質導入

1. レンチウイルス生産²⁴
   1. 高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;完全培地)で、10cmプレートあたり3×10⁶ 細胞で293Tパッケージングセルを播種します。加湿した5% CO₂ インキュベーターで37°Cで細胞をさらに18〜20時間増殖させます。
   2. 2本の1.5 mLチューブに、9.2 μgのpsPAX2、2.8 μgのpMD2.G、および12 μgのpLVX-KRASプラスミドまたは空のベクターを含む500 μLのOpti-MEM(還元血清培地)に合計24 μgのプラスミドDNAのDNA混合物を調製します。
      注:エンドトキシンはトランスフェクション効率を大幅に低下させるため、精製中にプラスミドからエンドトキシンを除去することをお勧めします。
   3. 144 μL のポリエチレンイミン (PEI; 1 mg/mL) を還元血清培地 1 mL に希釈し、混合し、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。
   4. 希釈したDNA混合物に希釈したPEI500 μLを滴下し、チューブを静かにフリックします。PEI/DNA混合物を室温で15分間インキュベートします。
   5. インキュベーション中に、前に播種した10cmプレートから培地を静かに吸引します。10 mLの新鮮な完全なDMEMと交換します。.
   6. インキュベーション後、DNA:PEIトランスフェクションミックスを10 cmプレートにゆっくりとピペットで移し、細胞が剥離しないように注意してください。
      注:PEIは一般的に使用されるトランスフェクション試薬ですが、トランスフェクション効率と細胞毒性のバランスをとるために、その濃度を慎重に最適化する必要があります。Lipofectamine 3000(トランスフェクション試薬)はコストが高いにもかかわらず、特定の細胞株ではPEIと比較して高いトランスフェクション効率と低い細胞毒性が示されており、ウイルス産生の改善につながっています。エレクトロポレーションは、電気パルスを使用して細胞に核酸を導入する別の選択肢です。効果的ですが、特殊な機器が必要であり、より労働集約的になる可能性があります。
   7. 細胞を18時間増殖させた後、トランスフェクション培地を25 μMのクロロキンを含む新鮮な10 mLのDMEM Complete培地と慎重に交換します。
   8. トランスフェクションの72時間後、ウイルス粒子を含む培地を回収します。パッケージの293T細胞を500 x g で5分間遠心分離して取り出します。
   9. 上清を回収し、0.45 μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターでろ過します。ウイルス上清を直接使用します。
      注:ウイルス上清は、分注して液体窒素で急速冷凍し、力価の損失を避けるために-80°Cに保持する必要があります。
2. 標的細胞のレンチウイルス感染
   1. 2つの6 cmプレートに2 × 10⁶ の標的細胞BEAS-2Bを播種し、37°C、5%CO₂ で一晩増殖します。形質導入の際には、BEAS-2B細胞が約70%コンフルエントであることを確認してください。
   2. 古い培地を慎重に取り出し、適切な0.5 mLのKRASまたはベクターレンチウイルス粒子と3 mLの新鮮な完全RPMI-1640培地をそれぞれ2つのプレートに加えます。
   3. 細胞を37°Cで18〜20時間、5%_CO2 インキュベーターで増殖します。レンチウイルス粒子を含む古い培地を、3.5 mLの新鮮な温めた完全培地と交換します。72時間形質導入後、以下のアッセイのために細胞を採取します。
      注:ウイルスとの一晩のインキュベーションが毒性を引き起こす場合、インキュベーション時間を4時間に短縮することができます。形質導入効率と細胞の健康のバランスを達成するためには、次の戦略を考慮する必要があります:(1)感染の多様性を最適化する。(2)高品質のウイルス調製物を使用してください。(3)ポリカチオン(ポリブレンなど)を利用して効率を改善し、低ウイルス力価の使用を可能にし、潜在的な毒性を減らす。(4)長期的な研究では、導入遺伝子の発現を一時的に制御するために、誘導性発現システムの使用を検討し、細胞への負担を軽減し、潜在的な毒性を最小限に抑えることを検討します。

2. KRAS(G12D)由来のDNA損傷とRループ形成の検証

1. WBアッセイによる遺伝子発現とDNA損傷の確認
   1. プレートから培地を吸引します。
   2. 1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を優しく洗浄し、残留培地や破片を取り除きます。
   3. 掻き取りプロセス中に細胞を湿らせておくために、少量の1x PBSを追加します。
   4. セルスクレーパーを斜めに保持して使用し、セルを表面から一定の方向にそっとこすり落とします。
      注:細胞を損傷する可能性のある圧力をかけすぎないように注意してください。
   5. プレートを傾け、ピペットを使用して細胞懸濁液をチューブに集め、細胞を500 x g で5分間回転させます。上清を捨てます。
   6. 2x RIPAバッファー( 表1を参照)を希釈して1x RIPAバッファーを調製し、使用直前にプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加してください。
   7. 細胞ペレットをあらかじめ冷却したRIPAバッファー(1x)で溶解し、氷上で30分間インキュベートします。15,000 x g で10分間遠心分離することにより、破片を除去します。上清を採取し、Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。
   8. 上清に4 x ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルローディングバッファーを添加し、タンパク質を95°Cで5分間変性させます。まず、12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルで各サンプルから40 μgのタンパク質を分離し、次に0.2 μmのニトロセルロースメンブレンに移します( 材料の表を参照)。
   9. 転写が終了したら、ブロッキングバッファー(0.1%Tween 20 [TBST; 表1])1時間。
   10. TBSTでメンブレンを短時間すすぎた後、FLAG-tag(PBSTで1:2500希釈)およびγH2AX(PBSTで1:1000希釈)に対する一次抗体とメンブレンをインキュベートします( 材料表を参照)4°Cで一晩。
   11. 一次抗体を取り出し、メンブレンをTBSTで3回、各回10分間洗浄します。
   12. 希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(5%脱脂乳を含むTBSTバッファー中の1:5,000)にメンブレンを室温(RT)で1時間浸します。
   13. メンブレンをTBSTで3回、毎回10分間洗浄します。
   14. Enhanced Chemiluminescence(ECL)試薬を介してタンパク質レベルを可視化します( 材料表を参照)。
2. ドットブロットによるRループの検出²⁵​
   1. プレートから培地を吸引します。
   2. 細胞を1x PBSで優しく洗浄し、残留培地や破片を取り除きます。
   3. 掻き取りプロセス中に細胞を湿らせておくために、少量の1x PBSを追加します。
   4. セルスクレーパーを斜めに保持して使用し、セルを表面から一定の方向にそっとこすり落とします。
      注:細胞を損傷する可能性のある圧力をかけすぎないように注意してください。
   5. プレートを傾け、ピペットを使用して細胞懸濁液をチューブに集め、細胞を500 x g で5分間回転させます。上清を捨てます。
   6. 2 × 10⁶ 個の細胞を 300 μL の氷冷 Cell Lysis Buffer で溶解します ( 表 1 を参照)。氷上で10分間インキュベートします。500 x g で4°Cで5分間遠心し、上清を捨てます。ペレットには原子核が含まれています。
   7. 幅広のオリフィスチップを使用して、各ペレットを300 μLの予冷済み核溶解バッファーで再懸濁します( 表1を参照)。
   8. 各サンプルに20 mg/mLのプロテイナーゼK( 材料表を参照)を3 μL加え、55°Cで3〜5時間消化します。
   9. 各チューブに100 μLのElution Buffer( 表1を参照)を加え、十分に混合します。
   10. フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1 pH 8.0)を各チューブに400 μL加えます。激しいボルテックスの後、12,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、DNAを他の細胞内容物から分離します。
   11. 上部水相を新しいチューブに慎重に移します。
   12. 1/10容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)と2.5容量の予冷済み100%エタノールをサンプルに添加して、DNAを沈殿させます。十分に混合し、4時間または-20°Cで一晩インキュベートします。
       注:サンプルにグリコーゲン( 材料の表を参照)を添加すると、エタノール沈殿からのDNA回収率が向上する可能性があります。最終的なグリコーゲン濃度は約0.05-1μg/μLです。
   13. DNAを12,000 x g で4°Cで30分間遠心分離してペレット化します。 ペレットを乱さずに上清を捨てます。
   14. ペレットを氷冷した70%エタノール1mLですすぎ、4°Cで12,000 x g で5〜15分間再度遠心分離します。
   15. DNAペレットを乱さないように、上清を慎重に捨ててください。
   16. DNAペレットを5〜10分間風乾します。
   17. 予熱したTEバッファー(pH8.0)50 μLを加えてDNAペレットを溶解し、37°Cで30分間インキュベートします。 各サンプルのDNA濃度を測定します。
   18. TEバッファー(5 ng/μL〜200 ng/μL)でDNAを所望の濃度に希釈します。ドットブロット装置により、各サンプルの20 μLを正に帯電したナイロンメンブレン上に均一にスポットします。
       注:ドットブロットアッセイを使用してRループを検出するには、ドットあたり約500 ngのゲノムDNAを適用することをお勧めします。この量は、これらの構造に特異的に結合するS9.6モノクローナル抗体を使用した場合、RNA-DNAハイブリッドの検出に十分な感度を提供することが示されています。
   19. UVクロスリンカーの「Auto Crosslink」設定(1,200 μJ x 100)(材料表参照)を使用して、DNAをナイロンメンブレン(材料表参照)に架橋することにより、DNAを固定化します。
   20. メンブレンを ブロッキングバッファー ( 表1を参照)に室温で1時間浸します。次に、TBSTでメンブレンを短時間すすぎます。
   21. メンブレンを一次抗体( 材料表を参照)と4°Cで一晩インキュベートします。 S9.6 の希釈率は、5% BSA を含む TBST で 1:1,000 です。
   22. 一次抗体を取り出し、TBSTで3回、毎回10分間洗浄します。
   23. TBST中の5% BSA中のHRP標識二次抗体とメンブレンをインキュベートし、室温で1時間。
   24. 二次抗体を取り出し、TBSTで3回、1回10分間洗浄します。
   25. ECL(Enhanced Chemiluminescence)試薬を介してRループレベルを視覚化します(材料の表を参照)。

3. PLAアッセイ

1. 細胞調製
   注:KRAS G12Dがん遺伝子による細胞の導入は、正のPLAシグナルによって証明されるように、TRCの増加につながります。この方法は、抗生物質の選択を必要とせずに、がん遺伝子駆動型TRCをバックグラウンドレベルから効果的に区別します。しかし、形質導入後に抗生物質の選択を実施することで、形質導入に成功した細胞の集団を濃縮することで全体的なシグナルを増強し、アッセイの感度と特異性を向上させることができます。
   1. 直径12mmのカバーグラスを12ウェルプレートの各ウェルにセットします。
   2. 感染後24時間でレンチウイルスに感染した細胞をこれらのウェルに播種し、500 μLの完全RPMI-1640培地、5% CO₂を含む37°Cのカバーガラス上に細胞を維持します。
   3. 最適)実験デザインに、形質導入に成功した細胞を濃縮するための抗生物質の選択が含まれている場合は、この段階で適切な抗生物質を培地に添加します。
   4. 細胞をモニターして、感染後48〜72時間で約60%のコンフルエンスに達することを確認します。
   5. RPMI-1640を慎重に取り出し、氷上で冷やした0.5%NP-40で細胞を4分間予備抽出します。
   6. 500 μLのFixation Buffer( 表1を参照)を直接加えて、細胞を室温で15分間固定します。
      注:特に細胞株が剥離に敏感な場合は、細胞が成長している表面から細胞が剥離する可能性があるため、固定ステップの前に細胞を洗浄しないことをお勧めします。したがって、固定液を直接添加することがしばしば好ましい。
   7. 固定バッファーを取り外し、細胞を1x PBSで3回慎重に洗浄して反応を停止します。
   8. PBSを吸引し、500 μLの予冷済み100%メタノールを細胞に加えます。
   9. -20°Cで15〜30分間インキュベートすることにより、細胞を透過化します。
   10. Duolinkブロック溶液で細胞を室温で1時間ブロックします。
2. 抗体染色
   1. マウス抗RNAPII 8WG16(1:500)およびウサギ抗PCNA(D3H8P)(1:500)をDuolink抗体希釈バッファーで希釈します。一次抗体混合物と細胞をインキュベートし、湿度チャンバー内で4°Cで一晩。
      注:一次抗体(抗RNAPIIまたは抗PCNA)の1つだけを使用してPLAプロトコルを実行し、もう1つは省略します。これにより、個々の抗体またはPLAプローブの非特異的相互作用から生じるバックグラウンドシグナルを同定することができます。
   2. 糸くずの出ない古紙シートを使用して、細胞に触れずにスライドから一次抗体を静かに取り除きます。次に、細胞を1x PBSで3回洗浄します。
   3. 以下の手順( 表2参照)に従ってPLAプローブ(または二次抗体)を調製し、混合して室温で20分間放置します。
   4. 二次抗体ミックスをスライドに加え、湿度チャンバー内で室温で2時間インキュベートします。
3. ライゲーションと増幅
   1. 二次抗体ミックスを廃棄し、スライドを1x Buffer Aでそれぞれ2回、5分間洗浄します。
   2. 以下の手順に従ってライゲーションミックスを調製します( 表2を参照)。
   3. 各カバースライドに15 μLのライゲーションミックスを適用し、湿度チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. スライドを1x Buffer Aで2回、それぞれ2分間洗浄します。
   5. 以下の手順に従って、増幅ミックスを調製します( 表2を参照)。
   6. 各スライドに15 μLのAmplification Mixを塗布し、湿度チャンバー内で37°Cで100分間インキュベートします。増幅を廃棄する:1x Buffer Bと2回ずつ10分間混合して洗浄します。
   7. スライドを0.01xバッファーBで1分間1回洗浄します。
   8. バッファBを吸引し、DAPIを使用してDuolink In Situ 封入剤にスライドをマウントします。
4. 画像解析と閾値の決定:
   1. ImageJによるPLA病巣の数を定量化します。自動画像解析ソフトウェアは、PLA信号を客観的に定量化するのに役立ちます。摂動されていない条件下で3つのPLA病巣を獲得する制御細胞は1%未満であるため、核あたり3つ以上のPLA病巣の閾値を閾値として選択します。
      注:閾値は、変動性を考慮して複数のサンプルとコントロールを分析することによって実験的に決定されるため、比較可能性を確保するために、すべてのサンプルで一貫したイメージング設定(例えば、露光時間、ゲイン)を維持する必要があります。

結果

γH2AXは、DNA損傷のバイオマーカーとして機能します。KRAS(G12D)の過剰発現は、ウェスタンブロット解析におけるγH2AXシグナルの増加によって証明されるように、これらの細胞のゲノム安定性を損ないます(図2A)。さらに、ベクターコントロールと比較してKRAS(G12D)発現細胞におけるS9.6ドットブロットシグナルの強化(図2B)は、?...

ディスカッション

RNAPII転写機構は、DNA複製フォークの進行^26,27に障害を作り出す可能性があり、特に癌細胞^28,29においてTRCとDNA損傷を促進する。TRCを制御するタンパク質を解読し、その詳細なメカニズムを理解することで、これらの有害な事象がどのように発生するのかを理解し、将来の新しい治?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92014
FLAG antibody	Millipore	F7425
gamma H2AX antibody	Cell Signaling	25955
Glycogen, molecular biology grade	ThermoFisher	R0561
Image J	NIH	https://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranes	Amersham	10600004
PCNA antibody	Cell Signaling	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
Proteinase K, recombinant, PCR grade	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII antibody	SCBT	sc-56767
S9.6 antibody	Active motif	65683
UV crosslinkers	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000