Saggio di legatura di prossimità per studiare i conflitti di trascrizione-replicazione derivati da oncogeni

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo sensibile e specifico per rilevare i conflitti di trascrizione-replicazione (TRC) indotti da oncogeni utilizzando il saggio di legatura di prossimità (PLA). Questo approccio sfrutta anticorpi specifici che hanno come bersaglio PCNA e RNAPII fosfo-CTD, consentendo la valutazione della prevalenza di TRC tra la trascrizione della RNA polimerasi II e il meccanismo di replicazione del DNA.

Abstract

Sia la replicazione del DNA che la trascrizione dell'RNA utilizzano il DNA genomico come modello, richiedendo la separazione spaziale e temporale di questi processi. I conflitti tra il meccanismo di replicazione e quello di trascrizione, denominati conflitti di trascrizione-replicazione (TRC), rappresentano un rischio considerevole per la stabilità del genoma, un fattore critico nello sviluppo del cancro. Sebbene siano stati identificati diversi fattori che regolano queste collisioni, l'individuazione delle cause primarie rimane difficile a causa degli strumenti limitati per la visualizzazione diretta e l'interpretazione chiara. In questo studio, visualizziamo direttamente i TRC utilizzando un saggio di ligazione di prossimità (PLA), sfruttando gli anticorpi specifici per PCNA e CTD fosforilato della RNA polimerasi II. Questo approccio consente di misurare con precisione i TRC tra i processi di replicazione e trascrizione mediati dalla RNA polimerasi II. Il metodo è ulteriormente migliorato attraverso primer di DNA coniugati covalentemente a questi anticorpi, accoppiati con l'amplificazione PCR mediante sonde fluorescenti, fornendo un mezzo altamente sensibile e specifico per rilevare i TRC endogeni. La microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione di questi conflitti, offrendo un potente strumento per studiare i meccanismi di instabilità del genoma associati al cancro. Questa tecnica affronta il divario nella visualizzazione diretta della TRC, consentendo un'analisi e una comprensione più complete dei processi sottostanti che guidano l'instabilità del genoma nelle cellule.

Introduzione

Il genoma funge da modello per i processi biologici essenziali, tra cui la replicazione e la trascrizione. Nelle cellule sane, la trascrizione dell'RNA e il meccanismo di replicazione del DNA tipicamente cooperano e sono segregati spazialmente e temporalmente 1,2,3,4. Tuttavia, in condizioni patologiche, come la sovraespressione dell'oncogene, questa cooperazione armoniosa può essere interrotta.

Gli oncogeni spesso guidano livelli di trascrizione elevati, aumentando la probabilità di collisioni tra il meccanismo di trascrizione e quello di replicazione⁵. Alcuni oncogeni alterano l'architettura della cromatina, rendendola più accessibile per la trascrizione, ma potenzialmente ostacolando la progressione della forcella di replicazione⁵. Inoltre, l'attivazione dell'oncogene può indurre stress di replicazione accelerando il ciclo cellulare⁶. L'attività della RNA polimerasi II (RNAPII) è significativamente elevata durante la transizione di fase G1/S a causa della fosforilazione di Rb da parte della chinasi ciclina-dipendente (CDK), che rilascia fattori di trascrizione E2F che promuovono la trascrizione di proteine essenziali, tra cui cicline, CDK e geni housekeeping⁷. L'espressione genica degli istoni raggiunge il picco durante la fase S, in coincidenza con la replicazione del DNA⁸. Inoltre, la trascrizione dei trascritti completi di alcuni geni molto lunghi richiede più di un ciclo cellulare⁹. Ad ogni ingresso nella fase S, l'attività simultanea dei meccanismi di trascrizione e replicazione nelle stesse regioni genomiche può provocare incontri dannosi, portando a conflitti. Questi conflitti sono una fonte primaria intrinseca di instabilità del genoma, che è strettamente associata alla tumorigenesi. Il modo in cui il meccanismo di replicazione si coordina con la trascrizione di RNAPII per prevenire scontri dannosi e mantenere la stabilità genomica rimane una domanda importante. Pertanto, la visualizzazione diretta dei conflitti di trascrizione-replicazione (TRC) associati a RNAPII è diventata essenziale per comprendere i meccanismi molecolari che risolvono questi conflitti e potrebbe eventualmente gettare le basi per sfruttare questi conflitti per scopi terapeutici.

I conflitti di trascrizione-replicazione (TRC) possono emergere in due orientamenti: frontale, in cui trascrizione e replicazione progrediscono l'una verso l'altra, e co-direzionale, in cui si muovono nella stessa direzione. Le collisioni frontali sono molto più distruttive di quelle codirezionali 10,11,12,13. La formazione di ibridi DNA-RNA (R-loops) è stata identificata come uno dei principali motori dei TRC; pertanto, una notevole quantità di ricerche ha dedotto la presenza di TRC valutando l'occorrenza di R-loop e delle loro regioni in risposta alla replicazione e/o trascrizione disregolata^10,11. Tuttavia, se l'accumulo di R-loop derivati dalla trascrizione serva come ostacolo proporzionale alla replicazione e sia direttamente correlato con i TRC rimane una questione irrisolta. I ricercatori hanno anche studiato i TRC analizzando la dinamica della forcella di replicazione. Ad esempio, l'elettroforesi su gel bidimensionale dei geni reporter può scoprire la pausa¹² del replosoma locus-specifico, mentre i saggi delle fibre di DNA consentono ai ricercatori di esaminare le alterazioni della velocità della forcella di replicazione, della densità di origine e dell'asimmetria della forcella¹³. Il progresso della tecnologia di sequenziamento di nuova generazione ha portato allo sviluppo di diversi metodi innovativi, come il sequenziamento dei frammenti di Okazaki (Ok-seq)^14,15, il sequenziamento del sito di inizio (ini-seq)^16,17, il sequenziamento a filamento nascente corto (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ e il sequenziamento dell'uso della polimerasi (Pu-seq)²⁰. Queste tecniche hanno fornito profili a livello di genoma dell'uso dell'origine della replicazione, della direzionalità della forcella e della terminazione della replicazione, rivelando fattori chiave coinvolti nel coordinamento della replicazione e della trascrizione. TRIPn-seq è uno dei pochi metodi in grado di rilevare direttamente la co-occupazione di trascrizione e replicazione, ampliando significativamente la nostra comprensione dell'organizzazione dinamica della replicazione e della trascrizione del DNA in condizioni fisiologiche e patologiche²¹. Nonostante le preziose informazioni fornite da questi metodi basati sul sequenziamento, il loro costo elevato e la loro natura dispendiosa in termini di tempo ne limitano l'applicazione più ampia. Pertanto, è fondamentale stabilire un metodo di rilevamento più definitivo, altamente sensibile, conveniente e rapido per visualizzare e quantificare i TRC a livello di singola cellula.

Il saggio di legatura di prossimità (PLA) in situ , noto anche come tecnologia Duolink PLA, è un metodo potente per valutare la prossimità fisica delle proteine bersaglio in sezioni di tessuto o colture cellulari. Questa tecnica genera un segnale solo quando due proteine o complessi proteici si trovano entro 40 nm l'uno dall'altro. Richiede due anticorpi primari contro le proteine bersaglio, ciascuno di una specie diversa (ad esempio, topo/coniglio, coniglio/capra o topo/capra). Dopo aver incubato il campione con questi anticorpi primari, vengono applicati anticorpi secondari noti come sonde PLA (un PLUS e uno MINUS). A differenza dei normali anticorpi secondari che si legano alle regioni costanti degli anticorpi primari, le sonde PLA sono legate in modo covalente a specifici primer di DNA. Quando le proteine bersaglio sono in stretta vicinanza (meno di 40 nm), un oligonucleotide connettore può ibridarsi con entrambe le sonde PLA, facilitando la legatura enzimatica dei loro oligonucleotidi attaccati in una molecola di DNA a lunghezza intera. Questo DNA di nuova formazione funge da marcatore surrogato per l'interazione proteica rilevata e funge da modello per l'amplificazione. Il prodotto amplificato viene quindi visualizzato utilizzando sonde oligonucleotidiche marcate in fluorescenza. Se le proteine sono distanti più di 40 nm, le sonde PLA non possono formare un modello di DNA, con conseguente assenza di segnale rilevabile. Il diagramma schematico del PLA è illustrato nella Figura 1. La prossimità e/o l'interazione sono visualizzate dalla microscopia a fluorescenza come punti fluorescenti e il numero e l'intensità di questi punti possono essere quantificati. Dalla sua invenzione nel 2002, il PLA è diventato popolare per il monitoraggio delle interazioni proteiche grazie alla sua elevata sensibilità e specificità. A differenza dei saggi basati sul sequenziamento, il PLA richiede solo piccole quantità di campioni, il che lo rende favorevole per l'analisi di campioni scarsi.

Gli studi hanno dimostrato che l'espressione della mutazione oncogenica KRAS G12D porta a conflitti di trascrizione-replicazione (^TRCs)22,23. Ad esempio, la ricerca presentata da Meng et ^al.23 indica che l'espressione ectopica di KRAS G12D nelle cellule epiteliali duttali pancreatiche umane (HPNE) migliora i TRC e i R-loop correlati a TRC. Per consentire il rilevamento di collisioni tra la trascrizione di RNAPII e i macchinari di replicazione nelle linee cellulari, forniamo un protocollo sviluppato appositamente per questo scopo. Il plasmide KRAS (G12D) e il controllo del vettore sono trasfettati in cellule BEAS-2B epiteliali polmonari umane e l'espressione di KRAS (G12D), insieme al danno al DNA (γH2AX), è verificata mediante Western blot. L'accumulo di R-loop è confermato dall'analisi S9.6 dot blot, che insieme indica l'accumulo di blocchi di replicazione e l'instabilità del genoma nelle cellule che esprimono KRAS (G12D). Infine, le cellule vengono fissate su vetrini per il saggio PLA. Per il rilevamento localizzato delle collisioni, le cellule vengono prima colorate con anticorpi primari RNAPII e PCNA, quindi colorate con anticorpi secondari coniugati con sonde PLA. Una molecola di DNA circolare si forma attraverso una legatura riuscita, che funge da modello per la successiva amplificazione del cerchio rotante (RCA). I vetrini vengono quindi montati con mezzi di montaggio appropriati e visualizzati al microscopio a fluorescenza. Le immagini possono essere analizzate utilizzando ImageJ.

Protocollo

1. Produzione e trasduzione di lentivirus in linee cellulari bersaglio

1. Produzione di lentivirus²⁴
   1. Cellule di confezionamento del seme 293T a 3 × 10⁶ cellule per piastra da 10 cm in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; terreno completo) ad alto contenuto di glucosio. Coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ per altre 18-20 ore.
   2. In due provette da 1,5 mL, preparare una miscela di DNA per un totale di 24 μg di DNA plasmidico in 500 μL di Opti-MEM (terreno sierico ridotto) che contiene rispettivamente 9,2 μg di psPAX2, 2,8 μg di pMD2.G, insieme a 12 μg di plasmide pLVX-KRAS o vettore vuoto.
      NOTA: Poiché le endotossine riducono significativamente l'efficienza della trasfezione, si consiglia di rimuovere l'endotossina dal plasmide durante la purificazione.
   3. Diluire 144 μL di polietilenimmina (PEI; 1 mg/mL) in 1 mL di terreno sierico ridotto, mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
   4. Aggiungere 500 μl di PEI diluito goccia per goccia alla miscela di DNA diluito muovendo delicatamente la provetta. Incubare le miscele PEI/DNA per 15 minuti a RT.
   5. Durante l'incubazione, aspirare delicatamente il terreno dalle piastre da 10 cm precedentemente seminate. Sostituire con 10 ml di DMEM completo fresco.
   6. Dopo l'incubazione, pipettare lentamente la miscela di trasfezione DNA: PEI sulle piastre da 10 cm, facendo attenzione a non staccare le cellule.
      NOTA: Il PEI è un reagente di trasfezione comunemente usato, ma la sua concentrazione deve essere attentamente ottimizzata per bilanciare l'efficienza della trasfezione e la citotossicità. Nonostante il costo più elevato della lipofectamina 3000 (reagente di trasfezione), ha dimostrato una maggiore efficienza di trasfezione e una minore citotossicità rispetto alla PEI in alcune linee cellulari, portando a un miglioramento della produzione virale. L'elettroporazione è un'altra alternativa che utilizza impulsi elettrici per introdurre acidi nucleici nelle cellule. Sebbene efficace, richiede attrezzature specializzate e può essere più laboriosa.
   7. Far crescere le cellule per 18 ore, quindi sostituire con cura il terreno di trasfezione con 10 mL freschi di DMEM Complete contenente 25 μM di clorochina.
   8. Dopo 72 ore di trasfezione, raccogliere il terreno di coltura contenente la particella virale. Rimuovere la confezione delle celle 293T centrifugando a 500 x g per 5 min.
   9. Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,45 μm. Utilizzare direttamente il surnatante virale.
      NOTA: Il surnatante virale deve essere aliquotato e congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C per evitare la perdita di titolo.
2. Infezione lentivirale delle cellule bersaglio
   1. Seminare 2 × 10⁶ cellule bersaglio BEAS-2B in due piastre da 6 cm e crescere a 37 °C, 5% CO₂ durante la notte. Al momento della trasduzione, assicurarsi che le cellule BEAS-2B siano confluenti per circa il 70%.
   2. Rimuovere con cautela il vecchio terreno e aggiungere rispettivamente 0,5 mL di KRAS o particelle lentivirali vettoriali insieme a 3 mL di terreno RPMI-1640 completo fresco in due piastre.
   3. Far crescere le cellule a 37 °C per 18-20 ore in un incubatore al 5% di CO₂ . Sostituire il vecchio terreno contenente particelle lentivirali con 3,5 mL di terreno di coltura completo fresco e preriscaldato. Dopo 72 ore di trasduzione, raccogliere le cellule per il test successivo.
      NOTA: Se l'incubazione notturna con il virus provoca tossicità, il tempo di incubazione può essere ridotto a 4 ore. Per raggiungere l'equilibrio tra l'efficienza della trasduzione e la salute cellulare, è necessario considerare le seguenti strategie: (1) Ottimizzare la molteplicità dell'infezione; (2) Utilizzare preparati virali di alta qualità; (3) Utilizzare policationi (come il polibrene) per migliorare l'efficienza, consentendo l'uso di titoli virali più bassi e riducendo la potenziale tossicità; (4) Per gli studi a lungo termine, prendere in considerazione l'utilizzo di sistemi di espressione inducibili per controllare temporalmente l'espressione transgenica, riducendo il carico sulle cellule e minimizzando la potenziale tossicità.

2. Verifica del danno al DNA derivato da KRAS (G12D) e della formazione di R-loop

1. Confermare l'espressione genica e il danno al DNA mediante il saggio WB
   1. Aspirare il terreno di coltura dalle piastre.
   2. Lavare delicatamente le celle con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere eventuali residui o detriti.
   3. Aggiungi un piccolo volume di 1x PBS per mantenere le cellule umide durante il processo di raschiatura.
   4. Usa un raschietto per cellule, tenendolo inclinato, e raschia delicatamente le cellule dalla superficie in una direzione coerente.
      NOTA: Fare attenzione a non esercitare troppa pressione, che potrebbe danneggiare le celle.
   5. Inclinare la piastra e utilizzare una pipetta per raccogliere la sospensione cellulare in una provetta e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
   6. Preparare il tampone RIPA 1x diluendo il tampone RIPA 2x (vedere Tabella 1) e aggiungere il cocktail di inibitori della proteasi e il cocktail di inibitori della fosfatasi immediatamente prima dell'uso.
   7. Lisare il pellet cellulare con il tampone RIPA pre-raffreddato (1x) e incubare per 30 minuti con ghiaccio. Rimuovere i detriti centrifugando a 15.000 x g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford.
   8. Aggiungere 4 tamponi di caricamento del campione di sodio dodecil solfato (SDS) al surnatante e denaturare le proteine per 5 minuti a 95 °C. In primo luogo, separare 40 μg di proteine da ciascun campione in un gel per elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (PAGE) al 12,5% e quindi trasferirlo su membrane di nitrocellulosa da 0,2 μm (vedere la Tabella dei materiali).
   9. Al termine del trasferimento, bloccare le membrane con il tampone bloccante (5% di latte scremato in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,1% di Tween 20 [TBST; Tabella 1]) per 1 ora.
   10. Sciacquare brevemente la membrana con TBST, quindi incubare la membrana con anticorpi primari contro FLAG-tag (1:2500 diluizione in PBST) e γH2AX (1:1000 diluizione in PBST) (vedi Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
   11. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare la membrana con TBST 3 volte, ogni volta per 10 minuti.
   12. Immergere le membrane in anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano diluita (HRP) (1:5.000 in tampone TBST contenente il 5% di latte scremato) per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
   13. Lavare la membrana con TBST 3 volte, ogni volta per 10 minuti.
   14. Visualizzare i livelli proteici tramite i reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) (vedere la Tabella dei materiali).
2. Rilevamento di R-loop mediante Dot blot²⁵​
   1. Aspirare il terreno di coltura dalle piastre.
   2. Lavare delicatamente le celle con 1x PBS per rimuovere eventuali residui di terreno o detriti.
   3. Aggiungi un piccolo volume di 1x PBS per mantenere le cellule umide durante il processo di raschiatura.
   4. Usa un raschietto per cellule, tenendolo inclinato, e raschia delicatamente le cellule dalla superficie in una direzione coerente.
      NOTA: Fare attenzione a non esercitare troppa pressione, che potrebbe danneggiare le celle.
   5. Inclinare la piastra e utilizzare una pipetta per raccogliere la sospensione cellulare in una provetta e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
   6. Lisi 2 × 10⁶ cellule con 300 μL di tampone di lisi cellulare ghiacciato (vedere Tabella 1). Incubare con ghiaccio per 10 min. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Il pellet contiene nuclei.
   7. Utilizzare una punta a orifizio largo per risospendere ogni pellet con 300 μl di tampone di lisi nucleare pre-raffreddato (vedere la Tabella 1).
   8. Aggiungere 3 μL di 20 mg/mL di proteinasi K (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun campione e digerire per 3-5 ore a 55 °C.
   9. Aggiungere 100 μl di tampone di eluizione (vedere la tabella 1) a ciascuna provetta e mescolare accuratamente.
   10. Aggiungere 400 μL di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico (25:24:1 pH 8,0) a ciascuna provetta. Dopo un vigoroso vortice, centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C per separare il DNA dal resto del contenuto cellulare.
   11. Trasferire con cura la fase acquosa superiore nelle nuove provette.
   12. Precipitare il DNA aggiungendo al campione 1/10 di volume di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 2,5 di volume di etanolo pre-refrigerato al 100%. Mescolare accuratamente e incubare per 4 ore o per una notte a -20 °C.
       NOTA: L'aggiunta di glicogeno (vedi Tabella dei materiali) al campione può aumentare il recupero del DNA dalla precipitazione dell'etanolo. La concentrazione finale di glicogeno è di circa 0,05-1 μg/μL.
   13. Pellettare il DNA centrifugando a 12.000 x g per 30 min a 4 °C. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
   14. Sciacquare il pellet con 1 mL di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare nuovamente per 5-15 minuti a 12.000 x g a 4 °C.
   15. Eliminare il surnatante con cura per evitare di disturbare il pellet di DNA.
   16. Asciugare all'aria il pellet di DNA per 5-10 minuti.
   17. Sciogliere il pellet di DNA aggiungendo 50 μl di tampone TE preriscaldato (pH8.0) e incubare per 30 minuti a 37 °C. Misurare la concentrazione di DNA di ciascun campione.
   18. Preparare le diluizioni del DNA alle concentrazioni desiderate nel tampone TE (da 5 ng/μL a 200 ng/μL). Posizionare uniformemente 20 μl di ogni campione su una membrana di nylon caricata positivamente con un apparecchio dot-blot.
       NOTA: Per rilevare gli R-loop utilizzando un saggio di dot blot, si consiglia di applicare circa 500 ng di DNA genomico per punto. È stato dimostrato che questa quantità fornisce una sensibilità sufficiente per rilevare gli ibridi RNA-DNA quando si utilizza l'anticorpo monoclonale S9.6, che si lega specificamente a queste strutture.
   19. Immobilizzare il DNA reticolando il DNA alla membrana di nylon (vedi Tabella dei materiali) tramite l'impostazione "Auto Crosslink" del reticolante UV (1.200 μJ x 100) (vedi Tabella dei materiali).
   20. Immergere le membrane nel tampone bloccante (vedi Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi sciacquare brevemente le membrane con TBST.
   21. Incubare per una notte la membrana con l'anticorpo primario (vedi Tabella dei materiali) a 4°C. La diluizione di S9.6 è 1:1.000 in TBST contenente il 5% di BSA.
   22. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con TBST e ogni volta per 10 minuti.
   23. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario coniugato HRP in BSA al 5% in TBST a temperatura ambiente per 1 ora.
   24. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare 3 volte con TBST e ogni volta per 10 minuti.
   25. Visualizzare i livelli di R-loop tramite i reagenti ECL (Enhanced Chemiluminescence) Vedere la tabella dei materiali).

3. Saggio PLA

1. Preparazione delle cellule
   NOTA: La trasduzione delle cellule con l'oncogene KRAS G12D porta ad un aumento dei TRC, come evidenziato da un segnale PLA positivo. Questo metodo distingue efficacemente i TRC guidati da oncogeni dai livelli di fondo senza la necessità di selezione di antibiotici. Tuttavia, l'implementazione della selezione degli antibiotici dopo la trasduzione può migliorare il segnale complessivo arricchendo la popolazione di cellule trasdotte con successo, migliorando così la sensibilità e la specificità del test.
   1. Posizionare i bicchieri di copertura di 12 mm di diametro in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
   2. Seminare le cellule infettate da lentivirus in questi pozzetti 24 ore dopo l'infezione e mantenere le cellule su vetri di copertura in 500 μL di terreno RPMI-1640 completo a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Se il disegno sperimentale include la selezione dell'antibiotico per arricchire le cellule trasdotte con successo, aggiungere l'antibiotico appropriato al terreno di coltura in questa fase.
   4. Monitorare le cellule per assicurarsi che raggiungano circa il 60% di confluenza 48-72 ore dopo l'infezione.
   5. Rimuovere con cautela RPMI-1640 e pre-estrarre le cellule con NP-40 freddo allo 0,5% per 4 minuti su ghiaccio.
   6. Aggiungere direttamente 500 μl di tampone di fissazione (vedere la tabella 1) per fissare le cellule per 15 minuti a RT.
      NOTA: Si consiglia di non lavare le cellule prima della fase di fissazione in quanto ciò può causarne il distacco dalla superficie su cui stanno crescendo, soprattutto se la linea cellulare è sensibile al distacco; Pertanto, spesso si preferisce aggiungere direttamente la soluzione fissativa.
   7. Arrestare la reazione rimuovendo il tampone di fissazione e lavando accuratamente le cellule con 1x PBS 3 volte.
   8. Aspirare il PBS e aggiungere 500 μl di metanolo pre-raffreddato al 100% alle cellule.
   9. Permeabilizzare le cellule incubando a -20 °C per 15-30 min.
   10. Bloccare le celle con la soluzione a blocchi Duolink per 1 ora a RT.
2. Colorazione degli anticorpi
   1. Diluire l'anti-RNAPII di topo 8WG16 (1:500) e l'anti-PCNA di coniglio (D3H8P) (1:500) in tampone di diluizione anticorpale Duolink. Incubare le cellule con la miscela di anticorpi primari per una notte a 4 °C in una camera di umidità.
      NOTA: Eseguire il protocollo PLA utilizzando solo uno degli anticorpi primari (anti-RNAPII o anti-PCNA) omettendo l'altro. Questo aiuta a identificare qualsiasi segnale di fondo derivante da interazioni aspecifiche dei singoli anticorpi o delle sonde PLA.
   2. Rimuovere delicatamente gli anticorpi primari dai vetrini utilizzando un foglio di carta straccia privo di lanugine senza toccare le cellule. Quindi, lavare le celle 3 volte con 1x PBS.
   3. Preparare le sonde in PLA (o anticorpi secondari) secondo la seguente procedura (vedi Tabella 2), quindi mescolare e lasciare riposare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari ai vetrini e incubare in una camera di umidità per 2 ore a RT.
3. Legatura e amplificazione
   1. Eliminare la miscela di anticorpi secondari e lavare i vetrini due volte con 1 tampone A ciascuno per 5 minuti.
   2. Preparare la miscela di legatura secondo la seguente procedura (vedi Tabella 2).
   3. Applicare 15 μl di miscela di legatura su ciascun vetrino di copertura e incubare a 37 °C per 30 minuti in una camera di umidità.
   4. Lavare i vetrini due volte con 1x Buffer A ciascuno per 2 minuti.
   5. Preparare l'Amplificazione Mix secondo la seguente procedura (vedi Tabella 2).
   6. Applicare 15 μl di miscela di amplificazione su ciascun vetrino e incubare per 100 minuti a 37 °C in una camera di umidità. Scartare la miscela di amplificazione e lavare due volte con 1x Buffer B ciascuno per 10 minuti.
   7. Lavare i vetrini una volta con 0,01x buffer B per 1 min.
   8. Aspirare il buffer B e montare le slitte nel mezzo di montaggio Duolink In Situ con DAPI.
4. Analisi delle immagini e determinazione delle soglie:
   1. Quantifica il numero di fuochi PLA con ImageJ. Il software di analisi automatizzata delle immagini può aiutare a quantificare oggettivamente i segnali PLA. Scegliere una soglia di 3 o più focolai di PLA per nucleo come soglia perché meno dell'1% delle cellule di controllo acquisisce 3 focolai di PLA in condizioni non perturbate.
      NOTA: Poiché la soglia viene determinata sperimentalmente analizzando più campioni e controlli per tenere conto della variabilità, è necessario mantenere impostazioni di imaging coerenti (ad esempio, tempo di esposizione, guadagno) su tutti i campioni per garantire la comparabilità.

Risultati

γH2AX funge da biomarcatore per il danno al DNA. La sovraespressione di KRAS (G12D) compromette la stabilità genomica in queste cellule, come evidenziato dall'aumento del segnale γH2AX nell'analisi Western blot (Figura 2A). Inoltre, l'intensificazione del segnale di dot blot S9.6 nelle cellule che esprimono KRAS (G12D) rispetto ai controlli vettoriali (Figura 2B) indica che l'espressione oncogenica di KRAS porta all'accumulo ...

Discussione

Il meccanismo di trascrizione RNAPII può creare un ostacolo alla progressione della forcella di replicazione del DNA^26,27, promuovendo TRC e danni al DNA, specialmente nelle cellule tumorali^28,29. Decifrare le proteine che regolano i TRC e comprenderne i meccanismi dettagliati può aiutarci a comprendere come si verificano questi eventi dannosi e guidare lo sviluppo di n...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92014
FLAG antibody	Millipore	F7425
gamma H2AX antibody	Cell Signaling	25955
Glycogen, molecular biology grade	ThermoFisher	R0561
Image J	NIH	https://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranes	Amersham	10600004
PCNA antibody	Cell Signaling	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
Proteinase K, recombinant, PCR grade	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII antibody	SCBT	sc-56767
S9.6 antibody	Active motif	65683
UV crosslinkers	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000