АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем чувствительный и специфичный метод выявления онкоген-индуцированных конфликтов транскрипции-репликации (TRC) с использованием анализа близости-лигирования (PLA). В этом подходе используются специфические антитела, нацеленные на PCNA и фосфо-CTD RNAPII, что позволяет оценить распространенность TRC между транскрипцией РНК-полимеразы II и механизмом репликации ДНК.

Аннотация

Как репликация ДНК, так и транскрипция РНК используют геномную ДНК в качестве матрицы, что требует пространственного и временного разделения этих процессов. Конфликты между механизмами репликации и транскрипции, называемые конфликтами транскрипции и репликации (TRC), представляют значительный риск для стабильности генома, что является критическим фактором в развитии рака. Несмотря на то, что было выявлено несколько факторов, регулирующих эти коллизии, точное определение основных причин остается затруднительным из-за ограниченных инструментов для прямой визуализации и четкой интерпретации. В этом исследовании мы непосредственно визуализируем TRC с помощью анализа бесконтактного лигирования (PLA), используя антитела, специфичные к PCNA и фосфорилированному CTD РНК-полимеразы II. Этот подход позволяет точно измерять TRC между процессами репликации и транскрипции, опосредованными РНК-полимеразой II. Метод дополнительно усовершенствован за счет ковалентно конъюгированных с этими антителами праймеров ДНК в сочетании с амплификацией ПЦР с использованием флуоресцентных зондов, что обеспечивает высокочувствительные и специфичные средства обнаружения эндогенных TRC. Флуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать эти конфликты, предлагая мощный инструмент для изучения механизмов нестабильности генома, связанных с раком. Этот метод устраняет пробел в прямой визуализации TRC, позволяя проводить более всесторонний анализ и понимание основных процессов, вызывающих нестабильность генома в клетках.

Введение

Геном служит шаблоном для основных биологических процессов, включая репликацию и транскрипцию. В здоровых клетках механизм транскрипции РНК и репликации ДНК обычно взаимодействуют и пространственно и временно сегрегированы 1,2,3,4. Однако при патологических состояниях, таких как гиперэкспрессия онкогенов, это гармоничное сотрудничество может быть нарушено.

Онкогены часто стимулируют повышенный уровень транскрипции, увеличивая вероятность коллизиймежду механизмом транскрипции и репликации. Некоторые онкогены изменяют архитектуру хроматина, делая ее более доступной для транскрипции, но потенциально препятствуяпрогрессированию репликационной вилки5. Кроме того, активация онкогена может вызывать репликационный стресс за счет ускорения клеточного цикла6. Активность РНК-полимеразы II (RNAPII) значительно повышается во время фазового перехода G1/S из-за фосфорилирования Rb циклин-зависимой киназой (CDK), которое высвобождает факторы транскрипции E2F, способствующие транскрипции основных белков, включая циклины, CDK и гены хозяйственной части7. Экспрессия гена гистонов достигает пика во время S-фазы, совпадая с репликацией ДНК8. Более того, для расшифровки полноразмерных транскриптов некоторых очень длинных генов требуется более одного клеточногоцикла9. При каждом вступлении в S-фазу одновременная активность механизмов транскрипции и репликации в одних и тех же областях генома может привести к пагубным столкновениям, ведущим к конфликтам. Эти конфликты являются основным внутренним источником нестабильности генома, которая тесно связана с онкогенезом. Важным вопросом остается вопрос о том, как механизм репликации координируется с транскрипцией RNAPII для предотвращения вредных коллизий и поддержания стабильности генома. Таким образом, прямая визуализация RNAPII-ассоциированных конфликтов транскрипции и репликации (TRC) стала важной для понимания молекулярных механизмов, которые разрешают эти конфликты, и в конечном итоге может заложить основу для использования этих конфликтов в терапевтических целях.

Конфликты транскрипции и репликации (TRC) могут возникать в двух направлениях: лобовом, когда транскрипция и репликация развиваются навстречу друг другу, и сонаправленном, когда они движутся в одном направлении. Лобовые столкновения гораздо более разрушительны, чем сонаправленные 10,11,12,13. Образование гибридов ДНК-РНК (R-петель) было определено как основной движущий фактор TRC; таким образом, значительное количество исследований позволило сделать вывод о присутствии TRC путем оценки возникновения R-петель и их областей в ответ на нерегулируемую репликацию и/или транскрипцию 10,11. Тем не менее, служит ли накопление R-петель, полученных от транскрипции, пропорциональным препятствием для репликации и напрямую коррелирует с TRC, остается нерешенным вопросом. Исследователи также исследовали TRC, анализируя динамику репликационной вилки. Например, двумерный гель-электрофорез репортерных генов может выявить локус-специфичную реплисомную паузу12, в то время как анализ волокон ДНК позволяет исследователям изучить изменения скорости репликационной вилки, исходной плотности и асимметриивилки13. Развитие технологии секвенирования нового поколения привело к разработке нескольких инновационных методов, таких как секвенирование фрагментов Окадзаки (Ok-seq)14,15, секвенирование сайта инициации (ini-seq)16,17, секвенирование коротких зарождающихся нитей (SNS-seq)18, Repli-seq19 и секвенирование с использованием полимеразы (Pu-seq)20. Эти методы позволили получить полногеномные профили использования источника репликации, направленности вилки и окончания репликации, выявив ключевые факторы, участвующие в координации репликации и транскрипции. TRIPn-seq является одним из немногих методов, способных непосредственно обнаруживать совместное занятие транскрипции и репликации, что значительно расширяет наши представления о динамической организации репликации и транскрипции ДНК в физиологических и патологическихусловиях. Несмотря на ценную информацию, которую дают эти методы, основанные на секвенировании, их высокая стоимость и трудоемкий характер ограничивают их более широкое применение. Поэтому крайне важно разработать более точный, высокочувствительный, удобный и быстрый метод обнаружения для визуализации и количественного определения TRC на уровне отдельных клеток.

Анализ близкого лигирования in situ (PLA), также известный как технология Duolink PLA, является мощным методом оценки физической близости белков-мишеней в срезах тканей или клеточных культурах. Эта методика генерирует сигнал только тогда, когда два белка или белковых комплекса находятся в пределах 40 нм друг от друга. Для этого требуются два первичных антитела против целевых белков, каждый из которых принадлежит разным видам (например, мышь/кролик, кролик/коза или мышь/коза). После инкубации образца с этими первичными антителами применяются вторичные антитела, известные как зонды PLA (один ПЛЮС и один МИНУС). В отличие от обычных вторичных антител, которые связываются с постоянными областями первичных антител, зонды PLA ковалентно связаны со специфическими праймерами ДНК. Когда белки-мишени находятся в непосредственной близости (менее 40 нм), соединительный олигонуклеотид может гибридизоваться с обоими зондами PLA, облегчая ферментативное лигирование присоединенных к ним олигонуклеотидов в полноразмерную молекулу ДНК. Эта новообразованная ДНК служит суррогатным маркером для обнаруженного белкового взаимодействия и выступает в качестве матрицы для амплификации. Затем амплифицированный продукт визуализируют с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов. Если белки находятся на расстоянии более 40 нм друг от друга, зонды PLA не могут сформировать матрицу ДНК, что приводит к отсутствию обнаруживаемого сигнала. Принципиальная схема PLA изображена на рисунке 1. Близость и/или взаимодействие визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии в виде флуоресцентных точек, а количество и интенсивность этих точек могут быть количественно определены. С момента своего изобретения в 2002 году PLA стал популярным для мониторинга белковых взаимодействий благодаря своей высокой чувствительности и специфичности. В отличие от анализов, основанных на секвенировании, PLA требует лишь небольшого количества образцов, что делает его благоприятным для анализа дефицитных образцов.

Исследования показали, что экспрессия онкогенной мутации KRAS G12D приводит к конфликтам транскрипции и репликации (TRCs)22,23. Например, исследование, представленное Meng et al.23, показывает, что эктопическая экспрессия KRAS G12D в клетках протокового эпителия поджелудочной железы человека (HPNE) усиливает TRC и связанные с TRC R-петли. Чтобы обеспечить обнаружение коллизий между механизмами транскрипции и репликации RNAPII в клеточных линиях, мы предоставляем протокол, специально разработанный для этой цели. Плазмида KRAS (G12D) и векторный контроль трансфицируются в эпителиальные клетки легких человека BEAS-2B, а экспрессия KRAS (G12D), наряду с повреждением ДНК (γH2AX), подтверждается вестерн-блоттингом. Накопление R-петли подтверждено анализом S9.6 dot blot, который в совокупности указывает на накопление препятствий репликации и нестабильность генома в клетках, экспрессирующих KRAS (G12D). Наконец, клетки фиксируются на предметных стеклах для анализа PLA. Для локализованного обнаружения коллизий клетки сначала окрашивают первичными антителами RNAPII и PCNA, а затем окрашивают вторичными антителами, конъюгированными с зондами PLA. Кольцевая молекула ДНК образуется в результате успешного лигирования, служа матрицей для последующей амплификации по скользящему кругу (RCA). Затем предметные стекла монтируются с помощью соответствующих монтажных сред и визуализируются под флуоресцентным микроскопом. Изображения могут быть проанализированы с помощью ImageJ.

протокол

1. Производство лентивируса и его трансдукция в линию клеток-мишеней

  1. Производство лентивирусов24
    1. Засейте 293T упаковочных ячеек при 3 × 106 клеток на 10 см-пластину в модифицированную орлиную среду с высоким содержанием глюкозы Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; полная среда). Выращивайте клетки при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение дополнительных 18-20 часов.
    2. В двух пробирках объемом 1,5 мл приготовьте смесь ДНК из 24 мкг плазмидной ДНК в 500 мкл Opti-MEM (восстановленная сывороточная среда), которая содержит 9,2 мкг psPAX2, 2,8 мкг pMD2.G, а также 12 мкг плазмиды pLVX-KRAS или пустого вектора соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эндотоксины значительно снижают эффективность трансфекции, рекомендуется удалять эндотоксин из плазмиды во время очистки.
    3. Разведите 144 мкл полиэтиленимина (ПЭИ; 1 мг/мл) в 1 мл восстановленной сывороточной среды, перемешайте и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре (ОТ).
    4. Добавьте 500 μл разбавленного PEI по каплям в разбавленную смесь ДНК, осторожно переворачивая пробирку. Инкубируйте смеси PEI/DNA в течение 15 минут при RT.
    5. Во время инкубации аккуратно отсасывайте среду из ранее засеянных 10 см пластин. Замените 10 мл свежего полного DMEM.
    6. После инкубации медленно пипетируйте ДНК: перемешайте ДНК: ПЭИ на 10-сантиметровые пластины, следя за тем, чтобы клетки не отделились.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭИ является широко используемым реагентом для трансфекции, но его концентрация должна быть тщательно оптимизирована, чтобы сбалансировать эффективность трансфекции и цитотоксичность. Несмотря на более высокую стоимость Липофектамина 3000 (реагент для трансфекции), он продемонстрировал более высокую эффективность трансфекции и меньшую цитотоксичность по сравнению с PEI в некоторых клеточных линиях, что привело к улучшению вирусной продукции. Электропорация является еще одной альтернативой, которая использует электрические импульсы для введения нуклеиновых кислот в клетки. Несмотря на свою эффективность, он требует специализированного оборудования и может быть более трудоемким.
    7. Выращивайте клетки в течение 18 ч, затем осторожно замените трансфекционную среду свежей 10 мл среды DMEM Complete, содержащей 25 мкМ хлорохина.
    8. Через 72 ч после трансфекции соберите питательную среду, содержащую вирусную частицу. Извлеките упаковочные элементы 293T путем центрифугирования при 500 х г в течение 5 мин.
    9. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,45 мкм. Используйте непосредственно вирусный надосадочный ток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный надосадочный продукт следует аликвотировать и заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C во избежание потери титра.
  2. Лентивирусная инфекция клеток-мишеней
    1. Засейте 2 ×10 6 клеток-мишеней BEAS-2B в две 6-сантиметровые пластины и вырастите при 37 °C, 5%CO2 в течение ночи. После трансдукции убедитесь, что клетки BEAS-2B слиты примерно на 70%.
    2. Осторожно удалите старую среду и добавьте соответствующие 0,5 мл KRAS или векторных лентивирусных частиц вместе с 3 мл свежей полной среды RPMI-1640 в две пластины соответственно.
    3. Выращивайте клетки при 37 °C в течение 18-20 часов в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 . Замените старую среду, содержащую лентивирусные частицы, 3,5 мл свежей предварительно подогретой полной питательной среды. После 72 ч трансдукции соберите клетки для следующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ночная инкубация с вирусом вызывает токсичность, время инкубации можно сократить до 4 часов. Для достижения баланса эффективности трансдукции и клеточного здоровья необходимо рассмотреть следующие стратегии: (1) Оптимизация множественности инфекции; (2) Использовать высококачественные вирусные препараты; (3) Использование поликатионов (таких как полибрен) для повышения эффективности, что позволяет использовать более низкие титры вирусов и снижать потенциальную токсичность; (4) Для долгосрочных исследований рассмотрите возможность использования индуцируемых систем экспрессии для временного контроля экспрессии трансгенов, снижая нагрузку на клетки и сводя к минимуму потенциальную токсичность.

2. Верификация повреждений ДНК, полученных из KRAS (G12D) и образования R-петли

  1. Подтвердите экспрессию генов и повреждение ДНК с помощью анализа WB
    1. Отсадите питательную среду из пластин.
    2. Аккуратно промойте клетки 1x фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки среды или мусора.
    3. Добавьте небольшой объем 1x PBS, чтобы клетки оставались влажными в процессе соскабливания.
    4. Используйте скребок для клеток, держа его под углом, и аккуратно соскребите клетки с поверхности в последовательном направлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не оказывайте слишком большое давление, которое может повредить клетки.
    5. Наклоните планшет и с помощью пипетки соберите клеточную суспензию в пробирку и вращайте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Приготовьте 1x буфер RIPA, разбавив 2x буфер RIPA (см. Таблицу 1), и добавьте коктейль ингибиторов протеазы и коктейль ингибиторов фосфатазы непосредственно перед использованием.
    7. Лизируйте клеточную гранулу с помощью предварительно охлажденного буфера RIPA (1x) и инкубируйте в течение 30 минут на льду. Удалите мусор центрифугированием при давлении 15 000 x g в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    8. Добавьте 4 буфера для загрузки образцов додецилсульфата натрия (SDS) в надосадочную жидкость и денатурируйте белки на 5 минут при 95 °C. Сначала отделите 40 г белка от каждого образца в геле для электрофореза (PAGE) с 12,5% SDS-полиакриламидным гелем для электрофореза (PAGE), а затем перенесите его на мембраны из нитроцеллюлозы размером 0,2 мкм (см. Таблицу материалов).
    9. После завершения переноса заблокируйте мембраны с помощью блокирующего буфера (5% обезжиренного молока в трис-буферном физрастворе, содержащем 0,1% Tween 20 [TBST; Таблица 1]) за 1 ч.
    10. Кратковременно промойте мембрану TBST, а затем инкубируйте мембрану с первичными антителами против FLAG-tag (разведение 1:2500 в PBST) и γH2AX (разведение 1:1000 в PBST) (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
    11. Удалите первичные антитела и промойте мембрану с помощью TBST 3 раза, каждый раз в течение 10 минут.
    12. Погрузите мембраны в разведенные вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (1:5000 в буфере TBST, содержащем 5% обезжиренного молока) на 1 ч при комнатной температуре (ЛТ).
    13. Промойте мембрану TBST 3 раза, каждый раз в течение 10 минут.
    14. Визуализируйте уровни белка с помощью реагентов с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (см. Таблицу материалов).
  2. Определение R-петли с помощью Dot blot25​
    1. Отсадите питательную среду из пластин.
    2. Аккуратно промойте ячейки с помощью 1x PBS, чтобы удалить остатки среды или мусора.
    3. Добавьте небольшой объем 1x PBS, чтобы клетки оставались влажными в процессе соскабливания.
    4. Используйте скребок для клеток, держа его под углом, и аккуратно соскребите клетки с поверхности в последовательном направлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не оказывайте слишком большое давление, которое может повредить клетки.
    5. Наклоните планшет и с помощью пипетки соберите клеточную суспензию в пробирку и вращайте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Лиз 2 × 106 клеток с 300 мкл ледяного буфера для лизиса клеток (см. Таблицу 1). Выдерживать на льду в течение 10 минут. Отжимайте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Гранула содержит ядра.
    7. Используйте наконечник с широким отверстием для повторного суспендирования каждой гранулы с 300 мкл предварительно охлажденного буфера для ядерного лизиса (см. Таблицу 1).
    8. Добавьте 3 мкл 20 мг/мл протеиназы К (см. Таблицу материалов) в каждый образец и разваривайте в течение 3-5 ч при 55 °C.
    9. Добавьте 100 μL элюирующего буфера (см. Таблицу 1) в каждую пробирку и тщательно перемешайте.
    10. Добавьте 400 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1 pH 8,0) в каждую пробирку. После энергичного вихря центрифугируйте при 12 000 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы отделить ДНК от другого содержимого клеток.
    11. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новые трубки.
    12. Осаждение ДНК путем добавления в образец 1/10 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 2,5 объема предварительно охлажденного 100% этанола. Тщательно перемешайте и выдержите в течение 4 часов или в течение ночи при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление гликогена (см. Таблицу материалов) в образец может увеличить восстановление ДНК после осаждения этанола. Конечная концентрация гликогена составляет около 0,05-1 мкг/мкл.
    13. Гранулируйте ДНК центрифугированием при 12 000 x g в течение 30 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
    14. Промойте гранулу 1 мл ледяного 70% этанола и снова центрифугируйте в течение 5-15 минут при 12 000 x g при 4 °C.
    15. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы не повредить гранулу ДНК.
    16. Высушите гранулу ДНК на воздухе в течение 5-10 минут.
    17. Растворите гранулу ДНК, добавив 50 мкл предварительно подогретого TE буфера (pH8,0), и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. Измерьте концентрацию ДНК в каждом образце.
    18. Приготовьте разведения ДНК до желаемых концентраций в TE-буфере (от 5 нг/мкл до 200 нг/мкл). Равномерно нанесите 20 мкл каждого образца на положительно заряженную нейлоновую мембрану с помощью аппарата для дот-блоттинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения R-петель с помощью анализа дот-блоттинга рекомендуется применять примерно 500 нг геномной ДНК на точку. Показано, что это количество обеспечивает достаточную чувствительность для детектирования РНК-ДНК-гибридов при использовании моноклонального антитела S9.6, которое специфически связывается с этими структурами.
    19. Иммобилизуйте ДНК путем сшивки ДНК с нейлоновой мембраной (см. Таблицу материалов) с помощью УФ-сшивающего агента с настройкой «Auto Crosslink» (1 200 μJ x 100) (см. Таблицу материалов).
    20. Погрузите мембраны в блокирующий буфер (см. Таблицу 1) на 1 час при комнатной температуре. Затем коротко промойте мембраны с помощью TBST.
    21. В течение ночи инкубируйте мембрану с первичным антителом (см. Таблицу материалов) при 4°C. Разведение S9.6 составляет 1:1000 в TBST, содержащем 5% BSA.
    22. Удалите первичное антитело и промойте 3 раза TBST, причем каждый раз в течение 10 минут.
    23. Инкубируют мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом в 5% BSA в TBST при комнатной температуре в течение 1 ч.
    24. Удалите вторичное антитело и промойте 3 раза TBST, причем каждый раз по 10 мин.
    25. Визуализируйте уровни R-петли с помощью реагентов ECL (усиленная хемилюминесценция) (см. Таблицу материалов).

3. Пробирный анализ PLA

  1. Подготовка клеток
    Примечание: Трансдукция клеток онкогеном KRAS G12D приводит к увеличению TRC, о чем свидетельствует положительный сигнал PLA. Этот метод эффективно отличает онкоген-индуцированные TRC от фоновых уровней без необходимости выбора антибиотиков. Тем не менее, осуществление выбора антибиотика после трансдукции может усилить общий сигнал за счет обогащения популяции успешно трансдуцированных клеток, тем самым улучшая чувствительность и специфичность анализа.
    1. Поместите защитные стекла диаметром 12 мм в каждую лунку 12-луночного планшета.
    2. Посейте инфицированные лентивирусом клетки в эти лунки через 24 ч после заражения и поддерживайте клетки на покровных стеклах в 500 мкл полной среды RPMI-1640 при температуре 37 °C с 5%CO2.
    3. Оптимальный) Если план эксперимента включает выбор антибиотика для обогащения успешно трансдуцированных клеток, добавьте соответствующий антибиотик в питательную среду на этом этапе.
    4. Следите за клетками, чтобы убедиться, что они достигают примерно 60% слияния через 48-72 часа после заражения.
    5. Осторожно удалить RPMI-1640 и предварительно извлечь клетки холодным 0,5% NP-40 на 4 мин на льду.
    6. Добавьте 500 мкл фиксирующего буфера (см. Таблицу 1) непосредственно для фиксации ячеек на 15 мин при ОТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется не мыть клетки перед этапом фиксации, так как это может привести к их отделению от поверхности, на которой они растут, особенно если клеточная линия чувствительна к отслоению; Поэтому часто предпочтительнее прямое добавление фиксирующего раствора.
    7. Остановите реакцию, удалив фиксирующий буфер и тщательно промыв клетки 1x PBS 3 раза.
    8. Отсадите PBS и добавьте в клетки 500 мкл предварительно охлажденного 100% метанола.
    9. Пермеабилизируйте клетки путем инкубации при -20 °C в течение 15-30 минут.
    10. Блокируйте ячейки с помощью блочного решения Duolink на 1 час в RT.
  2. Окрашивание антителами
    1. Разведите мышиный анти-RNAPII 8WG16 (1:500) и кроличий анти-PCNA (D3H8P) (1:500) в буфере для разведения антител Duolink. Инкубируйте клетки со смесью первичных антител в течение ночи при 4 °C в камере влажности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте протокол PLA, используя только одно из первичных антител (либо анти-RNAPII, либо анти-PCNA), исключая другое. Это помогает идентифицировать любой фоновый сигнал, возникающий в результате неспецифических взаимодействий отдельных антител или зондов PLA.
    2. Аккуратно удалите первичные антитела со стекол с помощью безворсового листа макулатуры, не касаясь клеток. Затем промойте клетки 3 раза 1x PBS.
    3. Приготовьте зонды PLA (или вторичное антитело) в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2), затем перемешайте и дайте постоять 20 минут при комнатной температуре.
    4. Добавьте вторичную смесь антител на предметные стекла и инкубируйте во влажной камере в течение 2 ч при РТ.
  3. Лигирование и амплификация
    1. Выбросьте вторичную смесь антител и дважды промойте предметные стекла 1x буфером А каждый в течение 5 минут.
    2. Приготовьте смесь для лигирования в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2).
    3. Нанесите 15 мкл смеси для лигирования на каждое предметное стекло и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут в камере влажности.
    4. Дважды вымойте предметные стекла с 1x буфером A каждая в течение 2 минут.
    5. Приготовьте смесь для усиления в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2).
    6. Нанесите 15 мкл амплификационной смеси на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 100 мин при 37 °C в камере с влажностью. Выбросьте смесь для усиления и дважды промойте 1x Buffer B каждый в течение 10 минут.
    7. Промойте предметные стекла один раз с 0,01x буфером B в течение 1 минуты.
    8. Отберите буфер B и установите направляющие в монтажную среду Duolink In Situ с DAPI.
  4. Анализ изображений и определение пороговых значений:
    1. Количественное определение количества очагов PLA с помощью ImageJ. Программное обеспечение для автоматизированного анализа изображений может помочь в объективной количественной оценке сигналов PLA. Выберите порог в 3 или более очагов PLA на ядро в качестве порога, потому что менее 1% контрольных клеток приобретают 3 очага PLA в невозмутимых условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пороговое значение определяется экспериментально путем анализа нескольких образцов и контрольных образцов для учета вариабельности, для обеспечения сопоставимости необходимо поддерживать согласованные настройки изображения (например, время экспозиции, усиление) для всех образцов.

Результаты

γH2AX служит биомаркером повреждения ДНК. Сверхэкспрессия KRAS (G12D) нарушает стабильность генома в этих клетках, о чем свидетельствует повышенный сигнал γH2AX при вестерн-блоттинге (рис. 2A). Кроме того, усиленный сигнал S9.6 dot blot в клетках, экспрессирующих KRAS (G1...

Обсуждение

Механизм транскрипции RNAPII может создавать препятствия для прогрессирования репликационной вилкиДНК 26,27, способствуя образованию TRC и повреждению ДНК, особенно в раковых клетках28,29. Расшифровка белков, к...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием стартапа Университета Южного Китая.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
Duolink In Situ Detection Reagents GreenSigmaDUO92014
FLAG antibodyMilliporeF7425
gamma H2AX antibodyCell Signaling25955
Glycogen, molecular biology gradeThermoFisherR0561
Image JNIHhttps://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranes Amersham10600004
PCNA antibodyCell Signaling13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.G Addgene 12259
Proteinase K, recombinant, PCR gradeThermoFisherEO0491
psPAX2Addgene 12260
RNAPII antibodySCBTsc-56767
S9.6 antibodyActive motif65683
UV crosslinkersFisher ScientificFB-UVXL-1000

Ссылки

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 553-563 (2016).
  3. Hamperl, S., Cimprich, K. A. Conflict resolution in the genome: how transcription and replication make it work. Cell. 167 (6), 1455-1467 (2016).
  4. Merrikh, H., Zhang, Y., Grossman, A. D., Wang, J. D. Replication-transcription conflicts in bacteria. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 449-458 (2012).
  5. Kotsantis, P., Petermann, E., Boulton, S. J. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: Jigsaw falling into place. Cancer Discov. 8 (5), 537-555 (2018).
  6. Gnan, S., Liu, Y., Spagnuolo, M., Chen, C. -. L. The impact of transcription-mediated replication stress on genome instability and human disease. Genome Instab Dis. 1, 207-234 (2020).
  7. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 8518-8528 (2013).
  8. Stein, G. S., Stein, J. L., Van Wijnen, A. J., Lian, J. B. Transcriptional control of cell cycle progression: the histone gene is a paradigm for the G1/S phase and proliferation/differentiation transitions. Cell Biol Int. 20 (1), 41-49 (1996).
  9. Helmrich, A., Ballarino, M., Tora, L. Collisions between replication and transcription complexes cause common fragile site instability at the longest human genes. Mol Cell. 44 (6), 6966-6977 (2011).
  10. Lang, K. S., et al. Replication-transcription conflicts generate R-loops that orchestrate bacterial stress survival and pathogenesis. Cell. 170 (4), 787-799 (2017).
  11. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  12. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. EMBO J. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  13. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Mechanisms of transcription-replication collisions in bacteria. Mol Cell Biol. 25 (3), 888-895 (2005).
  14. Chen, Y. H., et al. Transcription shapes DNA replication initiation and termination in human cells. Nat Struct. Mol Biol. 26 (1), 167-177 (2019).
  15. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 110208 (2016).
  16. Guilbaud, G., Murat, P., Wilkes, H. S., Lerner, L. K., Sale, J. E., Krude, T. Determination of human DNA replication origin position and efficiency reveals principles of initiation zone organisation. Nucleic Acids Res. 50 (13), 7436-7450 (2022).
  17. Langley, A. R., Gräf, S., Smith, J. C., Krude, T. Genome-wide identification and characterisation of human DNA replication origins by initiation site sequencing (ini-seq). Nucleic Acids Res. 44 (21), 10230-10247 (2016).
  18. Besnard, E., et al. Unraveling cell type-specific and reprogrammable human replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 837-844 (2012).
  19. Zhao, P. A., Sasaki, T., Gilbert, D. M. High-resolution Repli-Seq defines the temporal choreography of initiation, elongation and termination of replication in mammalian cells. Genome Biol. 21 (1), 176 (2020).
  20. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221 (2022).
  21. St Germain, C. P., Zhao, H., Sinha, V., Sanz, L. A., Chédin, F., Barlow, J. H. Genomic patterns of transcription-replication interactions in mouse primary B cells. Nucleic Acids Res. 50 (4), 2051-2073 (2022).
  22. Edwards, D. S., et al. BRD4 prevents R-Loop formation and transcription-replication conflicts by ensuring efficient transcription elongation. Cell Rep. 32 (12), 108166 (2020).
  23. Meng, F., et al. Base-excision repair pathway regulates transcription-replication conflicts in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep. 43 (10), 114820 (2024).
  24. Pirona, A. C., Oktriani, R., Boettcher, M., Hoheisel, J. D. Process for an efficient lentiviral cell transduction. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa005 (2020).
  25. Ramirez, P., Crouch, R. J., Cheung, V. G., Grunseich, C. R-Loop analysis by dot-blot. J Vis Exp. 167, e62069 (2021).
  26. Gómez-González, B., Aguilera, A. Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes Dev. 33 (15-16), 1008-1026 (2019).
  27. Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V., Macek, B., Popov, N. RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nat Commun. 14 (1), 5147 (2023).
  28. Zardoni, L., et al. Elongating RNA polymerase II and RNA:DNA hybrids hinder fork progression and gene expression at sites of head-on replication-transcription collisions. Nucleic Acids Res. 49 (22), 12769-12784 (2021).
  29. Xiao, Y., et al. Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing. Nat Methods. 21, 247-258 (2024).
  30. Tang, J., et al. Enhancing transcription-replication conflict targets ecDNA-positive cancers. Nature. 635, 210-218 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

TRCsIIPCNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены