종양유전자 유래 전사-복제 충돌을 연구하기 위한 근접 결찰 분석

요약

여기에서는 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 종양유전자 유도 전사-복제 충돌(TRC)을 감지하는 민감하고 구체적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 PCNA 및 phospho-CTD RNAPII를 표적으로 하는 특정 항체를 활용하여 RNA 중합효소 II 전사와 DNA 복제 기계 간의 TRC 유병률을 평가할 수 있습니다.

초록

DNA 복제와 RNA 전사는 모두 게놈 DNA를 주형으로 활용하므로 이러한 과정의 공간적, 시간적 분리가 필요합니다. 전사-복제 충돌(transcription-replication conflict, TRCs)이라고 하는 복제 기계와 전사 기계 간의 충돌은 암 발병에 중요한 요소인 게놈 안정성에 상당한 위험을 초래합니다. 이러한 충돌을 조절하는 몇 가지 요인이 확인되었지만, 직접적인 시각화와 명확한 해석을 위한 도구가 제한되어 있기 때문에 주요 원인을 정확히 파악하는 것은 여전히 어렵습니다. 이 연구에서는 RNA 중합효소 II의 PCNA 및 인산화 CTD에 특이적인 항체를 활용하여 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 TRC를 직접 시각화합니다. 이 접근법을 사용하면 RNA 중합효소 II에 의해 매개되는 복제와 전사 과정 사이의 TRC를 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 방법은 형광 프로브를 사용한 PCR 증폭과 결합된 이러한 항체에 공유 결합된 DNA 프라이머를 통해 더욱 향상되어 내인성 TRC를 검출하는 매우 민감하고 특이적인 수단을 제공합니다. 형광 현미경 검사는 이러한 충돌을 시각화하여 암과 관련된 게놈 불안정성 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술은 직접 TRC 시각화의 격차를 해소하여 세포의 게놈 불안정성을 유발하는 기본 프로세스를 보다 포괄적으로 분석하고 이해할 수 있도록 합니다.

서문

게놈은 복제 및 전사를 포함한 필수 생물학적 과정의 템플릿 역할을 합니다. 건강한 세포에서는 RNA 전사 및 DNA 복제 기계가 일반적으로 협력하며 공간적, 시간적으로 분리됩니다 1,2,3,4. 그러나 종양유전자 과발현과 같은 병리학적 조건에서는 이러한 조화로운 협력이 중단될 수 있습니다.

종양유전자(oncogenes)는 종종 전사 수준을 높여 전사 기계와 복제 기계 간의 충돌 가능성을 높입니다⁵. 일부 종양유전자는 염색질 구조를 변경하여 전사에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하지만 잠재적으로 복제 포크 진행을 방해할 수 있습니다⁵. 또한 종양유전자 활성화는 세포주기를 가속화하여 복제 스트레스를 유발할 수 있습니다⁶. RNA 중합효소 II(RNAPII) 활성은 사이클린, CDK 및 하우스키핑 유전자를 포함한 필수 단백질의 전사를 촉진하는 E2F 전사 인자를 방출하는 Rb의 사이클린 의존성 키나아제(CDK) 인산화로 인해 G1/S 상 전이 동안 크게 증가합니다⁷. 히스톤 유전자 발현은 DNA 복제⁸과 일치하는 S기 동안 최고조에 달합니다. 더욱이, 매우 긴 유전자의 full-length transcripts를 전사하는 것은 하나 이상의 세포주기(cell cycle)를 필요로 한다⁹. S 단계로 진입할 때마다 동일한 게놈 영역에서 전사 및 복제 기계의 동시 활동은 해로운 만남을 초래하여 충돌을 유발할 수 있습니다. 이러한 충돌은 게놈 불안정성의 주요 내재적 원인이며, 이는 종양 형성과 밀접한 관련이 있습니다. 복제 기계가 RNAPII 전사와 어떻게 조율하여 유해한 충돌을 방지하고 게놈 안정성을 유지하는지는 여전히 중요한 질문으로 남아 있습니다. 따라서 RNAPII 관련 전사-복제 충돌(TRC)의 직접 시각화는 이러한 충돌을 해결하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 필수적이 되었으며 결국 이러한 충돌을 치료 목적으로 활용하기 위한 토대를 마련할 수 있습니다.

전사-복제 충돌(TRC)은 두 가지 방향으로 나타날 수 있습니다: 전사와 복제가 서로를 향해 진행되는 정면 충돌과 같은 방향으로 이동하는 공동 방향성. 정면 충돌은 동일 방향 충돌보다 훨씬 더 파괴적입니다 10,11,12,13. DNA-RNA 하이브리드(R-루프)의 형성은 TRC의 주요 동인으로 확인되었습니다. 따라서, 상당한 양의 연구에서 조절 장애 복제 및/또는 전사에 대한 반응으로 R-루프의 발생과 그 영역을 평가하여 TRC의 존재를 추론했습니다^10,11. 그러나 전사 유래 R-루프의 축적이 복제에 대한 비례 장애물로 작용하고 TRC와 직접적인 상관 관계가 있는지 여부는 해결되지 않은 질문으로 남아 있습니다. 연구원들은 또한 복제 분기점 역학을 분석하여 TRC를 조사했습니다. 예를 들어, 리포터 유전자의 2차원 겔 전기영동은 유전자좌 특이적 리플리솜 일시 중지¹²를 밝혀낼 수 있으며, DNA 섬유 분석을 통해 연구자들은 복제 포크 속도, 기원 밀도 및 포크 비대칭¹³의 변화를 조사할 수 있습니다. 차세대 염기서열분석 기술의 발전으로 오카자키 단편 염기서열분석(Ok-seq)^14,15, 시작 부위 염기서열분석(ini-seq)^16,17, 짧은 초기 가닥 염기서열분석(SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ 및 중합효소 사용 염기서열분석(Pu-seq)²⁰과 같은 여러 혁신적인 방법이 개발되었습니다. 이러한 기술은 복제 기원 사용, 포크 방향성 및 복제 종료에 대한 게놈 전체 프로필을 제공하여 복제 및 전사의 조정과 관련된 주요 요인을 밝혔습니다. TRIPn-seq는 전사 및 복제 동시 점유를 직접 감지할 수 있는 몇 안 되는 방법 중 하나로, 생리학적 및 병리학적 조건에서 DNA 복제 및 전사의 동적 조직에 대한 이해를 크게 확장했습니다²¹. 이러한 염기서열분석 기반 방법이 제공하는 귀중한 통찰력에도 불구하고 높은 비용과 시간 집약적인 특성으로 인해 광범위한 응용 분야에 제한이 있습니다. 따라서 단일 세포 수준에서 TRC를 시각화하고 정량화하기 위해 보다 명확하고 민감하며 편리하고 신속한 검출 방법을 확립하는 것이 중요합니다.

Duolink PLA 기술이라고도 하는 현장 근접 결찰 분석(PLA)은 조직 절편 또는 세포 배양에서 표적 단백질의 물리적 근접성을 평가하는 강력한 방법입니다. 이 기술은 두 개의 단백질 또는 단백질 복합체가 서로 40nm 이내에 있을 때만 신호를 생성합니다. 표적 단백질에 대한 두 가지 기본 항체가 필요하며, 각각 다른 종(예: 마우스/토끼, 토끼/염소 또는 마우스/염소)에서 유래했습니다. 이러한 1차 항체로 샘플을 배양한 후 PLA 프로브(PLUS 1개 및 MINUS 1개)로 알려진 2차 항체를 적용합니다. 1차 항체의 일정한 영역에 결합하는 일반 2차 항체와 달리 PLA 프로브는 특정 DNA 프라이머에 공유 연결되어 있습니다. 표적 단백질이 근접(40nm 미만)에 있을 때 커넥터 올리고뉴클레오티드는 두 PLA 프로브와 혼성화하여 부착된 올리고뉴클레오티드의 효소 결찰을 전체 길이 DNA 분자로 촉진할 수 있습니다. 이 새로 형성된 DNA는 검출된 단백질 상호 작용에 대한 대리 마커 역할을 하며 증폭을 위한 템플릿 역할을 합니다. 그런 다음 증폭된 산물은 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 시각화됩니다. 단백질이 40nm 이상 떨어져 있으면 PLA 프로브가 DNA 템플릿을 형성할 수 없어 감지할 수 있는 신호가 발생하지 않습니다. PLA의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 근접성 및/또는 상호 작용은 형광 현미경 검사에 의해 형광 점으로 시각화되며, 이러한 점의 수와 강도를 정량화할 수 있습니다. PLA는 2002년에 발명된 이래 높은 감도와 특이성으로 인해 단백질 상호 작용을 모니터링하는 데 널리 사용되었습니다. 염기서열분석 기반 분석과 달리 PLA는 소량의 샘플만 필요하므로 부족한 샘플을 분석하는 데 유리합니다.

연구에 따르면 발암성 KRAS G12D 돌연변이의 발현은 전사-복제 충돌(TRC)을 유발합니다^22,23. 예를 들어, Meng 등^[23]이 발표한 연구에 따르면 인간 췌관 상피(HPNE) 세포에서 KRAS G12D의 이소성 발현은 TRC 및 TRC 관련 R-루프를 향상시킵니다. 세포주에서 RNAPII 전사와 복제 기계 간의 충돌을 감지할 수 있도록 당사는 이러한 목적을 위해 특별히 개발된 프로토콜을 제공합니다. KRAS (G12D) plasmid 및 vector control은 인간 폐 상피 BEAS-2B 세포에 transfection되며, KRAS (G12D) 발현은 DNA 손상 (γH2AX)과 함께 Western blot으로 검증됩니다. R-loop 축적은 S9.6 점 블롯 분석에 의해 확인되며, 이는 KRAS(G12D)를 발현하는 세포에서 복제 장애물 및 게놈 불안정성의 축적을 함께 나타냅니다. 마지막으로, 세포는 PLA 분석을 위해 슬라이드에 고정됩니다. 충돌의 국부적 감지를 위해 먼저 RNAPII 및 PCNA 1차 항체로 세포를 염색한 다음 PLA 프로브로 접합된 2차 항체로 염색합니다. 원형 DNA 분자는 성공적인 결찰을 통해 형성되어 후속 롤링 서클 증폭(RCA)을 위한 주형 역할을 합니다. 그런 다음 슬라이드를 적절한 장착 매체에 장착하고 형광 현미경으로 시각화합니다. ImageJ를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다.

프로토콜

1. 렌티바이러스 생산 및 타겟 세포주로의 transduction

1. 렌티바이러스 생산²⁴
   1. 고포도당 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM, 완전 배지)에서 10cm 플레이트당⁶ 개의 세포를 3 × 10 6개 셀로 시딩합니다. 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 추가로 18-20시간 동안 세포를 성장시킵니다.
   2. 2개의 1.5 mL 튜브에서 9.2 μg의 psPAX2, 2.8 μg의 pMD2.G와 12 μg의 pLVX-KRAS 플라스미드 또는 빈 벡터를 각각 포함하는 500 μL의 Opti-MEM(환원 혈청 배지)에 총 24 μg 플라스미드 DNA의 DNA 혼합물을 준비합니다.
      참고: 내독소는 transfection 효율을 현저히 감소시키기 때문에 정제 중에 플라스미드에서 내독소를 제거하는 것이 좋습니다.
   3. 144μL의 폴리에틸렌이민(PEI; 1mg/mL)을 환원된 혈청 배지 1mL에 희석하고 혼합한 후 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 튜브를 부드럽게 튕기면서 희석된 DNA 혼합물에 희석된 PEI 500μL를 적가합니다. RT에서 15분 동안 PEI/DNA 혼합물을 배양합니다.
   5. 배양하는 동안 이전에 파종된 10cm 플레이트에서 배지를 부드럽게 흡인합니다. 10mL의 새로운 완전 DMEM으로 교체하십시오.
   6. 배양 후 DNA: PEI transfection mix를 10cm 플레이트에 천천히 피펫팅하고 세포가 분리되지 않도록 합니다.
      참고: PEI는 일반적으로 사용되는 형질주입 시약이지만, 형질주입 효율과 세포독성의 균형을 맞추기 위해 농도를 신중하게 최적화해야 합니다. Lipofectamine 3000(transfection 시약)의 높은 비용에도 불구하고 특정 세포주에서 PEI에 비해 더 높은 transfection efficiency와 더 낮은 세포 독성을 입증하여 바이러스 생산을 개선했습니다. Electroporation은 전기 펄스를 사용하여 핵산을 세포에 도입하는 또 다른 대안입니다. 효과적이기는 하지만 특수 장비가 필요하며 노동 집약적일 수 있습니다.
   7. 18시간 동안 세포를 성장시킨 다음 트랜스펙션 배지를 25μM의 클로로퀸을 함유한 새로운 10mL의 DMEM Complete 배지로 조심스럽게 교체합니다.
   8. 형질주입 72시간 후, 바이러스 입자가 포함된 배양 배지를 채취합니다. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 포장된 293T 셀을 제거합니다.
   9. 상층액을 모아 0.45μm 폴리에테르설폰(PES) 필터를 통해 여과합니다. 바이러스 상등액을 직접 사용하십시오.
      참고: 바이러스 상등액은 분주하여 액체 질소에서 스냅 냉동해야 하며 역가 손실을 방지하기 위해 -80°C로 유지해야 합니다.
2. 표적 세포의 렌티바이러스 감염
   1. 2 × 10⁶ 타겟 세포 BEAS-2B를 6cm 플레이트 2개에 파종하고 하룻밤 동안 37°C, 5% CO₂ 에서 성장합니다. 형질도입 시 BEAS-2B 세포가 약 70% 융합되어 있는지 확인합니다.
   2. 기존 배지를 조심스럽게 제거하고 적절한 0.5mL의 KRAS 또는 벡터 렌티바이러스 입자와 3mL의 새로운 완전한 RPMI-1640 배지를 각각 두 개의 플레이트에 추가합니다.
   3. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 18-20시간 동안 세포를 성장시킵니다. 렌티바이러스 입자가 포함된 기존 배지를 3.5mL의 사전 예열된 완전 배양 배지로 교체합니다. 72시간 형질도입 후 다음 분석을 위해 세포를 수집합니다.
      참고: 바이러스를 하룻밤 동안 배양하면 독성이 발생하는 경우 배양 시간을 4시간으로 단축할 수 있습니다. 형질도입 효율과 세포 건강의 균형을 이루기 위해서는 다음과 같은 전략을 고려해야 합니다: (1) 감염의 다양성을 최적화합니다. (2) 고품질 바이러스 제제를 사용하십시오. (3) 효율성을 개선하기 위해 폴리양이온(예: 폴리브레네)을 활용하여 더 낮은 바이러스 역가를 사용할 수 있고 잠재적 독성을 줄일 수 있습니다. (4) 장기 연구의 경우, 유도성 발현 시스템을 사용하여 이식유전자 발현을 일시적으로 제어하여 세포에 대한 부담을 줄이고 잠재적 독성을 최소화하는 것을 고려하십시오.

2. KRAS (G12D) 유래 DNA 손상 및 R-loop 형성 검증

1. WB assay를 통한 유전자 발현 및 DNA 손상 확인
   1. 플레이트에서 배양 배지를 흡인합니다.
   2. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척하여 잔류 배지 또는 파편을 제거합니다.
   3. 긁는 과정에서 세포를 촉촉하게 유지하기 위해 소량의 1x PBS를 추가합니다.
   4. 셀 스크레이퍼를 사용하여 비스듬히 잡고 표면에서 일정한 방향으로 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
      알림: 세포를 손상시킬 수 있는 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
   5. 플레이트를 기울이고 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 튜브에 모으고 500 x g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 상등액을 버리십시오.
   6. 2x RIPA 완충액을 희석하여 1x RIPA 완충액을 준비하고( 표 1 참조), 사용 직전에 프로테아제 억제제 칵테일 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 첨가합니다.
   7. 세포 펠릿을 미리 냉각된 RIPA 완충액(1x)으로 용해하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 15,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 이물질을 제거합니다. 상층액을 수집하고 Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
   8. 상층액에 4 x sodium dodecyl sulfate (SDS) 시료 로딩 버퍼를 추가하고 95°C에서 5분 동안 단백질을 변성시킵니다. 먼저 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔의 각 샘플에서 40μg의 단백질을 분리한 다음 0.2μm 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
   9. 전달이 완료된 후, Blocking Buffer(0.1% Tween 20을 함유하는 Tris-buffered saline 중 5% 무지방 우유)로 멤브레인을 차단합니다. 표 1]) 1시간 동안.
   10. TBST로 멤브레인을 간단히 헹군 다음 4°C에서 밤새 FLAG-tag(PBST에서 1:2500 희석) 및 γH2AX(PBST에서 1:1000 희석)에 대한 1차 항체로 멤브레인을 배양합니다( 재료 표 참조).
   11. 1차 항체를 제거하고 TBST로 멤브레인을 3회, 매번 10분 동안 세척합니다.
   12. 실온(RT)에서 1시간 동안 희석된 양고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체(1% 무지방 우유를 함유한 TBST 완충액의 5:5,000)에 멤브레인을 담그십시오.
   13. TBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 10분 동안 세척합니다.
   14. 향상된 화학발광(ECL) 시약을 통해 단백질 수준을 시각화합니다( 재료 표 참조).
2. Dot blot에 의한 R-loop 검출²⁵​
   1. 플레이트에서 배양 배지를 흡인합니다.
   2. 1x PBS로 셀을 부드럽게 세척하여 잔류 매체 또는 파편을 제거합니다.
   3. 긁는 과정에서 세포를 촉촉하게 유지하기 위해 소량의 1x PBS를 추가합니다.
   4. 셀 스크레이퍼를 사용하여 비스듬히 잡고 표면에서 일정한 방향으로 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
      알림: 세포를 손상시킬 수 있는 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
   5. 플레이트를 기울이고 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 튜브에 모으고 500 x g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 상등액을 버리십시오.
   6. 300μL의 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액을 가진 Lyse 2 ×^{10 6} cells( 표 1 참조). 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전하고 상층액을 버립니다. 펠릿에는 핵이 포함되어 있습니다.
   7. 넓은 오리피스 팁을 사용하여 300μL의 사전 냉각된 핵 용해 버퍼로 각 펠릿을 다시 현탁시킵니다( 표 1 참조).
   8. 각 샘플에 3 μL의 20 mg/mL proteinase K( 재료 표 참조)를 추가하고 55 °C에서 3-5시간 동안 분해합니다.
   9. 각 튜브에 100μL의 용리 완충액( 표 1 참조)을 추가하고 완전히 혼합합니다.
   10. 각 튜브에 400μL의 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1 pH 8.0)을 추가합니다. 격렬한 와류 후 12,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 다른 세포 함량에서 DNA를 분리합니다.
   11. 상부 수성상을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
   12. 샘플에 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2)과 2.5부피의 예냉된 100% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 완전히 섞어 -20 °C에서 4 시간 또는 하룻밤 동안 배양하십시오.
       참고: 샘플에 글리코겐( 재료 표 참조)을 추가하면 에탄올 침전에서 DNA 회수율을 높일 수 있습니다. 최종 글리코겐 농도는 약 0.05-1 μg/μL입니다.
   13. 12,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 DNA를 펠렛화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오.
   14. 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% 에탄올 1mL로 헹구고 4°C에서 12,000 x g 에서 5-15분 동안 다시 원심분리합니다.
   15. DNA 펠릿을 방해하지 않도록 상등액을 조심스럽게 폐기하십시오.
   16. DNA 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조합니다.
   17. 예열된 TE 완충액 50μL(pH8.0)를 첨가하여 DNA 펠릿을 용해하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다.
   18. TE 완충액(5 ng/μL - 200 ng/μL)에서 원하는 농도로 DNA를 희석합니다. 모든 시료 20μL를 dot-blot 장치에 의해 양전하를 띤 나일론 멤브레인에 고르게 묻습니다.
       참고: 도트 블롯 분석을 사용하여 R-루프를 검출하려면 도트당 약 500ng의 게놈 DNA를 적용하는 것이 좋습니다. 이 양은 이러한 구조에 특이적으로 결합하는 S9.6 단클론 항체를 사용할 때 RNA-DNA 하이브리드를 검출하기에 충분한 감도를 제공하는 것으로 나타났습니다.
   19. UV 가교제 "자동 가교" 설정(1,200 μJ x 100)을 통해 DNA를 나일론 멤브레인( 재료 표 참조)에 가교하여 DNA를 고정합니다( 재료 표 참조).
   20. 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 Blocking Buffer ( 표 1 참조)에 담그십시오. 그런 다음 TBST로 멤브레인을 간단히 헹굽니다.
   21. 하룻밤 동안 4°C에서 1차 항체( 재료 표 참조)로 멤브레인을 배양합니다. S9.6의 희석액은 5% BSA를 함유한 TBST에서 1:1,000입니다.
   22. 1차 항체를 제거하고 TBST로 3회, 10분씩 3회 세척합니다.
   23. 실온에서 1시간 동안 TBST의 5% BSA에 HRP 접합 2차 항체를 가진 멤브레인을 배양합니다.
   24. 2차 항체를 제거하고 TBST로 3회, 10분씩 3회 세척합니다.
   25. ECL(Enhanced Chemiluminescence) 시약을 통해 R-loop 레벨을 시각화합니다. 재료 표 참조).

3. PLA 분석

1. 세포 준비
   참고: KRAS G12D 종양유전자를 가진 세포의 형질도입은 양성 PLA 신호에 의해 입증된 바와 같이 TRC의 증가로 이어집니다. 이 방법은 항생제 선택 없이 발암유전자 주도 TRC를 배경 수준과 효과적으로 구별합니다. 그러나 transduction 후 항생제 선택을 구현하면 성공적으로 transduction된 세포의 집단을 풍부하게 하여 분석의 sensitivity와 specificity를 개선하여 전체 신호를 향상시킬 수 있습니다.
   1. 12웰 플레이트의 각 웰에 직경 12mm의 커버 글라스를 놓습니다.
   2. 렌티바이러스에 감염된 세포를 감염 후 24시간 이내에 이 웰에 파종하고 5% CO₂로 37°C에서 완전한 RPMI-1640 배지 500μL로 커버 유리에 세포를 유지합니다.
   3. Optimal) 실험 설계에 성공적으로 형질도입된 세포를 농축하기 위한 항생제 선택이 포함된 경우 이 단계에서 배양 배지에 적절한 항생제를 추가합니다.
   4. 세포를 모니터링하여 감염 후 48-72시간 후에 약 60% 합류점에 도달하는지 확인합니다.
   5. RPMI-1640을 조심스럽게 제거하고 얼음 위에서 4분 동안 0.5% NP-40으로 세포를 미리 추출합니다.
   6. 500μL의 고정 버퍼( 표 1 참조)를 직접 추가하여 RT에서 15분 동안 셀을 고정합니다.
      참고: 고정 단계 전에 세포를 세척하지 않는 것이 좋으며, 이는 특히 세포주가 분리에 민감한 경우 세포가 자라는 표면에서 분리될 수 있으므로 세포가 자라고 있는 표면에서 분리될 수 있습니다. 따라서 정착액을 직접 추가하는 것이 선호되는 경우가 많습니다.
   7. 정착 완충액을 제거하고 1x PBS로 세포를 3회 조심스럽게 세척하여 반응을 중지합니다.
   8. PBS를 흡입하고 500μL의 사전 냉각된 100% 메탄올을 세포에 첨가합니다.
   9. -20 °C에서 15-30 분 동안 배양하여 세포를 투과시킵니다.
   10. Duolink 블록 용액을 사용하여 RT에서 1시간 동안 셀을 차단합니다.
2. 항체 염색
   1. Duolink 항체 희석 완충액에 마우스 anti-RNAPII 8WG16 (1:500) 및 rabbit anti-PCNA(D3H8P) (1:500)를 희석합니다. 1차 항체 혼합물이 있는 세포를 습도 챔버에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 1차 항체(anti-RNAPII 또는 anti-PCNA) 중 하나만 사용하고 다른 하나는 생략하여 PLA 프로토콜을 수행합니다. 이는 개별 항체 또는 PLA 프로브의 비특이적 상호 작용으로 인한 배경 신호를 식별하는 데 도움이 됩니다.
   2. 세포를 건드리지 않고 보푸라기가 없는 폐지 시트를 사용하여 슬라이드에서 1차 항체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 1x PBS로 세포를 3회 세척합니다.
   3. 다음 절차( 표 2 참조)에 따라 PLA 프로브(또는 2차 항체)를 준비한 다음 혼합하여 실온에서 20분 동안 그대로 둡니다.
   4. 슬라이드에 2차 항체 혼합물을 추가하고 RT에서 2시간 동안 습도 챔버에서 배양합니다.
3. 결찰 및 증폭
   1. 2차 항체 혼합물을 버리고 5분 동안 각각 1x Buffer A로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
   2. 다음 절차에 따라 결찰 혼합물을 준비합니다( 표 2 참조).
   3. 각 커버 슬라이드에 15μL의 결찰 혼합물을 적용하고 습도 챔버에서 30분 동안 37°C에서 배양합니다.
   4. 1x Buffer A로 슬라이드를 각각 2분 동안 두 번 세척합니다.
   5. 다음 절차에 따라 Amplification Mix를 준비합니다( 표 2 참조).
   6. 각 슬라이드에 15 μL의 증폭 혼합물을 적용하고 습도 챔버에서 37 °C에서 100분 동안 배양합니다. 버리다 Amplification Mix를 혼합하고 10분 동안 각각 1x Buffer B로 두 번 세척합니다.
   7. 0.01x 버퍼 B로 슬라이드를 1분 동안 한 번 세척합니다.
   8. 버퍼 B를 흡입하고 DAPI를 사용하여 Duolink In Situ 장착 매체에 슬라이드를 장착합니다.
4. 이미지 분석 및 임계값 결정:
   1. ImageJ로 PLA 초점의 수를 정량화합니다. 자동화된 이미지 분석 소프트웨어는 PLA 신호를 객관적으로 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 핵당 3개 이상의 PLA 병소의 역치를 임계값으로 선택하는데, 이는 대조 세포의 1% 미만이 교란되지 않은 조건에서 3개의 PLA 초점을 획득하기 때문입니다.
      참고: 임계값은 변동성을 설명하기 위해 여러 샘플과 대조군을 분석하여 실험적으로 결정되기 때문에 비교 가능성을 보장하기 위해 모든 샘플에서 일관된 이미징 설정(예: 노출 시간, 게인)을 유지해야 합니다.

결과

γH2AX는 DNA 손상에 대한 바이오마커 역할을 합니다. KRAS(G12D)의 과발현은 웨스턴 블롯 분석에서 γH2AX 신호 증가에 의해 입증된 바와 같이 이러한 세포의 게놈 안정성을 손상시킵니다(그림 2A). 또한, 벡터 대조군과 비교하여 KRAS(G12D) 발현 세포에서 강화된 S9.6 도트 블롯 신호(그림 2B)는 발암성 KRAS 발현이 DNA 단절 형성에 기여할 수...

토론

RNAPII 전사 기계는 DNA 복제 포크 진행에 방해가 될 수 있으며,^26,27, 특히 암세포에서 TRC 및 DNA 손상을 촉진할 수 있습니다 ^28,29. TRC를 조절하는 단백질을 해독하고 자세한 메커니즘을 이해하면 이러한 유해한 사건이 어떻게 발생하는지 이해하고 향후 새로운 치료 접근법을 개발하는 데 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92014
FLAG antibody	Millipore	F7425
gamma H2AX antibody	Cell Signaling	25955
Glycogen, molecular biology grade	ThermoFisher	R0561
Image J	NIH	https://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranes	Amersham	10600004
PCNA antibody	Cell Signaling	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
Proteinase K, recombinant, PCR grade	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII antibody	SCBT	sc-56767
S9.6 antibody	Active motif	65683
UV crosslinkers	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000