無菌環境科学

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner

無菌技術は、マインドフルネスと実験室の練習のバランスを必要とする環境の微生物学の分野で広く練習される基本スキルです。この手法の適切な使用は、試薬、培地、環境試料の細菌や真菌の汚染の可能性を低減します。無菌技術はまたデータの整合性を確保し、非常に稀で、文化の分離することは困難ので構成されるかもしれない文化ライブラリの純度を維持する重要です。試験所環境の汚染の源は浮遊微生物濃度 (これらのほこりや糸くず付着粒子を含む) を含みます、微生物提示実験室ベンチ ワークスペース、または無殺菌ガラスや機器、および微生物体と研究者の髪から転送。無菌技術の使用削減を研究している微生物の伝達のための潜在的な病原体を扱う場合特に重要です安全対策しています。

無菌技術を使用しての目標を作成および維持滅菌作業環境、機器、試薬、試料の汚染を最小限に抑えることです。これを行うには、作業スペースといくつかのツール 70% エタノールなどの薬品で消毒することができ、漂白剤を希釈します。また白衣、手袋などの個人保護用具 (PPE) のドンに研究者にとって重要だし、安全ゴーグルを着用します。

メディアと試薬は、細菌などほとんどの微生物を効果的に削除 0.22 μ m のフィルターを用いてフィルター滅菌器具を使用して滅菌することができます。また、多くの試薬や機器は、また高熱で滅菌することができます。たとえば、微生物やツール、ガラス製品、および液体媒体ですることができます熱殺された高圧、高温加圧蒸気への暴露を介して内容を殺菌室であります。さらに、いくつかのツールは、熱滅菌ブンゼン バーナーなどの炎のソースを使用することができます。

炎の源の使用はまた無菌作業環境を確立する最も一般的な方法の 1 つです。炎からの熱無菌実験作業を行うことで、バーナーの近くから離れて浮遊汚染物をリフトする上昇気流を生成し、「滅菌フィールド」を作成、空気の対流が発生します。

1. 無菌作業のための準備

1. 取得、次の PPE 項目適用: 白衣、(涙や穴から無料)、ラテックスまたはニトリル手袋、安全ゴーグル (図 1)。開いた炎を使用する場合安全のため、戻って長い髪を結ぶ。
   
   図 1: PPE: 実験用の上着、ラテックス手袋、安全ゴーグル。
2. 無菌技術の 2 つ目の重要な側面は、適切な滅菌とメディア ・研究室で使用する試薬の保管です。液体スープ媒体 (例えば、トリプシン醤油スープ)、寒天ベースのメディア (例えばR2A) を脱イオン水の適切な量を追加乾燥の原料粉末の適切な量を計量して準備します。
3. スープ中の適用、低熱でホット プレート上の粉末を溶解するし、分配液体 100 mL の容積のいずれかガラスねじ上のフラスコ、または 10 mL の容積でガラスねじ上テスト チューブに。粉が完全に溶解するまで、ホット プレート攪拌に agarose 媒体をかき混ぜる電磁攪拌棒を使用して。
4. オートクレーブ テープをコンテナー、および製造元の指示 (例えば、121 ° C で 20 分) によるとメディアのオートクレーブに適用 (図 2 および 3)。オートクレーブ テープにストライプの色は、白 (中古オートクレーブ) からブラック (後オートクレーブ) に変化する必要がありますに注意してください。色の変更は通常、滅菌が成功したことを示します、不妊は胞子ストリップ キットを使用しては、オートクレーブ処理を確認する行うことができるを確認します。
   
   図 2: オートクレーブ テープ材料に適用されます。
   
   図 3:ブラック (後オートクレーブ) 白 (中古オートクレーブ) からオートクレーブ テープにストライプの色の変化に注意してください。
5. 部屋の温度、液体の流体培養基をクールや常温で保存し、4 ° C で冷蔵
6. クールな水お風呂にコンテナーを配置することによってアガロース媒体は、~ 50 ° c. の設定いったん冷却、メディアは、滅菌シャーレに注がれることができます。冷却し、固める、製造元によって指定された温度下でストレージの統合を許可します。
7. 高温を低下させる重要な成分はオートクレーブできません文化メディアのいくつかの種類があります。適切な温度で保管後、0.22 μ m フィルターを用いた真空ろ過システムを用いたフィルター滅菌を必要とするこれらを殺菌します。
8. ベンチトップ作業を実行する、前に (例えば、漂白剤 500 ppm) の適切なソリューションを使用して表面を消毒します。これは作業面から文化や生殖不能メディアに汚染物質を転送する危険を下げます。
9. 滅菌フィールドを確立するには、ブンゼン バーナーをオンにします。ループを接種殺菌金属に最適な炎タイプは、中間 (図 4) で観測された決定的な青錐体との強烈な青い炎です。
   
   図 4: 寒天成長媒体を含んでいる別の非接種ペトリ プレートに、培養細胞の成長を表示する 1 つのペトリ プレートからの細菌の転送を分離します。
10. ゆっくりと炎 (青錐体の先端) の最も熱い部分を接種したループを渡します。ループは、殺菌を目的としてホット赤にする必要があります。

2. 細菌の転送: ペトリ プレートにペトリ プレートから

1. 細菌の転送の 1 つのシナリオは、ペトリネット ワンプレート寒天成長媒体を含んでいる培養分離別、滅菌するペトリネット プレートの成長を表示するからです。
2. まず、純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートが少し開いたし、寒天表面に熱い、滅菌接種ループを軽きます。
3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
4. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
5. 分離連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループを使用して可能性がありますまたは接種ループと接触したラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
6. 一晩の成長のための定温器にすじ状のプレートを配置します。

3. 細菌の転送: ペトリ プレートにスープ文化から

1. 細菌の転送の 2 番目のシナリオは、成長培地を含む滅菌ペトリ プレートに、濁度によって一般に観測された成長を展示スープ文化からです。
2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を介して 2 〜 3 倍のコンテナー開口部を渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
3. 慎重にチューブ/フラスコに滅菌接種ループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
4. スープ文化 (図 5) の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
   
   図 5:スープ文化の 1 つの loopful.
5. 少し半開きのふた付きの文化媒体を含む新鮮なペトリネット プレートを使用して分離するには、連勝を実行します。
6. 連勝 (3 プレートごと合計) の各部分のためには、接種したループを使用する直前を炎-殺菌します。また、炎-滅菌ループ後接種ループを使用できるラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染を防止するために最終的な連勝が実行された後にだけ。
7. 一晩の成長のための定温器に分離の縞板を配置します。

4. 細菌の転送: ペトリ プレート滅菌液体培地への成長から

1. 細菌の転送の 3 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに孤立した文化連勝を含むペトリネット プレートからです。
2. 少し純粋な細菌培養を含むペトリネット プレートを開き、寒天培地の表面に軽くタップしてホット接種ループをクールします。
3. 冷却接種ループを用いた平板の表面から 1 つの隔離されたコロニーを取得し、ペトリネット プレートを閉じます。
4. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、2 〜 3 回炎のホットな部分を使用してコンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップ.に
5. 慎重に、液体スープの中に抽出したコロニーを下げる, 細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
6. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ。
7. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
8. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
9. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
10. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

5. 細菌の転送: 滅菌液体培にスープ文化から

1. 細菌の転送の 4 番目のシナリオは、無菌の液体の成長媒体を含んでいる管/フラスコに成長を展示スープ文化からです。
2. 純粋な細菌培養を含むテスト チューブ (またはフラスコ) からキャップをはずし、炎のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡します。汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
3. 慎重にチューブ/フラスコに接種したループを下げるスープ文化への挿入直前に冷却するコンテナーの側に対してカチッと。
4. スープ文化の 1 つの loopful を削除し、すぐにキャップを交換します。
5. テスト チューブ (またはフラスコ) 無菌の液体を含んでいる成長媒体からキャップをはずし、炎.のホットな部分を 2 回コンテナーのオープニングを渡す汚染を防ぐためには、設定しないでくださいキャップ ベンチトップに。
6. 慎重に滅菌液体スープ中に抽出した loopful を下げ、細菌を解放するためにループを振といます。すぐにキャップを交換します。
7. 炎 - 接種ループ使用後ラボで他人への配慮とベンチ表面の汚染防止のための滅菌接種ループ (図 6)。
   
   図 6: 接種ループ回転赤ホットのブンゼン バーナーで滅菌されている中です。
8. 場所の成長のための定温器にフラスコの一夜します。
9. 孵化翌日からフラスコを削除します。カルチャを列挙するために、希釈系列を実行します。
10. アガロース文化メディアにシリーズから希釈液をプレートし、プレートを一晩インキュベートします。
11. 次の日、プレートを削除し、任意の汚染を観察します。

適切な無菌法と貧しい無菌処置の結果を示しています。図 7は、アガロース プレートを注ぐとき、貧しい無菌技術から生じる汚染を示しています (トップ プレート: 生殖不能媒体; 底板: メディアを汚染された)。

図 7: agarose プレートを注ぐとき、貧しい無菌技術から生じる汚染します。トップ プレート: 生殖不能媒体;底板: メディアを汚染します。

ブンゼン バーナーを使用する以外は、使用する監督気流および無菌性を維持するためのフィルター、層流フードとして知られている専門のワークステーションで無菌作業環境を維持できます。

無菌技術の適切な使用環境微生物学者にとって重要なメディア、試薬を使用する場合、フィールドと実験室をサンプリングするときは、菌株を培養しました。 フィールドで貧しいの無菌技術は、技術者が重要な環境試料から微生物の転送だけでなく、別の 1 つのサンプルから微生物のクロス汚染起因します。たとえば、重要性のようなイベントは、微生物生態研究を識別し、特定の生物群系に存在する細菌や真菌の集団を比較ましょう。このような試料の汚染は、データ整合性の損失につながります。無菌技術も研究室文化分離されたフィールド サンプリングや老舗の微生物と細胞文化のリポジトリからの維持のため重要です。時間、労働、「クリーンアップ」または汚染された文化、特に珍しいを交換するためにラボの必要となる費用は、ユニークな環境から分離されたことができる非常に高いと、いくつかの株に交換できない場合があります。