1. 成長の時間ポイントのコレクションの前に 1 日トリプチ醤油スープ (TSB)大腸菌を 50 mL フラスコ中の 20 mL を接種します。
2. 27 ° C で一晩インキュベートします。この比較的長い潜伏期間は、野生型大腸菌の約 10 の固定相の人口の結果⁹ CFU/mL。
3. 次の日に (500 mL フラスコ) で TSB の 250 mL を接種するのに準備の文化の 100 μ L を使用します。ミックス徹底的。 5 mL の約数を削除、4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やしますこれは、T = 0 または T₀時間ポイントと約 4 × 10⁵ CFU/mL を含める必要があります。
4. インキュベーターの振動、37 ° C で残りのエシェリヒア属大腸菌(245 mL) のフラスコを配置します。1 時間ごとの文化の 5 mL 因数を削除、8 h ストア 4 ° C で各因数T₈を介してこれらの因数 T₁を指定します。

2. シリアル希釈

1. 冷蔵庫と氷を運ぶために場所からエシェリヒア属大腸菌の因数を削除します。使用するまで氷の上のすべての文化を維持します。
2. 各大腸菌文化 (図 3) の様々 な希薄を取得する希釈チューブのシリーズを設定します。Microfuge の管は、この機能のために便利です。各希釈チューブ 900 μ L の希釈液 (生理食塩水) が必要です。希釈系列がエシェリヒア属大腸菌カルチャ (T₀ T₈~); ごとに必要な表 2に従って各チューブにラベルを付けます。
   
   図 3。大腸菌をめっきするための手順を示す模式図。
3. チューブ ラベル T₀からエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を追加することによって希釈を開始 (最初のエシェリヒア属大腸菌文化) 管 A、T₀10^-1希釈します。渦管 5 s。
4. その後、T₀10^-2希釈である生理食塩水、管 B の次のチューブにチューブ A の 100 μ L を追加します。各時間ポイント因数に必要な希釈系列を続行します。忘れずに渦を転送する前に各チューブ。また、各転送の新しいピペット チップを使用することが重要です。

表 2。各エシェリヒア属大腸菌の培養に必要な希釈系列。

3. めっき

1. 各大腸菌培養時間ポイント因数の 3 つの希釈は、表 3によるとメッキされます。希釈倍率と追加するボリューム ラベルの時点 (T₁ T₈~) とプレートします。各希釈用帳票プレートを使用します。
2. 寒天プレート (図 3) の中央に金額をピペッティングによる各希釈の 100 μ L をプレートに追加します。すぐに広がる炎を用いた因数は滅菌ガラス棒の形をした"L"です。因数はすぐに広がらない場合それ sorbsその場で最初の接種の場所で細菌の増殖の結果、皿の上。
3. 時間ポイント T₁ T₈の希釈系列ごとにメッキを繰り返します。板間と特に異なる希釈率との間のロッドを消毒してください。
4. プレートは、数分間乾燥した後、反転し、37 ° C のインキュベーターで一晩します。寒天プレート上に落ちるから結露を排除、板を反転します。一晩インキュベート後プレートは冷蔵庫に格納する必要があります。

^*低い希釈は、死の段階のための低い人口を考慮しています。

表 3.大腸菌文化のためのプロトコルをめっきします。

4 コロニーのカウントと平均世代時間を計算します。

1. コロニーの均一性と汚染の欠如プレートを確認します。
2. 各時点 (T₀ T₈~)、30 と 300 のコロニー カウント帳票プレートとが含まれている 1 つの希釈を選ぶ。
3. T₈時間ポイント T₀で元の文化の mL あたりのセル数をバック-計算希釈倍率を使用して、します。たとえば、10^-4希釈によるコロニー数は 30、28、32。
   コロニーの数を意味する 30 の植民地を =
   これらは 10 の^-4希釈の 0.1 mL から生まれた
   1 mL あたりのコロニー数 = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. ログ₁₀ CFU/mL と (単位は時間) 時間をプロットします。
5. グラフから、指数関数的成長の段階を識別します。たびに指数的な成長段階と対応するセル番号内 2 時間ポイントを使用して、平均世代時間を計算します。