1. 세균 문화 알리쿼트 컬렉션

1. 성장 시간 포인트의 수집 하루 전에, 대장균을가진 50 mL 플라스크에서 트립티 케이스 콩 국물 (TSB) 배지의 20 mL을 접종.
2. 27 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이 비교적 긴 잠복기는 대략 10⁹ CFU/mL의 야생 형 대장균의 고정된 상 인구 에 초래됩니다.
3. 다음 날, 준비된 배양의 100 μL을 사용하여 TSB의 250mL(500mL 플라스크)를 접종하십시오. 완전히 섞으세요.  5mL 알리쿼트를 제거하고 4°C에서 즉시 냉장 보관하십시오. 이것은 T = 0 또는 T₀ 시간 지점이며 약 4 x 10⁵ CFU / mL을 포함해야합니다.
4. 나머지 대장균(245mL)의 플라스크를 37°C 쉐이킹 인큐베이터에 놓습니다. 매시간 최대 8시간 동안 5mL 의 문화 알리쿼트를 제거하십시오. 각 알리쿼트를 4°C에 저장합니다. T 1부터 T_8까지이러한 알리쿼트_T를 지정합니다.

2. 직렬 희석

1. 냉장고에서 대장균의 알리쿼트를 제거하고 얼음 위에 놓아 운반하십시오. 모든 문화를 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
2. 각 대장균 배양(도3)의다양한 희석을 얻기 위해 일련의 희석 튜브를 설정합니다. 마이크로퍼지 튜브는 이 기능에 편리합니다. 각 희석 관에는 희석 액(멸균 식염수)의 900 μL이 있어야 합니다. 각 대장균 배양(T₀ ~T_8);에대해 희석 시리즈가 필요합니다. 표 2에따라 각 튜브에 레이블을 지정합니다.
   
   그림 3. 대장균도금시술을 보여주는 회로도.
3. _T0의 10-1 희석인 튜브 A에 T 0(초기 대장균 배양)으로 표시된 튜브로부터 대장균의 100 μL을 첨가하여 희석을 시작한다. 5 초 튜브를 소용돌이.
4. 이어서,_T0의^10-2 희석인 식염수, 튜브 B의 다음 튜브에 튜브 A의 100 μL을 추가한다. 각 시간 점 알리쿼트에 대해 필요한 희석 계열을 계속합니다. 전송하기 전에 각 튜브를 소용돌이해야합니다. 각 전송에 새 파이펫 팁을 사용하는 것도 중요합니다.

표 2. 각 대장균 배양에 필요한 희석 계열.

3. 도금

1. 표 3에따르면 각 대장균 배양 시간점에 대한 3개의 희석이 도금됩니다. 시점을 가진 라벨 플레이트(T₁ ~T_8),희석 계수 및 부피가 추가됩니다. 각 희석에 트리플리케이트 플레이트를 사용합니다.
2. 각 희석의 100 μL을 한천판의 중앙에 배관하여 접시에 100 μL을 추가한다(도3). 화염 살균 "L" 모양의 유리 막대를 사용하여 즉시 알리쿼트를 퍼뜨리는 행위. 알리쿼트가 즉시 퍼지지 않으면 접시에 앉아 서초기 접종 지점에서 세균과 자라납니다.
3. 시간 점 T_1에서 T_8까지각 희석 계열에 대한 도금을 반복합니다. 플레이트 사이와 특히 다른 희석 사이에 막대를 살균하는 것을 기억하십시오.
4. 접시가 몇 분 동안 건조되면, 반전하고 하룻밤 37 °C 인큐베이터에 배치합니다. 판을 반전시키는 것은 천판에 떨어지는 결점을 배제합니다. 하룻밤 동안 잠복한 다음, 접시를 냉장고에 보관해야합니다.

^* 낮은 희석제는 사망 단계로 인해 더 낮은 인구를 고려합니다.

표 3. 대장균 배양을 위한 도금 프로토콜.

4. 식민지 를 계산하고 평균 세대 시간을 계산

1. 식민지의 균일성과 오염의 부족에 대한 플레이트를 검사합니다.
2. 각 시간 지점(T₀ ~T_8)에대해 30~300개의 콜로니를 포함하는 희석을 선택하고 삼중판수를 계산합니다.
3. 희석 계수를 사용하여, T0~T8을 통해 시간 지점에서 원래 배양의mL당 셀 수를 백계산한다. 예를 들어^10-4 희석으로 인한 콜로니 수가 30, 28 및 32인 경우:
   식민지의 평균 수 = 30 식민지
   이는^10-4 희석의 0.1mL에서 발생했습니다.
   mL 당 콜로니 수 = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. 플롯 로그₁₀ CFU/mL 대 시간(시간).
5. 그래프에서 기하급수적 성장 단계를 식별합니다. 지수 성장 단계 내에서 2시간 점과 매번 해당 셀 수를 사용하여 평균 생성 시간을 계산합니다.