細菌の成長曲線の解析と環境応用

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner

細菌は地球上最も豊富な生命体の一つです。彼らは全ての生態系に発見され、日常生活に欠かせない。たとえば、細菌に影響を与える人々 は何を食べる、飲む、呼吸、および哺乳類細胞よりも人の体内より実際に細菌の細胞があります。細菌の重要性のため、研究室では、細菌の特定の種を勉強することをお勧めします。これを行うには、細菌の純粋培養、菌の 1 種類のみが検討されていることを意味制御された条件下で栽培しています。純粋培養で細菌が急速に成長し、細胞の数は、時間の短い期間で劇的に増加します。セル人口の率を測定することによって増加していく、「成長曲線」を開発します。利用、または知られている細菌の分離、たとえば植物成長を高める、有害有機物の分解を増加または抗生物質やその他の天然物工業規模で生産する数を接種を目指している、これは重要です。

裂、1 つの細菌細胞が分割し、2 つのセル (図 1) になるを通じて細菌繁殖が行われます。細胞分裂に必要な時間は、平均世代時間、または倍増するセルの数を必要な時間である倍加時間と呼ばれます。

図 1。急激な細胞分裂。各細胞分裂細胞数の倍増で起因します。低細胞数の増加が非常に大きくないです。ただし、数世代後のセル番号増加爆発的。N 区分後の 2ⁿ細胞があります。

理解し、特定の微生物の成長を定義、栄養供給と環境条件を制御、フラスコに配置されます。液体培地は、成長と環境パラメーターの成長を促すために必要なすべての栄養素を供給する数の増加が成長曲線を取得する時間の関数として測定できます。成長曲線 (図 2) 内では、いくつかの異なる成長段階を観察できます。遅れ位相、指数またはログ相、固定相、死フェーズでは、それぞれが特定の生理学的な変更 (表 1) に関連付けられているが含まれます。

相	特性
位相を遅れ	低成長や細胞の培養条件への生理的適応または初期低細胞密度のため exoenzymes の希釈による成長の欠如。
指数またはフェーズのログ	離散時間間隔を平均世代時間として知られている二重セル番号中の最適な成長率。
固定相	(細胞分裂) の成長と細胞の死細胞数の純増加しないお互いを相殺します。減らされた成長率は通常、栄養素の欠乏や有毒廃棄物成分の蓄積のために。
死の相	死亡率は、純損失は実行可能なセルに結果の成長率を超えています。

表 1.細菌の増殖の 4 つのフェーズです。

図 2。細菌の人口の典型的な成長曲線します。コロニー形成に基づく曲線の形状を比較単位 (CFUs) 光の密度、特に死の段階で対。違いは、死んだ細胞は濁度の結果をまだが、文化の実行可能なコロニーを形作ることができないという事実によるものです。

全体的にみて、液体培地に存在する細菌のセルの数を知るために特定の細菌分離のため細菌の増殖動態を決定する重要なは多くの場合。比色の分光光度計とシリアル希釈めっきを使用して濁度測定を含む、液体媒体の成長を測定する別の方法があります。濁度測定は、液体培地より多くの濁った液体はなるより多くの細胞が示す事実に依存しています。シリアル希釈平板には固体文化、文化の「コロニー形成ユニット」として知られている測定可能なコロニーを形作ることができる液体培地での細胞数を試金が含まれます。ただし、このようなめっき法は細菌のみ使用できますは、実際には、培養可能。

1. 細菌培養因数のコレクション

1. 成長の時間ポイントのコレクションの前に 1 日トリプチ醤油スープ (TSB)大腸菌を 50 mL フラスコ中の 20 mL を接種します。
2. 27 ° C で一晩インキュベートします。この比較的長い潜伏期間は、野生型大腸菌の約 10 の固定相の人口の結果⁹ CFU/mL。
3. 次の日に (500 mL フラスコ) で TSB の 250 mL を接種するのに準備の文化の 100 μ L を使用します。ミックス徹底的。 5 mL の約数を削除、4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やしますこれは、T = 0 または T₀時間ポイントと約 4 × 10⁵ CFU/mL を含める必要があります。
4. インキュベーターの振動、37 ° C で残りのエシェリヒア属大腸菌(245 mL) のフラスコを配置します。1 時間ごとの文化の 5 mL 因数を削除、8 h ストア 4 ° C で各因数T₈を介してこれらの因数 T₁を指定します。

2. シリアル希釈

1. 冷蔵庫と氷を運ぶために場所からエシェリヒア属大腸菌の因数を削除します。使用するまで氷の上のすべての文化を維持します。
2. 各大腸菌文化 (図 3) の様々 な希薄を取得する希釈チューブのシリーズを設定します。Microfuge の管は、この機能のために便利です。各希釈チューブ 900 μ L の希釈液 (生理食塩水) が必要です。希釈系列がエシェリヒア属大腸菌カルチャ (T₀ T₈~); ごとに必要な表 2に従って各チューブにラベルを付けます。
   
   図 3。大腸菌をめっきするための手順を示す模式図。
3. チューブ ラベル T₀からエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を追加することによって希釈を開始 (最初のエシェリヒア属大腸菌文化) 管 A、T₀10^-1希釈します。渦管 5 s。
4. その後、T₀10^-2希釈である生理食塩水、管 B の次のチューブにチューブ A の 100 μ L を追加します。各時間ポイント因数に必要な希釈系列を続行します。忘れずに渦を転送する前に各チューブ。また、各転送の新しいピペット チップを使用することが重要です。

大腸菌文化	希釈に必要なチューブ #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

表 2。各エシェリヒア属大腸菌の培養に必要な希釈系列。

3. めっき

1. 各大腸菌培養時間ポイント因数の 3 つの希釈は、表 3によるとメッキされます。希釈倍率と追加するボリューム ラベルの時点 (T₁ T₈~) とプレートします。各希釈用帳票プレートを使用します。
2. 寒天プレート (図 3) の中央に金額をピペッティングによる各希釈の 100 μ L をプレートに追加します。すぐに広がる炎を用いた因数は滅菌ガラス棒の形をした"L"です。因数はすぐに広がらない場合それ sorbsその場で最初の接種の場所で細菌の増殖の結果、皿の上。
3. 時間ポイント T₁ T₈の希釈系列ごとにメッキを繰り返します。板間と特に異なる希釈率との間のロッドを消毒してください。
4. プレートは、数分間乾燥した後、反転し、37 ° C のインキュベーターで一晩します。寒天プレート上に落ちるから結露を排除、板を反転します。一晩インキュベート後プレートは冷蔵庫に格納する必要があります。

エシェリヒア属大腸菌文化	めっきされる希釈
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^*低い希釈は、死の段階のための低い人口を考慮しています。

表 3.大腸菌文化のためのプロトコルをめっきします。

4 コロニーのカウントと平均世代時間を計算します。

1. コロニーの均一性と汚染の欠如プレートを確認します。
2. 各時点 (T₀ T₈~)、30 と 300 のコロニー カウント帳票プレートとが含まれている 1 つの希釈を選ぶ。
3. T₈時間ポイント T₀で元の文化の mL あたりのセル数をバック-計算希釈倍率を使用して、します。たとえば、10^-4希釈によるコロニー数は 30、28、32。
   コロニーの数を意味する 30 の植民地を =
   これらは 10 の^-4希釈の 0.1 mL から生まれた
   1 mL あたりのコロニー数 = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. ログ₁₀ CFU/mL と (単位は時間) 時間をプロットします。
5. グラフから、指数関数的成長の段階を識別します。たびに指数的な成長段階と対応するセル番号内 2 時間ポイントを使用して、平均世代時間を計算します。

次のシリアル希薄をめっき実験、次のデータが得られました。ここで指定した指数関数的成長の初めに時間 t = 0、細菌細胞の初期濃度が 1,000 CFU/mL。時間 t = 6 h、細胞の濃度が 16,000 CFU/mL。

今、X = 2ⁿ x X₀

場所: X₀ = セルの初期濃度 = 1,000 CFU/mL
X 時間 t 後の細胞の濃度を = = 16,000 CFU/mL
n = 世代数
16,000 = 2ⁿ x 1,000
2ⁿ = 16
ログイン₁₀ 2ⁿ = ログ₁₀ 16
0.301 = 1.204 x n
n = 1.204 = 4
0.301

だから 6 h で 4 世代を経過

平均世代時間 = 6/4 = 1.5 h。

図 4。根粒窒素固定菌が含まれています。

培地で細菌の増殖動態と細菌数の知識研究と商業的な観点の両方から重要です。研究では、それはしばしばが、正確な同じ番号を持つ必要がある場合、実験を複製することができますので、サンプル中の細菌の数を知ることが重要。たとえば中実験土壌、土壌汚染された有毒な有機土壌の強化された生分解性など、目的の効果を得るための 1 グラムあたり追加する 10 の⁴ CFU 必要最低のプロットに細菌の乳酸菌を追加しました。別の例は、根粒菌 (植物の根と共生関係を結ぶ細菌) の不明の番号は泥炭系炭素媒体 (図 4) に含浸された市販根粒菌乳酸菌のケースです。媒体は、生物学的窒素固定 (すなわち、窒素分子の栄養素として有機体によって使用できる有機的な形態への変換) を強化するマメ科植物種子を接種するのには使用されます。

成長速度も細菌の菌の特定産業廃棄物や油汚染など、特定の基質の代謝に適応しているかどうかを評価するため便利です。たとえば、油流出をクリーンアップするため、遺伝子組み換え細菌は彼らの成長は、オイルの毒性によってない抑圧されるだろうように複雑な炭化水素の存在下で栽培できます。同様に、斜面と産業廃棄物の混合で増殖する細菌から作成される成長曲線の形状かどうかバクテリアが特定の物質と廃棄物の混合物で、細菌のどのように多くの潜在的なエネルギー源を見つけることができます科学者に通知できます。