NIHの助成HL89764、NSFの助成金0546012、0730503と0725528で提供される資金調達のサポート。

DNAのA.ビオチン化プラスミドDNAを共有結合製造業者によって記載されたようグアニン特異的ビオチンラベルしたビオチン（Mirusバイオ、マディソン、ウィスコンシン州）が、DNAあ​​たり1〜2ビオチンラベルを持つようにスケールされた。プラスミドDNA（pEGFPを- C1、4.9キロバイト、クロンテック、マウンテンビュー、カリフォルニア州）は、このプロトコルで標識した。 <ol><li> 1μg/μLDNA溶液を作るためにDNaseフリー、RNaseフリーのTEバッファー（分子生物学グレードの品質）水にPDNAの所望量を溶解する。 </li><li>以下の反応混合物を用いて標識反応を行う。 ITは、試薬最後のラベルを追加します。 </li></ol> 100μgのDNA反応のための： <table border="1"><tbody><tr><td> DNaseフリー、RNaseフリーの水</td><td> 75μL </td></tr><tr><td> 10X標識バッファー</td><td> 20μL </td></tr><tr><td> 1μg/μLDNA </td><td> 100μL </td></tr><tr><td> IT試薬ラベルを付けます。 </td><td> 5μL </td></tr><tr><td> 合計ボリューム </td><td> 200μL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 37反応℃で1時間インキュベートする。 </li><li>標準的なプロトコルは、次のエタノールまたはイソプロパノール沈殿により標識された試料を精製する。 </li></ol> 注：ゲルろ過ベースの列には、DNAの定量化や蛍光特性に影響を与える可能性が、高いUV吸光度または蛍光バックグラウンドにつながる可能性があります。 注：ビオチン化のレベルはHABAベースのテストによって決定されることがあります。 Cy5標識カチオン性ポリマーのB.標識キトサンは（390 kDaの、脱アセチル化83.5％、バンソン、レッドモンド、ワシントン州）、本研究におけるモデルカチオン性ポリマーとして使用されました。キトサンポリマー骨格の空き第一級アミンは、Cy5標識NHS（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、NJ）で標識した。 <ol><li> Cy5の色素の完全な接合を容易にするために、Cy5標識NHSの必要量を計算するCy5のモル比というような：200：第一級アミンは1です。 </li><li> NaOHの添加により〜6.5にキトサン溶液（25mMの酢酸緩衝液中）のpHを調整します。 NHSの反応は、塩基性pHでより効率的ですが、ここキトサンの溶解度が動作pH範囲を制限することに注意してください。 </li><li>撹拌しながら、ゆっくりとドロップによるドロップの方法でキトサン溶液にCy5標識NHSの計算量（1 mg / mlのDMSO）を追加します。 </li><li>一晩室温で暗所で混合物をかき混ぜる。 </li><li>精製するために、暗所で室温で1％の酢酸緩衝液に対して2時間10K MWCOスライド- A - Lyzer（Pierce）で透析。 </li><li>バッファーを交換し、暗所で室温で別の2時間を透析。 </li><li>バッファーを交換し、4℃で一晩透析·ダークでCを。 </li><li>ストア精製は、-20℃でポリマーを標識し</li></ol> 注：本研究では、標準曲線は670 nmでCy5標識NHSエステルの発光強度を測定することによって構成されている。標準曲線にCy5標識キトサンから670 nmで得られた発光を測定することにより、ラベルの密度を特徴づける。吸光度は、標識効率を決定するために使用されることがありますが、ここで実行されませんでした。 QD -標識DNAとCy5 -ポリマーのC.の準備 PDNAへの量子ドットの完全な接合を確保するためにQDにPDNAのモル比が過剰（2：：QD≈1 PDNA）に保たれた。各PDNAに標識された量子ドットの数は、TEM像や他の同等の機能を介して推定することができる。我々の研究では、PDNAあたりのドット数は、TEMおよび単一分子分光法による〜1月3日と推定される。調製時1使用ミリポアのMilli - Q勾配の水（&gt; 18.0 MW、0.2umのフィルタリング）。 <ol><li>所望のN / P比によると10μgのPDNA、DNA溶液に負のリン酸にキトサン溶液中のプロトン化アミンの理論上の比率のためのキトサンの必要量を計算します。 </li><li>ビオチン化PDNA液にストレプトアビジン官能605QDs（Qdot ®二605 ITK、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を追加します。 </li><li> 15分間暗所に室温で溶液をインキュベートする。 </li><li>最終的な音量200μLを作るために、50mMの硫酸ナトリウム溶液にQD -標識DNAを追加。 </li><li>最終的な音量200μLを作るためにMilli - Q水で、所望のN / P比によると、Cy5標識キトサンを希釈する。 </li></ol> 注意：可能な光退色を防ぐために、暗所で反応しておいてください。 重要：このカタログの量子ドットは、FRETの目的のために設計されているとしてQdot ®二605 ITK™ストレプトアビジンコンジュゲート（ITKシリーズ）を使用するように注意が必要です。正規のQdot ®二シリーズは、特に携帯電話ラベリングのために、非特異的結合を防ぐためにPEG層との共役複素数である。しかし、この追加のコーティングはrで、その結果、ドナー - アクセプターの距離を拡大エネルギー伝達効率をeduced。 標準的なフォトリソグラフィーを用いたSU - 8マスターズのD.作製<ol><li> Siウェーハはピラニア℃で5分間洗浄し、200で焼成です。 </li><li> 25μmのの指定されたマスターの厚さ、スピンコート用2000rpmでシリコンウェハ上にネガ型フォトレジスト（SU - 8 2025、マイクロケム、ニュートン、マサチューセッツ州）30秒。 </li><li>ソフトベーク65のランプとホットプレート上にウェーハ℃〜95℃/時間℃の</li><li>マイクロチャネルの設計を含むマスク膜（CAD /アートサービス、バンドン、OR）を介して250mJ/cm 2のUV光（波長365nm）にさらす。 </li><li>暴露後は、65のランプをホットプレート上にウエハを焼く° C / hrで95℃を</li><li> SU - 8フォトレジストの現像剤を用いてウェハを開発する。 </li><li>パターン付きウェーハは、ハード65のランプをホットプレートで焼いている° C / hrで200℃室温へのダウンウェハその後徐々に涼しく、少なくとも5時間、200℃でウェハを保持する。 </li></ol> 重要：SU - 8マスターベーキング処理が必要な時に徐々にランプが、そうでなければSU - 8構造体は、SU - 8構造が応力緩和により誘導されることがありますでシリコンウェハやクラックから剥離することがあります。 マスターとボンディングからカバーガラスにPDMSのE.レプリカ成形<ol><li> SU - 8のマスターは、秤量ボートに配置されます。 </li><li> 10のミックスシリコーンエラストマーと硬化剤（ポリ（ジメチルシロキサン）、PDMS、Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）：1の割合。 </li><li> SU - 8マスターにPDMSの混合物を注ぎ、気泡を除去するため真空デシケーター中で秤量ボートを残す。 </li><li> 1〜2時間、65℃でPDMSを治す。 </li><li>のSiマスターモールドからPDMSストリップピール。 </li><li>パンチのチャネル入口と流体デバイスのアウトレット。 </li><li> PDMSのストリップを洗浄し、エタノールとして空気乾燥してガラスをカバーする。 </li><li>酸素プラズマによるクリーニングPDMSストリップとカバーガラスを（1分間20W）と同様に取り扱う。 </li><li>カバーガラスとすぐに結合PDMSストリップ。 </li><li> 95℃で一晩オーブンに結合マイクロ流体チップを残す。 </li></ol> 重要：プラズマ処理と一晩ベーキングは、強化された接着強さには不可欠です。 F.モニターマイクロ流体デバイス中のDNA Nanocomplexesの形成<ol><li>実験時のスムーズな流れを確保するために試薬をロードする前に、水とマイクロ流体チャネルを（マイクロ流体チャネル内に気泡がないことを確認するために）記入してください。 </li><li>ビデオで説明されているチューブを介して、二つの個々のガラスシリンジにQD -標識DNAとCy5標識キトサンソリューションを読み込みます。 </li><li>マイクロ流体デバイスには2つの入口とチューブを接続します。プロセス中に空気を導入しないように注意が必要です。層流条件下で、20nL/min（PHD - 2000シリンジポンプ、ホリストン、MA）で流量を設定します。 </li><li>顕微鏡下でマイクロチャネルを確認してください。 </li><li>流れは、（〜15〜20分）安定した量子ドットを介したフレットの場合はチャネルの中心に観察する必要があります。 </li><li>チャネルに沿って異なる位置で蛍光画像を（冷却CCD、Qimaging、BC、カナダ）を取る。 </li><li> ImageJとOriginLabのと蛍光画像を解析する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 QD - FRETは、DNAのNanocomplexes自己組織化の発症の敏感な指標を提供 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>量子ドットを介した蛍光共鳴エネルギー移動（QD - FRET）は、DNAや遺伝子のキャリア間の相互作用の発症の明確な検出を可能にする、余分なまたは細胞内の環境のいずれかでpolyplex安定性の定量的かつ高感度指標を提供することができます。 FRETのペア、605QDとCy5は、ドナーとアクセプター間のスペクトルの重なりを最大化し、潜在的なクロストークを最小限に基づいて選択されまし​​た。このペアの場合は、フェルスター距離は69.4Åです3。 </li><li> QD - FRETのDNA nanocomplexesの自己集合。アニオンプラスミドDNA（PDNA）とカチオン性遺伝子キャリアは、それぞれ、QD（エネルギー供与体）とCy5（エネルギーアクセプター）で標識した。 QD - FRET nanocomplexesは、静電複合コアセルベーションを経て形成された。 488nmで励起されると、QD - FRETを介したCy5の発光は、コンパクトでそのままnanocomplexの形成を示した。滞留時間は、（T R）2つのストリームが調査対象の反応の位置、及び平均流の速度（v）に合致した場所から測定する距離（X）により算出することができる。混合、層流の性質上は、t Rの関数としての質量輸送の正確な計算を可能にする、インターフェース（各画像の中央）で行われます。時間分解能はapplieを変えることによって調整することができます。dフローのレート。 （挿入図）FRETの介在シグナルは、適用される流量に応じて数ミリ秒以内に起こる、その結合が急速であったことを示す、2つのストリームが満たさインターフェースですぐに観察された。スケールバー：100μmの。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li><li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li><li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor.">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<ul><li>我々の仕事の意義： <ol><li>これは、単純なマイクロ流体チップ内にQD - FRET応答を通じてリアルタイム（ミリ秒の分解能）で高分子DNAのnanocomplex自己組織化の動態を監視する最初の試みです。 </li><li>マイクロフルイディクスは、空間的にDNAのnanocomplexの合成時にプロセスを分析するために十分に制御された微小環境を提供するのに対し、QD -媒介FRETは、分子間相互作用の発症のと自己組織化プロセス全体で高感度かつ定量的な指標を提供する。 </li><li>マイクロフルイディクスとナノフォトニクスの統合は、錯体形成反応の任意のタイプを調査するために新しいし、面白いアプローチを示唆している。 </li><li>結果として得られる高分子DNAのnanocomplexesが容易な構造と機能の関係を確立するために適用される可能性QD - FRET。1,2 </li></ol></li></ul>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU-8 2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>pEGFP-C1</td>
<td>4.9 kb, MW = 3.3 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>LabelIT Biotin Labeling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mirus Bio LLC</td>
<td>MIR 3400</td>
<td>Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin 605QD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Qdot&reg; 605 ITK&trade; Streptavidin Conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5-NHS Ester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>PA15101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chitosan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vanson</td>
<td>390 kDa </td>
<td>83.5% deacetylated</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545C</td>
<td>No. 1; Size: 40 x 22mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastight Glass Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>TLL series</td>
<td>50&mu;L to 500&mu;L depending on sample volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Tygon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>0.02 ID, 100ft</td>
<td>Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft</td>
</tr>
<tr>
<td>Connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>HTX-23R</td>
<td>Customized in length of 0.750"</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qimaging</td>
<td>Intensified Retiga Cooled</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX-51</td>
<td>100W mercury arc lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>v1.36b</td>
<td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td>
</tr>
<tr>
<td>Origin Pro8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OriginLab</td>
<td>Student Version</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>475AF40</td>
<td>Excitation filter in both channels</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595AF60</td>
<td>Emission filter in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>670DF40</td>
<td>Emission filter in QD-FRET channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>500 DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in QD-FRET channel</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining qd-fret and microfluidics to monitor dna nanocomplex self-assembly in real-time

ゲノミクスの進歩により、細胞および分子レベルでの病態をターゲットにできる治療薬の開発に燃料を供給し続けます。細胞内で一般的に機能的、核酸ベースの治療法は、効率的な細胞内送達システムが必要です。 One広く採用されているアプローチは、劣化に対してそれを保護しながら、DNAの細胞取り込みを促進する、自己組織化電経由nanocomplexesを形成するために遺伝子キャリアーとの複合体のDNAにすることです。時期尚早の解離または過度に安定な結合が細胞への取り込みや治療効果に有害となるので、課題は、効率的な遺伝子キャリアの合理的な設計にあります。混合バルクで合成さNanocomplexesはnanocomplexesの大きさと安定性の異質性に起因した、開梱、細胞内及び人身売買の行動の多様な範囲を示した。そのような異質性が自己組織化の動態の正確な評価を妨げられ、トランスフェクション効率や生理活性にその物理的性質を相関させるのが困難に追加されます。我々は、層流の下nanocomplexの自己組織化のリアルタイム動態を特徴づけるために、新規ナノフォトニクスの収束（すなわち、QD - FRET）とマイクロフルイディクスを提示する。マイクロフルイディクスは、空間的に高時間分解能（〜ミリ秒）を使用してプロセスを分析するために十分に制御された微小環境を提供するのに対し、QD - FRETは、合成プロセス全体を通して、分子間相互作用との定量的測定値の発症の高感度指標を提供する。高分子nanocomplexesのモデルシステムの場合は、自己組織化プロセスの2つの異なるステージがこの分析プラットフォームによって捕獲された。マイクロスケールで得られた自己組織化プロセスの速度論的側面は、多くのマイクロおよびナノスケールのアプリケーションに関連するマイクロリアクターベースの反応は特に有用であろう。さらに、nanocomplexesは、マイクロ流体デバイスの適切な設計を使用してカスタマイズすることができ、結果として得られる高分子DNAのnanocomplexesが容易な構造と機能の関係を確立するために適用される可能性QD - FRET。

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Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD - FRET）とマイクロフルイディクスの小説や、強力な統合を提示する。

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K ビュー.  Johns Hopkins University. 我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD - FRET）とマイクロフルイディクスの小説や、強力な統合を提示する。

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

生物学

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

電気生理学的にマイクロ流体の適用

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...