このプロトコルは、創傷に応答してカルシウムおよび再生不良グルタミン酸のダイナミクスを監視することにより、植物全身シグナル伝達システムの活性の植物全体のリアルタイムイメージングを可能にする。このプラント全体のリアルタイムイメージング法は、高い空間的時間分解能と使いやすさを組み合わせた、プラントの高速および長距離信号のダイナミクスを理解するための堅牢なツールを提供します。このプロトコルは、他の植物種における生物的および非生物的ストレス応答におけるシステムカルシウムシグナル伝達の空間的および時間的特性に関する新しい洞察を提供する可能性を提供する。
この手順を実証するのが、研究室の博士研究員の上村卓也さんです。まず、1X対物レンズとsCMOSカメラを搭載した電動蛍光ステレオ顕微鏡をオンにします。470ナノメートルを中心とする励起光を照射するようにデバイス設定を構成し、450〜490ナノメートルの間の光を透過するフィルタを使用して選択した。
510~560ナノメートルの間を透過するフィルターを用いて発光光を取得します。植物を含む皿から蓋を取り出し、対物レンズの下に置きます。植物からの蛍光シグナルを確認します。
その後、植物が新しい環境条件に適応されるまで、暗闇の中で約30分待ちます。視野の植物全体を見るために焦点と拡大を調整します。次に、取得パラメータを設定して、顕微鏡イメージングソフトウェアを用いて蛍光シグナルを検出する。
記録時間を11分に設定します。実験開始前に5分間画像を用いて、植物を顕微鏡から青色光照射に順応させ、次いで記録を開始する。平均ベースライン蛍光記録を決定するために、創傷またはグルタミン酸塗布の前に少なくとも10フレーム。
創傷誘発性細胞質カルシウムイオン及び無熱刺激性グルタミン酸濃度変化のリアルタイム画像化のために、葉L1のペチオールまたは中間領域をはさみで切断する。グルタミン酸誘発細胞体カルシウム変化のリアルタイムイメージングでは、葉L1の先端から主静脈を横切ってハサミで約1ミリメートルカットする。少なくとも20分後、葉の切断面に100ミリモルグルタミン酸の10マイクロリットルを適用する。
時間の経過に関する蛍光強度解析では、蛍光強度を分析する場所で対象領域を定義します。カルシウム波の速度計算に 2 つの ROI を定義します。イメージングソフトウェアで時間測定をクリックし、定義して円を描きます。
注釈と測定、長さと単純な線をクリックして、2つの領域間の距離を測定します。測定をクリックして各ROIの生の蛍光値を時間をかけて測定し、その生データをスプレッドシートソフトウェアにエクスポートして、各時点で蛍光信号を数値に変換します。Fゼロとして占めるベースライン蛍光値を、記録されたデータの最初の10フレームにわたって平均Fを計算し、次にテキスト原稿に記載されているようにFデータを正規化して決定する。
カルシウム速度波解析では、事前に刺激された値より大きなシグナル上昇点を、各ROIのカルシウム増加の検出を表すものとして定義します。2つのROI間のカルシウム増加の時間差とそれらの間の距離を計算して、カルシウム波の速度を決定します。細胞体カルシウムイオンおよび再生不良性グルタミン酸の濃度における創傷誘発変化の伝播をここに示す。
GCaMP-3を発現する植物で葉のペチオールを切断すると、カルシウムの有意な増加につながった。それは局所的に誘発され、その後、血管系全体に広がった。信号は数分以内に隣接する葉に急速に伝播した。
葉と植物を切断して基本的なキチナーゼI接着剤スニファーを発現すると、切り出し領域の周りに急速な再生不良性グルタミン酸増加が観察された。数分以内に、信号も脈管系を通って伝播した。グルタミン酸の適用によって引き起こされるカルシウムシグナル伝搬のリアルタイムイメージングのために、CCaMP-3を発現する植物における葉の縁を切断した。
これは局所的な細胞体カルシウムイオン濃度の増加を引き起こしたが、数分以内にシグナルが消失した。約10分後、グルタミン酸を切断面に塗布し、細胞質カルシウムの濃度を急激に局所的に増加させ、次にこのシグナルを遠位葉に伝播させた。全身葉での創傷によって誘導される固体カルシウム濃度の内部変化を測定するために、GCaMP-3シグナル強度の経時変化を対象とする2つの領域で測定した。
機械的損傷に対するアポプラスチックグルタミン酸濃度変化も測定した。グルタミン酸シグネチャは、創傷後約100秒で単一のピークを示した。この実験は、この環境条件の変化によって上昇するため、温度と湿度の制御条件下で行われるべきです。
このプロトコルは、ラボシグナリングシステムの欠陥要素と推定要素を変異体を使用して、長距離シグナリングの基礎となる分子メカニズムに関する洞察を提供する可能性を提供します。
