パート1：cDNAの蛍光標識マイクロアレイ実験で使用されているのCy3色素は、光分解に敏感です。手順は、光の最小の量で行われるべきである。ラベリングのプロトコールは、マニュアル1 BioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムから翻案されました。 <ol><li>ラベリング反応の試薬は-20℃で保存されていますBioPrimeアレイCGHゲノムラベリングシステムの雪解け2.5Xランダムプライマーバッファ、10X dCTPをミックス、およびヌクレアーゼフリー水から。また、Cy3でdCTPを染料を解凍。解凍後、一時的に使用する前に全ての試薬を軽く遠心する。 </li><li>別のラベリング反応には分析する各cDNAサンプルのために完了する必要があります。 0.6ミリリットル厚肉チューブに86μlの合計量を達成するために500ngのcDNAを、40μlの2.5倍のランダムプライマーのバッファとヌクレアーゼフリー水を加える。 </li><li>よく混和後スピンダウンする。 100で5分間反応をインキュベートしますクラー上でCを。 </li><li>直ちに10分間氷浴のスラリーに反応して転送する。 </li><li>各チューブにして10μlの10X dCTPをミックス、2μlを1mMのCy3でdCTPおよび2μlのエキソKlenow DNAポリメラーゼを追加。エキソKlenow DNAポリメラーゼが必要になるまで冷凍庫ままにしておく必要がありますし、常に氷上で保存する。 </li><li>よく反応を混和後スピンダウンする。 </li><li>サーマルサイクラーで16時間、37℃で反応します。 </li></ol>パート2：標識cDNAの沈殿<ol><li> NimbleGen社のハイブリダイゼーションシステム上のプロトコルの順番に続いて、システムが42℃に平衡化することができます前に、 </li><li>各反応について、1.5 mlチューブにマイクロコンの列を配置します。ラベリング反応（100μl）での内容に続いて、各カラムに300μlの0.1 × SSCを追加。 </li><li> 4℃で10分間16100 × gで列を含むチューブを遠心℃に</li><li>色でわずかにピンクであること、および列に別の300μlの0.1 × SSCを追加することが貫流して、捨ててください。 </li><li> 4℃で10分間、16100 × gで遠心分離を繰り返す℃に</li><li>フロースルーを捨て、カラムに追加の300μlの0.1 × SSCを追加します。 </li><li> 4℃で12分間16100 × gで遠心する℃、 </li><li>フロースルーを捨てる。を通る流れは、この最後の洗浄後に明確にする必要がありますし、カラムにピンクの標識cDNAを見ることができるはずです。 </li><li>カラムに100μlのヌクレアーゼフリー水を適用します。 1.5 mlチューブからカラムを取り外し、新しい1.5 mlチューブにカラムを反転させる。 </li><li> 4℃で2分間2300 × gで遠心する℃、標識cDNAは、チューブの底に収集し、水で再水和されるべきである。 </li><li> DNA濃度を計算し、Cy3の比率にヌクレオチドが23.15を乗じて550分の260の比率に等しいどこ比を染めるために、ベースを計算することにより、染料取り込みを評価するために製造業者の指示に従って光度計ND - 1000分光光度計を使用してください。色素比ベースでは50と80の間でなければなりません。 </li><li> cDNAを十分に標識した場合場合、アリコート6μgのは、新しい1.5 mlチューブに標識cDNA。 </li><li> 3 M NaOAc、pHが5.2とイソプロパノール1Xボリュームの0.1Xボリュームでミックス。混合物を室温で30分間暗所でインキュベートすることができます。 </li><li>次に室温で20分間16100 × gでサンプルを遠心する。 </li><li>カラーでピンクになるはずDNAペレットを、乱すことなく上澄みを注意深く捨てます。 </li><li> 500μlの70％エタノールと静かに転倒混和を追加することにより、エタノールの洗浄を行います。 </li><li>室温で5分間、16100 × gでサンプルを遠心分離します。 </li><li>チューブを反転、上清を除き、ペレットを5分間乾燥させます。希望やプロトコルがハイブリダイゼーションのステップを継続することができる場合は、このステップでペレットを-20℃で保存することができる。 </li></ol>パート3：ハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションの手順は、遺伝子発現解析2のロシュNimbleGenアレイのユーザーガイドを改作したものです。 <ol><li>ヌクレアーゼフリー水を5μlでペレットを溶解する。 </li><li>一度ペレットは、表1に記載されているハイブリダイゼーションのコンポーネントを追加し溶解させる。ハイブリダイゼーションのコンポーネントは、ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットからです。すべてのコンポーネントが追加された後、総容積は、現在18μlを合計してください。良く混和し、手短に下部の内容を収集するためにチューブをスピン。 </li><li>次のステップは、5分間95℃でヒートブロック上に置くことで標識されたcDNAを変性することです。 </li><li>配列は、以下の手順で準備している間すぐにNimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムにチューブを移す。 </li><li>マイクロアレイは、常に慎重に処理され、製造元の指示に従って保存してください。ロシュNimbleGenは、室温で乾燥した暗所で彼らの表現の配列を格納することをお勧めします。 </li><li> NimbleGen社の配列処理のアクセサリーで提供される精密ミキサーアライメントツール（PMAT）に配列を読み込みます。 </li> &lt;LI&gt; PMATにX1のミキサーをロードし、ピンセットが付いている粘着ストリップを削除する。しっかりとPMATを閉じます。 PMATの穴からミキサーへの圧力を適用し、ゆっくり配列とミキサーがPMATから外れるように開きます。 </li><li>しっかりと配列へのシールが完全であることを確認すると、任意の気泡を除去するためにミキサーの外周りbrayerと圧力を適用する。温めるハイブリダイゼーションシステムにアレイミキサー複合体を置きます。 </li><li>変位のピペットを使用して、徐々に充填ポートに標識された試料の15μlを加える。これは、ミキサーの中央に位置する穴です。サンプルは、任意の気泡なしでミキサーを通して均等に広がるようにピペットにゆっくりと着実な圧力を適用する。ポート穴と粘着テープでシールのポートの穴から余分なサンプルを拭き取ります。 </li><li>ラッチを閉じて、NimbleGen社のハイブリダイゼーションのシステムでプログラムBを使用してハイブリダイゼーション溶液の混合を開始。マイクロアレイは、16〜20時間ハイブリダイズすることができます。 </li></ol>パート4：ポストハイブリダイゼーションの洗浄及びマイクロアレイのスキャニング洗浄およびスキャンの手順は、遺伝子発現解析2のロシュNimbleGenアレイのユーザーガイドを改作したものです。 <ol><li>一度ハイブリダイゼーションは、表2に示す洗浄バッファを準備完了に近いです。 42〜プレ暖かい洗浄バッファーのIA℃の水浴でC。 </li><li> GenePix 4000Bアレイスキャナーの電源を入れ、スキャナは使用前に約15分間ウォームアップすることができます。 </li><li>皿に予め温めておいた洗浄バッファーのIAを注ぐ。 </li><li>治具（NimbleGen社の配列処理のアクセサリーに付属）にNimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムとスライドから、アレイミキサー複合体を取り外します。水没の予め温めておいた洗浄バッファーのIAにアセンブリと慎重にスライドから剥離でミキサーを取り外します。 </li><li> Wash BufferをIAで15秒のための治具及び撹拌機からアレイを削除します。 </li><li>すぐに室温の洗浄緩衝液のIBのスライドラックに配列を転送する。 2分間激しくスライドラックに撹拌。 </li><li>洗浄バッファーIIにスライドラックを移し、1分間振とうする。 </li><li> 15秒間洗浄緩衝液IIIおよび撹拌にスライドラックを移す。 </li><li>すべての水分を除去するために2分間スライド乾燥遠心し、スピンに配列を転送します。スキャンに進みます。 </li><li>それは、染料が光とオゾンの両方に敏感なのですぐに配列をスキャンすることをお勧めします。 </li><li> GenePix 4000Bアレイスキャナーに、配列、バーコードを読み込みます。 </li><li> GenePix Proソフトウェアを開き、アレイのスキャンに進みます。ロシュNimbleGenの遺伝子発現アレイは、1つのカラーハイブリダイゼーションの戦略をたてて行う。その結果、唯一の波の長さは、スキャン用に要求される。 532nmのレーザーを使用してCy3の蛍光シグナルをスキャンします。ハードウェア設定]ダイアログボックスを開き、500の値に532nmのレーザーのPMT値を設定します。 </li><li>ハードウェア設定]ダイアログボックスで、100％にパワーを設定し、画素サイズ5ミクロン、平均1〜の行、および0ミクロンに位置を合わせます。 </li><li>プレビュースキャンを実行し、スキャン領域を設定します。 </li><li>スキャン実行。 </li><li>一度のスキャンでは画像のヒストグラムを確認し完了している。理想的には1E - 5正規化数は機能の1〜2％が飽和している65000飽和限界の意味になっているはず。正規化されたカウントが1e - 5より小さい場合、PMTゲインと再スキャンスライドを増加させる。正規化されたカウントが1e - 5よりも大きい場合、PMTゲインと再スキャンスライドを減少させる。 </li><li>一度スキャン画像の保存が完了しています。それは、参照を容易にするための画像のための標準的な命名規則を選択することをお勧めします。画像は、現在データの正規化と強度の値の計算のための好みのデータ解析プログラムに読み込むことができます。 </li></ol>代表的な結果は、まず、0.1 × SSCで洗浄を開始するcDNAのCy3蛍光標識反応の効率を評価するために始めることができます。後続の各洗浄中を通る流れは、明確な連鎖の中の最後の流れと色で小さいピンクになるはず。さらに、Cy3標識cDNA産物は、これらの洗浄ステップの間に列に表示されるはずです。フロースルーの色が明るいピンクであるか、または列にはピンクの製品がない場合、これは標識反応が正常に進行しなかったことを示しています。標識反応は定量的に色素の比率（図1）に標識DNAと塩基の濃度を決定するために光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。ラベリング反応は日常的に我々の研究室でラベルされたDNAの少なくとも10μgを得られます。染料の取り込みをCy3比ヌクレオチドは、23.15を乗じて550分の260の比率に等しいシンプルなベース/染料比を用いて計算することができます。 50から80に至るまでの値は、標識反応に十分な染料の取り込みを示している。ラベリング反応は、マイクにサンプルのハイブリダイゼーション、DNAまたは悪い染料の取り込みの低濃度を生成する場合、roarrayは推奨されていないとラベリング反応が繰り返される必要があります。 ハイブリダイゼーションの質の評価は、画像のヒストグラムとマイクロアレイのスキャンされた画像（図2）を評価することによって行うことができる。許容ハイブリダイゼーションは、500の近くに設定されたPMT値で飽和機能（すなわち、65,000飽和限界で1E - 5の正規化カウントが得られる）の1〜2％になります。 PMT値は65,000飽和限界で1E - 5正規化数を達成するために500から大幅に調整する必要がある場合、これは一般的にマイクロアレイの標識cDNAの貧しい人々のハイブリダイゼーションを示している。このデータはその後の分析を通して継続されている場合、データの品質が構成されます。ハイブリダイゼーションの品質も質的にスキャンされた配列（図3）の画像を表示することにより評価することができる。ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットはCy3 -および配列のアライメント機能にハイブリダイズCy5標識48merオリゴヌクレオチドの位置合わせのオリゴの混合物が含まれています。アレイ上の他の機能へのアライメントオリゴの強度の定性的な評価では、配列に蛍光標識cDNAのハイブリダイゼーション効率の品質チェックを可能にします。さらなる分析に続いて、あなたの分析したデータの散布図は、遺伝子発現の相対レベルを決定するために、差動（図4）あなたのサンプル間で発現される遺伝子を同定するために使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="図1のサムネイル" /> 図1。 cDNAをCy3で標識した。標識cDNA収量および色素の取り込みから光度計のスペクトルは、光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="図1のサムネイル" /> 図2。ハイブリダイゼーションのマイクロアレイスキャン。質のためのGenePixのヒストグラムは、画像のヒストグラムを評価することによって評価することができます。許容ハイブリダイゼーションは、500の近くに設定されたPMT値が65000飽和限界で1E - 5正規化されたカウントで飽和機能の1〜2％になります。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="図3" /> 図3。スキャンしたマイクロアレイ画像。ブリダイゼーションの品質は、マイクロアレイのスキャンした画像を表示することによって評価することができます。画像は、ほこりや機能の蛍光強度の正確な計算を防止するため、各機能の可視化を禁止し、他の干渉要因の存在を検査すべきである。アライメントオリゴの強度は、ハイブリダイゼーション効率を評価するために、アレイ上の他の機能と比較することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="図4" /> 図4。分析されたマイクロアレイ実験の散布図。この手順の目的は、差動あなたのサンプル中で発現される遺伝子を同定することです。マイクロアレイデータをさらに分析し、示差的に発現される遺伝子を可視化するために散布図で表示することができます。 表1。ブリダイゼーションのステップ2で追加するには、ロシュNimbleGenハイブリダイゼーションキットからのコンポーネント。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>サンプル（水に溶解） </td><td> 5μlの</td></tr><tr><td> 2Xハイブリダイゼーションバッファー</td><td> 9μL </td></tr><tr><td>ふたの</td><td> 3.6μL </td></tr><tr><td>アライメントオリゴ</td><td> 0.4μL </td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 18μlの</td></tr></tbody></table> 表2：ハイブリダイゼーション後のアレイの洗浄のために準備するためにバッファを洗浄する。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 洗浄バッファーIA * </td><td> バッファIBを洗う </td><td> 洗浄バッファーII </td><td> ウォッシュバッファーIII </td></tr><tr><td>水</td><td> 225ミリリットル</td><td> 225ミリリットル</td><td> 225ミリリットル</td><td> 225ミリリットル</td></tr><tr><td> 10X Wash BufferをI、II、またはIII </td><td> 25ミリリットル</td><td> 25ミリリットル</td><td> 25ミリリットル</td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25μlの</td><td> 25μlの</td><td> 25μlの</td><td> 25μlの</td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 250ミリリットル</td><td> 250ミリリットル</td><td> 250ミリリットル</td><td> 250ミリリットル</td></tr></tbody></table> * 42〜プリ暖かい° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

ここで詳述するものを含む多くのマイクロアレイのプロトコルは、、ハイブリダイゼーションを測定し、定量化の手段として蛍光染料を使用してください。 Cy3の蛍光色素は、写真とオゾン劣化に敏感である。それは手順が最小限の照明で行われることをお勧めします。さらに、小さなダスト粒子は、ハイブリダイゼーションとスキャニングの妨げになることがあります。特別な注意が作業領...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

遺伝子マイクロアレイ技術はゲノムワイドに転写レベルの定量的測定と遺伝子発現プロファイリングを可能にする。遺伝子マイクロアレイ技術は、疾患の状態への発達段階との関係でグローバルな遺伝子発現解析など、さまざまな用途で多くの生物学的分野、及び毒性応答で使用されています。ここで、我々は包括的なゼブラフィッシュ特異的オリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析のデモンストレーションが含まれています。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイプラットフォームは、ターゲットごとに最大12のプローブと37157目標を問い合わせる385000プローブ、長さ60塩基対が含まれています。このプラットフォームでは、ゼブラフィッシュで使用可能なすべてのcDNAおよびゲノム情報は、Ensemblの（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（を含む様々なゲノムデータベースから収集されたhttp://genome.ucsc.edu）、およびZFIN（http://www.zfin.org）。その結果、この式の配列は、現在のゼブラフィッシュのトランスクリプトームの完全なカバレッジを提供します。ゼブラフィッシュの発現のマイクロアレイは、ロシュNimbleGen（マディソン、WI）によって印刷された。この技術デモは、cDNA産物、マイクロアレイプラットフォームへの標識cDNA産物のハイブリダイゼーション、およびつの色の分析の戦略を使用して信号集録をスキャンする配列の蛍光標識が含まれています。

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

遺伝子のマイクロアレイはゲノムワイドなレベルでの遺伝子発現プロファイリングの強力なツールです。この技術は、発生生物学や毒物学を含む生物学的な分野の様々なアプリケーションを持っています。このビデオでは、我々は詳細ゼブラフィッシュのための包括的なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析用プロトコルを。

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

global-gene-expression-analysis-using-zebrafish-oligonucleotide

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  Purdue University. 遺伝子のマイクロアレイはゲノムワイドなレベルでの遺伝子発現プロファイリングの強力なツールです。この技術は、発生生物学や毒物学を含む生物学的な分野の様々なアプリケーションを持っています。このビデオでは、我々は詳細ゼブラフィッシュのための包括的なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺?...

ビデオ: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...