パート1：TRIzol試薬を用いてトータルRNAの抽出 RNAを扱うときには、RNaseのない環境で動作するように非常に重要です。このようなRNAの手順でのみ使用するために予約されたピペットを持つと手順を開始する前に除染装置試薬（例えば、RNアーゼアウェイ）で作業領域をスプレーのような単純な予防策は非常に有用です。 <ol><li> 1.5mlマイクロチューブにRNAプール50ゼブラフィッシュの胚の十分な量を達成し、ピペットでできるだけ多くの水として削除する。 </li><li>すぐに胚を含んだマイクロ遠心チューブにTRIzol試薬1の250μlを加える。 TRIzol試薬はフェノールが含まれており、唯一のヒュームフードの下で使用する必要があります。 </li><li>組織が十分に中断されるまで、ペレット乳棒（約20ストローク）で胚を溶解し、ホモジナイズする。 </li><li>細胞が十分に均質化されている場合、1mlの総体積と等しくなるように750μlのTRIzol試薬を加える。 </li><li>核タンパク質複合体の完全な解離を許可するには、室温で5分間均質化した試料をインキュベートする。この段階では、サンプルはフラッシュが液体窒素で凍結し、-80℃またはプロトコルを継続することができます保存することもできます。 </li><li>クロロホルム0.2 mlを追加し続けると混合するために15秒間チューブをロックする。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで遠心分離後、室温で2分間サンプルをインキュベートし、℃の</li><li>混合物は、下の赤色のフェノールクロロホルム相、中間相、そして無色の上部の水相に分離します。上部の水相は、RNAが含まれています。最上層は、TRIZOLの初期体積の約60％（約0.6 ml）を含むべきである。相間の層のいずれかを転送しないように注意しながら1 mlのピ​​ペットを使用して新しい微量遠心管に上部の水層を移す。 </li><li> RNAは0.5 mlのイソプロパノールを加える沈殿する。 </li><li>サンプルは室温で10分間座って、その後4℃で10分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離することができます℃をRNAは、チューブの底にゲル状のペレットを形成します。 </li><li>ペレットが剥がれないように、ピペットで上清を除去し、1mlの75％エタノールでペレットを洗浄する。 4℃で5分間7,500 × gで穏やかに転倒し、遠心して、サンプルを混ぜる℃に</li><li>遠心分離後、ピペットでエタノールを除去し、10分間反転しながら、サンプルが乾燥することができます。 </li><li> RNaseフリー水100μlを添加してペレットを再懸濁し、10分間55℃でサンプルをインキュベートする。それは、RNAの水分補給を支援するためにインキュベーション中に頻繁に渦を指することをお勧めします。必要に応じて、ナノドロップND - 1000分光光度計を使用して、サンプルの質と量を確認することができますか、直接次の手順に進みます。 </li></ol>パート2：キアゲンRNeasyミニキットを使用してRNAクリーンアップキアゲン社RNeasyミニキット2は、他のメソッドから単離したRNAサンプルから汚染物質や不純物を除去するのに便利です。この手順では、β-メルカプトエタノール、エタノール、およびヌクレアーゼフリー水はキットに含まれるコンポーネントに加えて必要とされる。オプションのDNase処理は、この手順の実行中に推奨されます。 <ol><li>キットの初回使用時に、バッファのRPEは、Buffer RPEの1ボリュームに100％エタノールの4倍量を加えて調製する必要があります。 </li><li>手続きの日に、のBuffer RLTは新鮮に準備する必要があります。必要とされるのBuffer RLTの合計金額を計算する。 350μlの量は、サンプルごとに必要とされる。のBuffer RLTを準備するには、バッファの各1 mlのβ-メルカプトエタノール10μlを加える。これは、ヒュームフードの下で行われる必要があります。 </li><li>各サンプルにのBuffer RLTおよび100％エタノール250μlの350μlを加える。数回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li>室温で1分間、8,000 xgで2 mlのコレクションチューブと遠心分離機内に配置されRNeasyカラムに、約700μlのあるべきサンプルを、転送する。 </li><li>遠心分離した後、フロースルーを捨てて、RNeasyスピンカラムにBuffer RW1 700μlを加える。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>キアゲンのRNaseフリーDNaseキットによるDNase処理：DNase処理はオプションですが強く、最高品質のサンプルをお勧めします。 <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li>最初にDNase処理のキットを受け取るときには、DNアーゼは550μlヌクレアーゼフリー水を添加してのDNase Iストック溶液を準備しておく必要があります。反転によって静かに混和し、ボルテックスしないでください。ストック溶液の10μlを含む単回使用のバイアルに分注し。は、最大9ヶ月まで-20℃でストック溶液を保存することができます。融解したアリコートを必要に応じて6週間に4℃で保存することができますが、解凍後にアリコートを再凍結しないでください。 </li><li>のDNase Iインキュベーションミックスを準備するには10μlのDNase IをsにRDD 70μlのBufferを加えるサンプルあたりトクソリューション。静かに転倒し、遠心簡単にチューブ残液の形態チューブの側面を収集することによりミックス。直接RNeasyスピンカラムに80μlののDNase Iインキュベーションミックスを追加。室温で30分間DNase処理をインキュベートする。 </li></ol></li><li> DNase処理後に室温で1分間8000 × gでスピンカラムや遠心に350μlのBuffer RW1を追加します。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、スピンカラムに500μlのBuffer RPEを追加。室温で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムに500μlの75％エタノールを加える。 </li><li> 8000 × gで遠心操作を繰り返しますが、室温で2分間。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、列が5分間乾燥させます。 </li><li>すぐにエタノールの痕跡を介して任意の左を削除するには、室温で5分間8000 × gで遠心。 </li><li>遠心分離が完了したら新しい1.5 mlのコレクションチューブにスピンカラムを移し、10μlのヌクレアーゼフリー水を加える。 1分間インキュベートし、次いで室温で1分間10,000 × gで遠心。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>スピンカラムにヌクレアーゼフリー水のさらに10μlを加え、室温で1分間インキュベートする。室温で1分間、10,000 × gでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムを削除し、破棄する。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>製造元の指示に従って光度計ND - 1000分光光度計を用いてRNAの質と量を確認してください。 </li><li>さらに、変性ゲルを実行するか、RNAの完全性をチェックするためにAgilent 2100バイオアナライザを使用してください。 </li><li> cDNA合成を行うことができるようになるまでサンプルを-80℃で保存してください。 </li></ol>パート3：インビトロジェンのSuperScriptファーストストランドシステムを使用してcDNAを合成 RNAが分解につながるアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。その結果、多くの遺伝子発現のプロトコルは、直接RNAから合成され、より安定したcDNA産物を使用するために開発されている。ここでは詳細インビトロジェンのSuperScriptファーストストランド合成システム3を使用して第一鎖cDNAの合成を。それぞれのcDNA合成反応は、5μgのRNAを収容することができます。 <ol><li>手続きのミックスを開始する前に、手短に各コンポーネントを遠心してください。 </li><li>表1に示すように滅菌0.5 mlのマイクロ遠心チューブにRNA /プライマー混合物を準備します。 </li><li> ℃で5分間65℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li>直ちに10分間氷スラリーにサンプルを移す。 </li><li>サンプルは、表2に示す成分とマスターミックスを調製冷却されている間。ボリュームは、1反応あたりに表示されます。反応の合計数に応じてボリュームを調整します。 </li><li>冷却後、各RNA /プライマー混合物に、手順5で調製したマスターミックスの9μlを加える。穏やかに混合し、短時間の遠心分離によって収集。各サンプルの合計量は19μLにする必要があります。 </li><li>サーマルサイクラーで2分間42℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 、各チューブにのSuperScript II RTを1μl（50ユニット）を追加ミックス、および42℃でインキュベートサーマルサイクラーで60分間。 </li><li> 70で反応を終了して℃で15分間、4℃の寒さのサンプルクラーは、手順8および9のためにプログラムすることができます。 </li><li>サンプルは4 ° Cに達した後、氷浴に反応を転送する。 </li><li>氷の上で各試験管にRNase Hを1μlを追加し、37℃で20分間インキュベート℃に総量は、現在21μlです。あなたのサンプルにRNase Hの加算は、RNAテンプレートを低下させ、唯一の一本鎖cDNA産物を残す。 </li></ol>パート4：cDNAの単離と降水量<ol><li> 1.5 mlの位相ロックゲルチューブは、cDNA産物の単離に使用されます。 2分間、12,000 xgで遠心分離によって1.5 mlの位相ロックゲルチューブを準備します。ゲルは、すべてのチューブの底になっているはず。 </li><li> 、（トリス飽和、pHを8.0にバッファリング）81.5μlのフェノール24:1クロロホルムイソアミルアルコールの81.5μL、および位相ロックゲルチューブにサンプル（21μl）を追加します。穏やかに転倒を数回混ぜる。 </li><li>室温で5分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li> cDNAは、上部の水相にする必要があります。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上層を移す。総量は20μlの前後となるはずです。 </li><li> 3 M NaOAc、pHが5.2の1X量を加え、穏やかに混ぜる。上部の水相の体積は20μlに等しいだった場合例えば、、あなたは3 M NaOAc、pHが5.2の2μlを追加する必要があります。 </li><li> 5 mg / mlのグリコーゲンの7μlを加え、穏やかに混合する。 </li><li>イソプロパノールの1X量を加え、穏やかに混ぜる。一般的にこれは、イソプロパノールの約30μlです。 </li><li>サンプルは、部屋のtemperaturでインキュベートすることができますその後10分間eとは、室温で20分間12,000 xgで遠心。 </li><li>小さなcDNAのペレットは、チューブの底に形成すべきである。注意深くピペットで上清を取り除く。 </li><li> 70％エタノールと反転して混合液500μlを追加。 </li><li> 5分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を除去し、70％エタノールで洗浄し、遠心分離を（ステップ10と11）を繰り返します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を取り除く。管の両側に残っている液体がある場合、それは簡単にチューブを回転させて収集することができます。余剰な溶液を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させます。 </li><li>ペレットを溶解するヌクレアーゼフリー水20μlを添加する。ペレットの水分補給のための5分間55℃でサンプルを置きます。 </li><li> cDNA産物の量と質は、製造元の指示に従って、光度計ND - 1000分光光度計を用いてチェックされます。 cDNAは-20℃で保存することができます</li></ol>代表的な結果 RNAのクリーンアップの後、高品質のトータルRNAの約15μgのは50ゼブラフィッシュの胚から期待できる。トータルRNAの品質、分光光度計、ゲル電気泳動、およびAgilent 2100バイオアナライザを評価するために使用することができます。光度計ND - 1000分光光度計は280nm（図1）の吸光度と比較して260nmの吸光度を評価するために使用することができます。 280分の260の比率は、汚染物質の存在を明らかにし、可能な限り劣化の証拠を与えることができます。 260 / 1.9から2.0までの280比率は許容範囲とみなされます。さらに、それは非常にRNAの変性ゲルはRNAの完全性を評価するために実行することをお勧めします。 RNA鎖は小さい鎖はゲルさらに下に移行して、そのサイズに基づいて分離します。非分解サンプルでは、​​2つの強力なバンドとの塗抹標本として表示されます。塗抹標本は、サイズの異なるmRNAの鎖と​​28Sと18SのrRNAのに対応するバンドの人口の結果である。 28Sのバンドは、18Sのバンド（図2）などの約二倍強にする必要があります。また、トータルRNAの完全性は、Agilent 2100バイオアナライザを用いて評価することができる。 28Sと18SのrRNAを表す2つの明確なピークは（図3）期待されています。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。二つの異なるピークが低下した試料では観察されません。劣化を示すRNAサンプルは、その後の実験的な手続きを経て実施されるべきではない。 分光光度分析は、cDNA産物の品質（図4）を評価するために使用することができます。 280分の260は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5μgの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室ではcDNA産物の1〜2μgのをもたらす。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 RNAサンプルの光度計のスペクトル。RNAのクリーンアップの後、RNAの量と質は、光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。高品質のトータルRNAの約15μgのは、日常的に1.9から2.0前後280分の260比で50ゼブラフィッシュ胚から得られたれる。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 RNAの変性ゲル。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、RNAの変性ゲルを実行することができます。 28Sと18SのrRNAに対応する2つの明るいバンドとスミアが期待されている。 28Sのバンドは、18Sのバンドの約2倍強にする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。バイオアナライザによるRNAサンプルのトレース。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、サンプルも、Agilent 2100バイオアナライザで分析することができる。 28Sと18SのrRNAのに対応する2つのシャープなピークが、、目に見えるはずです。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 cDNAサンプルの光度計のスペクトル。光度分析光度計ND - 1000とは、cDNA産物の量と質を評価するために使用することができます。 280分の260の比は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5 UGの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室のcDNA 1-2 UGをもたらす。 表1は、。部品cDNA合成のステップ2でRNA /プライマー混合物について追加する。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>トータルRNA（最大5μgの） </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>の10mM dNTPミックス</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>オリゴ（dT）12-18（0.5μg/μLの） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> μL のn </td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 10μlの</td></tr></tbody></table> cDNA合成のステップ5の表2。反応混合物。記載されているボリュームは、反応毎にあります。反応の総数については、各成分の量を増やします。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 25 mMのMgCl2を</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 0.1 mMのDTT </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1μL </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RNA分子の脆弱性は、このプロトコルを通じて忘れてはならない最も重要な考慮事項です。 RNaseフリーである滅菌装置は、常に研究室のRNaseフリーゾーンで使用する必要があります。 RNAのみの手続きに使用する実験室の一部を確保しておくと便利です。この領域は頻繁にアウェイなどRNaseなどRNアーゼ除去製品、を散布してください。 RNAサンプルは常に手袋を使用して処理し、劣化を防ぐため?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

多くの重要かつ複雑な実験手順は、高品質でインタクトなRNAの入力が必要です。劣化したサンプルや不純物の存在は、下流の実験的なアプリケーションでは悲惨な結果につながることができます。それは、優れたサンプルを確保するために多数の保護及び品質管理チェックと固体のテクニックを使用するために最も重要なこと、それゆえです。ここで、我々詳細商用RNA単離キットを用いてDNAと不純物の痕跡を除去するために市販の化学変性剤とそれに続くクリーンアップを使用して全体のゼブラフィッシュの胚からトータルRNAを分離するためのプロトコル。としてRNAは、直接RNA鋳型から合成されたcDNA産物を使用するほとんどのプロトコルはアッセイの遺伝子の発現は比較的不安定で、RNアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。我々は、詳細手順を市販のキットを使用して、より安定したcDNA産物にRNAに変換する。これらの手順を通して、サンプルは劣化や汚染がないことを保証するために数多くの品質管理チェックがあります。これらのプロトコルの最終製品は、マイクロアレイ解析、RT - PCRまたは長期保存に適しているcDNAである。

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

37.7K ビュー.  Purdue University. 高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...