この作品は、ZSにNIHとPKD財団によってサポートされていました。全ての動物実験は、イェール大学動物資源センター（YARC）と動物実験の使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行った。

パート1：マイクロピペットの準備、およびマイクロインジェクションチャンバープレート<ol><li>加熱とマイクロピペットプラー装置でホウケイ酸ガラス毛細管（世界プレシジョンインスツルメンツ社、1B100 - 4）を引いて（サッターインスツル株式会社、フレーミング/ブラウンP - 97）でマイクロピペットを作製。粘土や粘着テープの少量の上にペトリ皿に保管してください。 </li><li>注入中に胚を保持するための簡単な方法（&quot;ゼブラブック&quot;で説明したように）となるくさび形トラフで成形された1 × E3培地プレートに1.5％アガロース（アメリカンBioanlytical、（株）、AB00972 - 00500）を注ぐ（1）寒天チャンバープレートは4℃で使用してストアする前に固化してみましょう</li></ol>パート2：RNAの調製遺伝子機能研究のための一つの強力なアプローチは、ゼブラフィッシュ胚のin vitro転写されたキャップRNA に微量注射することです。キャップRNAは、CAPのアナログの存在のために生体内で見られる真核生物のmRNAと同じように振る舞います。ゼブラフィッシュ研究者が日常的に興味のある遺伝子を過剰発現またはmisexpressにこのメソッドを使用しています。このデモでは、EGFP -タグ付き写しを顕微注入するだろうし、成功した注射のための可視読み出しとしてライブ全体の胚のGFP -式を使用します。 <ol><li>興味のある成績証明書に関する in vitro CAP RNAの転写反応で行います。私たちの研究室では、我々は日常的にpCS2 +ベクターに目的のcDNAを挿入し、mMessage mMachine SP6キット（Ambion社、（株）、AM1340）を用いてキャップRNAの大量の in vitro合成反応で行います。 </li><li> RNeasyミニキット（キアゲン社、74104）を介して実行するか、またはフェノールによるRNAサンプルを浄化：クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿。 </li><li>慎重に使用するための準備ができるまで-80℃でRNA調製とストアの濃度を決定する。 </li><li>注射の日に、RNAサンプルを解凍、軽くボルテックスし、手短にスピンダウン。 </li><li> 0.050パーセントフェノールレッド（シグマ - アルドリッチ社、P0290） - 滅菌水と0.025の最終濃度で希釈標準溶液を準備します。フェノールレッドは、胚への溶液の注入のための可視マーカーとして機能します。この記事では、我々は0.050％フェノールレッドでは100 ng / uLのEGFPのmRNAの希釈標準溶液を準備します。 </li><li> -80℃に氷とリターンRNAの株式の実際のサンプルを続ける</li><li>ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます。 </li></ol>パート3：モルホリノの準備モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを広く対象となるタンパク質の翻訳をブロックすることにより、またはpre - mRNAのスプライシング2,3を変更することによって遺伝子発現を変更するために使用されます。ゼブラフィッシュのモルフォは、遺伝子機能をノックダウンにより、強力な逆遺伝学のツールと​​して機能します。この記事では、PKD2の翻訳開始部位（5&#39; - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3&#39;）をターゲットにモルホリノオリゴを顕微注入するでしょう。以前に確立された作業に基づいて、我々は、注入された胚の表現型PKD2変異魚4を模倣することを期待しています。 <ol><li>我々は日常的に特にジーンツールから目的の遺伝子、LLC（フィロマス、OR）のために設計されたモルホリノオリゴの300 nmolのを注文。 </li><li> 3mMのストック溶液を作るために100μLの滅菌水を追加。使用直前まで-20℃で分注しソリューションとストア。 </li><li>注射の日に、65℃モルホリノソリューションを加熱し5分間° C。直ちに氷上で冷却パチンと簡単にスピン。このステップでは、オリゴ内の任意の二次構造を変性し、溶液を完全に可溶化されることが保証されます。 </li><li> 0.050パーセントフェノールレッド - 滅菌水と0.025の最終濃度でモルホリノ溶液を希釈することにより、ワーキング溶液を調製。このデモでは、我々は0.050％フェノールレッドで0.50 mmのPKD2モルホリノのワーキング溶液を調製する。 </li><li>室温でソリューションを働き続ける。 </li><li>ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます.---- </li></ol>パート4：正常に機能するソリューションとマイクロピペットを充填<ol><li>鉗子または50倍の倍率で解剖顕微鏡（ニコンインスツルメンツ社、SM2645）の下に見えるように開口部を作成するために外科的黒人とマイクロピペットの先端チップをカット。 </li><li>カバースリップ上にドロップなどの作業溶液2 ULを置きます。 </li><li>皮下注射針と少し浸しワーキング溶液がドロップにマイクロピペットの先端チップを上にチューブを装着した5 mLの注射器にマイクロピペットの背面に取り付けます。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。 </li><li>シリンジのプランジャーを引いて、マイクロピペットの先端を通して実用的なソリューションをサイフォン。 </li></ol>パート5：マイクロピペットの注入量のキャリブレーション<ol><li>マイクロメータのスライド上にミネラルオイルを一滴（アメリカンバイオアナリティカル社、AB00921 - 00025）（Fiを置きますシェール、12 - 561 - SM1）。 </li><li>圧力パルスマイクロインジェクター装置（世界プレシジョンインスツル株式会社、PV830）の電源とエアの供給をオンにします。 </li><li>マイクロインジェクタの装置のマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを取り付けます。マイクロインジェクタは、圧力調節と放電がフットペダルを押すことによって活性化されています。 </li><li>解剖顕微鏡下で、マイクロメートルの油の上に、作業溶液の液滴を配置するマイクロインジェクターを使用して注入量をテストします。それはオイルの上に球のようにfloatとしてドロップの直径を測定する。 </li><li>持続時間と慎重に注入してボリュームを校正するために注射の圧力を調整します。このステップでは、マイクロインジェクションの実験の再現性にも役立ちます。このデモでは、すべてのmicroinjectionsは0.15ミリ（体積で約1.76 NL）の液滴直径で行われます。 </li><li>あなたの注入量が校正された後、埋め戻しとマイクロピペットの漏洩を防ぐために、マイクロインジェクターの&quot;ホールド&quot;ノブを使用してください。 </li></ol>第6部：マイクロインジェクションのための準備受精ゼブラフィッシュの胚<ol><li>ゼブラフィッシュは、ランダムに毎朝の最初の数時間でかん合します。 1セルの段階で胚を収集し、1X E3培地に置いてください。 </li><li> 3mLの転送ピペット（ベクトンディッキンソン実験器具、357524）を使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートのくさび形の谷に沿って胚を手配する。 </li><li>胚が浅く水没し、浸水されないようにメディアを取り外します。このステップでは、同様にマイクロピペットで絨毛膜の浸透のように谷の底部に胚の解決に役立ちます。 </li></ol>パート7：絨毛膜を介してマイクロインジェクション<ol><li> 1細胞期胚の細胞質は解剖顕微鏡下で見えるようにマイクロピペットで胚を操作する。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。 </li><li>胚に注入するために、絨毛膜し、マイクロピペットと卵黄を貫通する。このデモでは、我々はまず最初に、直接セルの下に卵黄にマイクロインジェクションし、細胞内に実用的なソリューションをもたらすために細胞質の流れと拡散を許​​可されます。この流れは、ワーキング溶液に添加し、フェノールレッドによる可視です。 </li><li>我々はまた、細胞の細胞質に直接注入のデモンストレーションを行います。適切な胚の向きとマイクロインジェクション技術が要求されるようにセルに直接マイクロインジェクションは、より堅牢なだけ時間がかかります。細胞膜は、卵黄の膜よりも厳格であるとして、それは細胞の細胞質に到達するための卵黄を介してマイクロピペットを入力することが多い高速です。トラフの底部に向かって動物極の向きや安定した手での作業は、注入のこの方法で助けることができる。 </li><li>マイクロインジェクションした後、E3培地とシャーレに胚を置いて、28.5でそれらをインキュベート° Cの正常な発達のために。 </li><li>胚発生の次の数時間、数日にわたって、目的の表現型の胚を観察。 </li></ol>パート8：代表的な結果 EGFPのmRNAの過剰発現：マイクロインジェクションの成功を確認するには、我々 は 、in vivo全胚蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、MZFLIII） のことでシールドのステージ（〜6 HPF）で始まる胚におけるGFPの発現を監視します。構築物の発現は、胚発生の初期の事象の間に最も強く、注入キャップRNAが徐々に低下し、発現タンパク質の安定性に依存するため、多くの場合、開発中に低下します。 PKD2モルホリノを翻訳ブロッキング： - 3 DPF 4以前に公表された結果に基づき、我々は約2でPKD2変異ゼブラフィッシュと現在の腎臓の嚢胞に見られるように背側体軸の曲率を模倣するPKD2 morphantsを期待する。 <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="図1" /> 図1：EGFP mRNAおよびPKD2 AUGモルホリノのマイクロインジェクションから代表的な結果。 （A）TABの胚は、EGFPのmRNAの0.17 ngで、1細胞期にマイクロインジェクションし、in vivoで GFPの発現で 1 DPFで可視化した。 （B、C）TABの胚は0.50 mMでPKD2翻訳ブロッキングモルホリノの約1.7 NLで、1セルの段階でマイクロインジェクションし、4 DPFで背側の体の曲率のためにスコア化した。

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

ゼブラフィッシュ胚に微量注入は開発中の特定の遺伝子の役割を探索するための十分に確立し、堅牢なテクニックです。アプリケーションでは、過剰発現、misexpression、および目的の遺伝子だけでなく、複数の遺伝子間のエピスタシスの解析のノックダウンアッセイが含まれています。ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションは広くトランスジェニック動物の生成、および初期の胞胚胚...

他のすべての材料は、プロトコルに記載されています。

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

開発中に遺伝子の役割を調査するための不可欠なツールには、遺伝子ノックダウン、過剰発現、およびmisexpressionの研究を実行する機能です。ゼブラフィッシュの（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）、胚にRNA、DNA、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび他の小分子のマイクロインジェクションは、研究者に遺伝子機能を探索するための迅速かつ堅牢なアッセイを提供する<em&gt; in vivoで</em&gt;。このビデオの記事では、我々は準備して顕微注入する方法を紹介します<em&gt; in vitroで</em&gt;合成されたEGFPのmRNAと翻訳ノンブロッキングモルホリノオリゴに対する<em&gt; PKD2</em&gt;、1細胞期のゼブラフィッシュの胚への常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、に関連する遺伝子。私たちは、その後、GFPの発現と表現型の解析を検証することによってmRNAおよびモルホリノmicroinjectionsの成功を分析する。この技術の広範なアプリケーションが生成するトランスジェニック動物および生殖系列キメラ、細胞運命のマッピングおよび遺伝子のスクリーニングが含まれています。ここに我々は、EGFPとノックダウンのの過剰発現のためのプロトコルを記述する<em&gt; PKD2</em&gt; mRNAとモルフォリノオリゴヌクレオチドを​​注入して。

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Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K ビュー.  Yale University School of Medicine. マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。

ビデオ: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.