サミールハムダンは、この技術の開発に支援。E.を大腸菌のタンパク質は、教授ニックディクソンの研究室からウーロンゴン大学であり、T7タンパク質は、教授チャールズリチャードソン、ハーバードメディカルスクールからです。作品は、国立衛生研究所（AMvOにGM077248）とジェーン棺チャイルズ財団（JJL）によってサポートされています。

単一分子の複製の実験を行う前に、いくつかの材料は、事前に準備する必要があります。 1。 DNA複製のテンプレート複製反応の基質は、標準的な分子生物学技術の1,2を用いて調製したビオチン化、両側M13ローリングサークルです。 材料：M13mp18一本鎖DNA、ビオチン尾のオリゴヌクレオチドプライマー（5&#39; -ビオチン- T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT - 3&#39;）、T7 DNAポリメラーゼ、ヒートブロック、アミルフェノール/アルコール/クロロホルム<ol><li> TBSバッファー（330 nMの尾オリゴ、33 nMのM13）のオリゴの10倍過剰を追加することでM13にビオチン尾オリゴをアニール。 </li><li>混合物に65℃のヒートブロックで加熱する。一度加熱し、ヒートブロックをオフにし、徐冷が適切にプライマーをアニールすることができます。 </li><li> 64 nMのT7 DNAポリメラーゼやdNTPおよびMgCl 2を含有する T7レプリケーションバッファの混合物にプライミングM13を追加。 </li><li> 12分間37℃で反応をインキュベートし、100mMのEDTAで急冷。 </li><li>精製記入済みの製品のDNAフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、TE緩衝液または他の適切な保存バッファーに透析し、DNA濃度（M13をプライム、残留を回復するために、各有機相を逆抽出）を決定した。 </li><li>テンプレートの準備の1回の繰り返しは容易に単一分子実験の数百〜数千のために十分な、ナノモル濃度のテンプレートのいくつかのミリリットルを行うことができます。 </li></ol> 2。官能化されたカバーグラスガラスのカバースリップにDNAを取り付けるために、ガラスはまずビオチン化PEGの分子に結合されてアミノシラン、で官能れる。このコーティングは、表面1,3とDNAと複製タンパク質の非特異的な相互作用を低減することができます。 材料：ガラスのカバーガラス、染色瓶、3 -アミノプロピルトリエトキシシラン、メトキシPEG5k - NHSエステル、ビオチン- PEG5k - NHSester、アセトン、1M KOH、エタノール、オーブン、バス音波処理<ol><li> jarファイルを染色し、エタノールで瓶を充填に配置することにより、ガラス製カバースリップを徹底的に清掃してください。 30分間超音波洗浄し、瓶を洗浄し、1 M KOHで埋める。両方の洗浄を繰り返して30分間超音波洗浄器にかけます。 </li><li>第一機能化反応の場合は、水のすべての痕跡を削除する必要があります。 10分間アセトンと超音波処理してjarを埋める。アセトンで再びjarをすすいでください。 </li><li>アセトンでシラン試薬の2％v / v溶液を準備します。染色瓶に追加し、2分間振とうする。この反応は、カップルガラスにアミノシランのアルコキシ基を、次のカップリングステップの反応性アミンを残して。水の大過剰の反応をクエンチ。 </li><li> 110℃で30分間オーブンで焼成することによってカバースリップを乾かします。 </li><li> 100mMのNaHCO 3で pHを8.2にビオチンPEGの混合物：50:1メトキシを準備します。約0.2％w / vのビオチン化PEGを目指す。 </li><li>乾燥したシラン化カバースリップと場所の上に別のカバースリップ上にPEG混合物の100μL添加します。ガラスのカバースリップのスペーサーを含めると、カバースリップの分離が可能になります。 </li><li> 3時間のPEG溶液中でカバーグラスをインキュベートし、カバーガラスの各ペアを分離し、水で広範囲に洗ってください。一度だけの側として側を上に官能カバースリップがPEGでコーティングされるように十分注意してください。 </li><li>真空下でカバースリップとストアを乾かします。表面は、少なくとも月には安定なので、カバースリップの数十はバッチで行われ、必要に応じて使用することができます。 </li></ol>これらの材料は、事前に行われ、その後、各実験に使用する必要があります。すべての単一分子実験を開始するには、フローチャンバーを組み立てることから始めます。 3。フローチャンバーの準備実験は、官能カバー、両面テープ、石英スライドとチューブで構成されたシンプルなフローチャンバーを使用して実行されます。つのフローチャンバーは、それぞれの単一分子実験1,4のために準備されます。 材料：両面テープ、レーザーブレード、チューブ、クイックドライエポキシ用の穴を持つ石英スライド、官能カバースリップ（上記参照）、ストレプトアビジン溶液（PBS中の1 mg / mLの25μL）、チューブ、ブロッキング緩衝液（20mMトリスpH7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl、0.2 mg / mLのBSA、0.005％のTween - 20） <ol><li>後の手順については、気泡を除去するデシケーター中でブロッキングバッファーの20-25 mLを置くことによって始めます。 </li><li>表面上のPBSに希釈したストレプトアビジン液のPEG -官能化されたカバースリップと広がり125を取る。ストレプトアビジンは、表面のビオチンを結合させること、チャンバーの他の部分を準備しながら20分間インキュベートするために、このままにしておきます。 </li><li>ダブルサイドの部分をカットdは、テープ石英スライドのサイズを一致させる。フローチャンバーの概略をテープ（1 mg / ml）の上に描画できるように、鉛筆とテープ上のチューブの穴の位置をマークします。 </li><li>穴の周囲2mmの幅の長方形を作る。これは、流路として機能するので、チューブの入口と出口の周りにストレート側面を作り、部屋を出るようにしてください。必要に応じて、複数のチャネルまたは異なるサイズを使用することができます。 </li><li>チャンネルに無接着剤突出していることを確認してまっすぐ、きれいな削減を行って、描かれた輪郭に沿ってカット。 </li><li>徹底的に前のフローセルの構造から接着剤を除去するためアセトンまたはエタノールを用いて石英を清掃してください。 </li><li>チャンネルの概略の最高のアラインメントを見つける、粘着の片側を取り外し、慎重に石英スライドの上にテープを配置。入口と出口の穴がブロック解除を維持する必要があるとして、適切にテープを揃えるように注意してください。 </li><li>フローセルの入口と出口のためにチューブの長さをカット。それは、チューブがチャンバーの底部に対して平らに押ししないように約30 °の角度でチューブの端をカットするのに役立ちます。次のステップでフローセルに簡単に添付ファイルのためにそれらを中断するためのサポートのいくつかの並べ替えにチューブを置きます。 </li><li>水で十分ストレプトアビジンでコートしたカバースリップをリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させる。片側のみに官能されていることを思い出してください。カバーを裏返しにしないように注意してください。テープの裏の反対側を外し、カバーグラスの上に石英スライドを配置。 </li><li>軽く接着剤に閉じ込められた空気を押し出すためにカバースリップを押してください。これは、流路に入る気泡を防ぐことができます。 </li><li>エポキシ樹脂とチャンバーの両側をシール。エポキシ樹脂と場所の石英とシールの穴にカットチューブを挿入します。これには数分間乾燥させる必要があります。 </li><li>一度乾燥、真空管のいずれかを使用して脱気ブロッキングバッファーの一部を引っ張って表面をブロッキングを開始。 21ゲージの針は0.76 mmのチューブの内部に完全に適合しています。気泡を除去するために数回はフラッシングを行ってください、とチャンバーは少なくとも半時間インキュベートすることができます。 </li></ol> 4。単一分子の複製実験 材料：準備されたフローチャンバー、SYTOXオレンジ、全反射顕微鏡、532nmのレーザー、CCDカメラ、画像取得ソフトウェアとコンピュータ、ローリングサークルDNA基質、複製タンパク質<ol><li>フローセルがブロックされた後、すべてが単一分子実験を開始する準備が整いました。 </li><li>フローセルを取ると、顕微鏡のステージ上に置きます。ステージのクリップのある場所でチャンバーを持ち、流路が直線y軸に沿って配置されていることを確認してください。 </li><li>より大きな直径のコネクタチューブや注射針を使用してシリンジポンプにフローセルの出口管を接続します。ブロッキング緩衝液で口を配置し、チューブ内の空気を除去するために注射器を後方に引いて。出口管の穏やかな映画は、フローセル内に閉じ込められた気泡をクリアするのに役立ちます。 </li><li>ブロッキング緩衝液1mLに25午後の株式DNA鋳型を希釈する。 DNAの良好な表面被覆率を可能にするために適度な流量でチャンバーに流入。 30分間0.025 mL / minではうまく動作します。これは、カバースリップまたはどのように多くの実験のために望まれているのバッチごとに表面にどのように多くのDNA分子に基づいて変化させることができる。 </li><li> DNAがになると、ブロッキング緩衝液を使用して余分なDNAを洗浄。すべての遊離DNAを取り除くために少なくとも200フローセルボリューム用洗浄する。 </li><li>レプリケーションバッファを脱始める。 E.用大腸菌の複製実験、37℃でこれを行う° C加熱されたフローチャンバーで泡のリスクを軽減する。 </li><li>レーザーとカメラの電源を入れます。冷却CCDは、それが使用できる前に温度に到達する必要があります。 </li><li> 37℃の実験を行う場合、上ヒーターの電源を入れます。目的は、フローセルに接触しているか、後でヒートシンクになることを確認してください。 </li><li>洗濯して脱気した後、反応を調製することができる。ミックスヌクレオチド、DTT、およびレプリケーションのバッファにSYTOX。その後、タンパク質を加え、穏やかに混合する。 </li><li>フローセルに反応混合物を流し込む。この流れの速度は、dsDNAを伸ばすのに十分である必要があります。 2 mm幅、100μmの背の高い流路の場合は0.04 mL / minではうまく動作します。 </li><li>混合チャンバーを入力し、イメージングを開始するための時間を確保します。良いヒントは、チャネルの側面に視野を移動し、接着剤に焦点を当てることです。これは、収束するための表面の近くにあるようにします。 </li><li>レーザパワー、顕微鏡のフォーカス、および全反射の角度を調整します。ステンドDNAの任意のphotocleavageを避けるために、低消費電力を維持する。 DNA複製の速度に応じて、数分間の手順1-5フレーム/秒で取得する。必要に応じて、より長いレプリケーション軌跡を得る以上の分子を見るために新しいフィールドに移動するには繰り返す。 </li><li>反応混合物がほとんど空になった後、それはSとより多くのバッファに流れるように良いアイデアです。ビューの他のフィールドを参照するYTOX。別の複製された分子の複数の画像を取ることはprocessivityの決定のための統計情報を提供します。 </li></ol> 5。代表的な結果積極的に複製する分子が容易に染色されたDNAの成長線として見られている。我々の実験では、M13基板25 PMを流れると、ビューの60倍、125μmの× 125μmのフィールド（図1）で100から1000までの分子を与える。 E.を使用して、レプリケーションの実験を行う37 ° C（詳細は資料を参照）で大腸菌 replisomeタンパク質は、視野当たり50から50を複製する分子が得られます。はるかに効率的に基板上に開始するT7 replisome、同等の濃度では、我々はフィールドの複製の分子の&gt; 70％を観測。これらの条件は、個々の分子が解決し、分析することが困難であることが非常に高く、製品の密度を得るため、T7の実験は、より低いタンパク質濃度で実行されます。 データ解析：率のデータを取得するには、単にDNA対時間のエンドポイントをプロットし、傾き（図2）を計算する。 processivityの場合は、DNAの全長を決定する。これらの数字の両方が塩基対に変換する必要があります。実験を行う前に、適切な倍率でカメラのピクセルサイズを知っている必要があります。塩基対の変換、良好な推定のために単に2.9 BP / NM、DNAの結晶長さに基づいて変換しています。しかしながら、層流が完全にDNAを伸ばししません、DNAの長さのキャリブレーションは、既知の長さのDNA、例えば、48502 bpのλDNAを取ってビオチン化オリゴとフローセルに装着し、で、そのSYTOX染色した長さを測定することによって実行する必要がありますので、複製の実験に使用する流量。塩基対/ピクセルの数を決定する複製率とprocessivitiesの正確な計算が可能になります。多数の画像や動画を取ることは速度とprocessivity分布（図2）1のプロットできるように、製品の分子の多数を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：（文献から1。）ローリングサークル複製アッセイの）漫画。 （SA、ストレプトアビジン）。リーディング鎖合成は、円と表面を結ぶ尾を拡張します。尾は、ラギング鎖のポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、層流によって引き伸ばされている。 SYTOXオレンジと532nmの励起とビューのb）の例のフィールド。小さな蛍光スポットが繋留、非レプリケート基質である。製品の極端な長さと、フィールドごとの製品（各フローセル&gt; 5000そのようなフィールドを含む）の数が多いことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：T7（）とEからの典型的な複製の分子の（。文献から適応1）、b）のKymographs 大腸菌 （b）の実験。 C））とb）から分子のエンドポイントの軌跡は、時間に対してプロット。軌道は、レプリケーションの速度を得るために線形回帰が取り付けられています。示した例は99.4塩基対s -1とし、467.1 bpのs -1となります。 D）長さレプリケーション製品のディストリビューション、processivityを得るために、単一の指数関数的減衰に合う：25.3 ± 1.7 kbpの（T7）、85.3 ± 6.1 kbpの（ 大腸菌 ）。 e）は、単一の分子軌道の速度分布は、単一ガウス分布でフィット。手段：75.9 ± 4.8 BPの-1（T7）、535.5 ± 39 BP s -1の（ 大腸菌 ）。

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

一つの重要な制御は、関心の複製蛋白質で、汚れ、SYTOXオレンジの効果を検討している。これを行う簡単な方法は、前述のようにフローセルではなくSYTOXの省略を使用したレプリケーションの実験を行うことです。反応混合物は、チャンバを通って流入した後、DNAを染色し、複製された分子の長さの分布を調べるためにSYTOXでバッファを追加します。また、標準的なバルクの反応は、レプリケーションの速度と効率上SYTOXの任意の効果を確認するために使用することができます。 ここで説明する実験は、単一の流路を使用しています。これは、マルチチャネルのフローチャンバーを作成またはPDMSまたは類似のマイクロ流体デバイスを用いて容易に変更することができます。チャネルの数を増やすと、大幅にタンパク質濃度、変異体、または阻害剤の分子のスクリーニングを容易にし、レプリケーションデータ収集の迅速性を向上させます。 前述のとおり、我々はE.を行います37 大腸菌の複製実験° C、自作アルミフローセルのヒーター、抵抗加熱要素（カートリッジヒーター）と可変電源を使用する。これにより、良好な温度安定性を与え、客観的なヒーターの購入を避けることができます。ヒーターを校正するために、我々は、単に、石英フローセルの上部の中央に穴をあけ流路に熱電対を挿入し、通常どおりバッファを流れた。増加する電圧でフローセルのバッファの温度を測定することは、正確な加熱が可能になります。

T7レプリケーション ：5mMジチオスレイトールと40mMのトリスpH7.5、50mMのグルタミン酸カリウム、10mMの塩化マグネシウム、100μg/ mlのBSA、、600μMのdNTP、300μMATP、300μMのCTP、および15nmのSYTOXオレンジは、直前に追加使用してください。 5nMのGP4（量体）、40 nMのポリメラーゼ（1:1 gp5をサポート：：チオレドキシン）、360 nmのgp2.5 1,5タンパク質として追加しました。 大腸菌の複製：50mMのHEPES pHは7.9、12mMの酢酸マグネシウム、80mMの塩化カリウム、10mMのジチオスレイトールとの100μg/ mLのBSA、40μMのdNTP、200μMrNTPs、および15nmのSYTOXオレンジは、使用直前に加える。タンパク質は、追加として：30 nMのDnaB（量体）、180 nMのDnaC（モノマー）、30 nMのαεθ、15nmのτ2γ1δδ&#39;χψまたはτ3δδ&#39;χψ、30nmのβ（ダイマー）、300 nMのDnaG、250 nMのSSB（四量体）、20nMのPRIA、40 nMのPriB、320nmのPriC、480nmのDNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

我々は、単一分子レベルでのDNA複製を観察するためのシンプルな蛍光顕微鏡ベースのリアルタイム方法を説明します。環状、分岐したDNAテンプレートは、官能ガラスのカバースリップに結合し、複製タンパク質とヌクレオチド（図1）の導入後に広範囲に複製されます。成長している製品の二本鎖DNA（dsDNAが）層流で拡張し、インターカレート色素を用いて可視化される。リアルタイムで成長しているDNAの端の位置を測定することにより、レプリケーションの速度（図2）を正確に決定することができます。さらに、完成したDNA産物の長さは複製のprocessivityに報告します。この実験は非常に容易かつ迅速に実施し、合理的に高感度カメラでのみ蛍光顕微鏡を必要とすることができます。

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K ビュー.  Harvard Medical School. このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

ビデオ: Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

1分子FRETによるDNAループを研究

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.