このレビューはBKCに健康補助金の国立研究所、AI074420 - 02、バローズウェルカム奨励賞、Hirschlキャリア科学賞でサポートされており、NSFバイオフォトニクス科学技術センター、協力協​​定PHY012099、およびTHにUCDの保健システム研究賞がされたUCD CTSC NCRR ULRR024146。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">ブナーらScience 323：。1743年から1747年（2009） 。</a> 1。概要 HIVの細胞間のスプレッドは、もともとドナー細胞と一次CD4 +受容体の細胞は1,2,3のようなTリンパ球としてHIV感染Jurkat細胞を用いて記述されていた。これらの研究では、ウイルスは抗体染色を用いて固定された細胞で検出された。生細胞での細胞から細胞へのウイルスの伝達を追跡するために、我々は、HIVのGag - iGFP 4と呼ばれるHIVの遺伝子組換え、感染性分子クローンを利用する。それは、MAとCAのドメイン間のGagタンパク質に内部的に挿入された緑色蛍光タンパク質（GFP）を運びます。 HIVのこの分子クローンは、ヘルパーウイルスを必要とせずに感染性を保持します。このクローンから作られたウイルス粒子は、化学量論的に細胞間のウイルスのアセンブリとの転送を監視するために強い蛍光シグナルを提供し、緑色蛍光タンパク質がロードされます。不活性細胞トラッキング蛍光色素と組み合わせて使用すると、受容細胞は、入力のドナー細胞と区別し、一感染したT細胞から非感染T細胞5〜HIVの伝達を視覚的に確認できますすることができます。それらは密閉、ガス透過性の撮像室内で培養され、一方のセルから別のウイルスのウイルス学的シナプス形成と伝達は、生きた細胞で観察することができます。 （1日目） 2。 HIVギャグiGFPトランスフェJurkat T細胞の調製<ol><li> Jurkat細胞培養培地中の× 10 5細胞/ mLのは、（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、慎重に2 × 10 5と8の間の濃度で細胞を維持することにより、ヒトCD4 + T細胞株Jurkat（ATCC、マナッサス、VA）を準備100単位/ mLペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン）。成功への鍵：8 × 10 5細胞/ mLを超える濃度でJurkat細胞の培養は、トランスフェクション効率の低下になります。 注：以下に示すようにT細胞へのHIVギャグiGFPプロウイルスDNAのトランスフェクション、、複製コンピテントヒト免疫不全ウイルスの生産の結果。このように、すべての手続きは、認定されたバイオセイフティレベル2 +または生物学的安全性レベル3（BL2 + / BL3）組織培養室では、訓練を受けた検査技師が行うこととなります。イメージング施設における感染性HIVとの作業は、最寄りの機関のバイオセーフティの事務所によって承認されなければならない。 </li><li> Amaxaのnucleofection法（ロンザ、ウォーカー、MD）を用いてウイルスプラスミド、HIVギャグiGFPとJurkatsをトランスフェクション。 150 × gで10分間の遠心分離によってペレット5 × 10 6細胞上清を吸引除去し、緩衝生理食塩水（PBS）滅菌リン酸で細胞を洗う。細胞を遠心分離し、メーカーのサプリメントを含むV予め温めておいた、nucleofectorソリューションの97μLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液にエンドトキシンフリーHIVギャグiGFPプラスミド（1μg/μLの）の三μLを加え、穏やかに混ぜる。プログラムS - 18を使用してキュベットとnucleofectに細胞懸濁液を移す。すぐに抗生物質なしで温めたジャー培養培地3 mlに細胞を移す。 </li><li>ウイルス学的シナプスのためにCD4 +標的細胞を調製するために、我々は標準をFicoll - Paque（GE Healthcare社、ウプサラ、スウェーデン）プロトコルを使用して軟膜からヒト末梢血単核細胞を得る。 CD4 + T細胞は、マイナスの磁気ビーズ分離用キット（Miltenyi Biotec社、オーバーン、カリフォルニア州）を使用して選択されます。これらは、極低温冷凍メディアの5 × 10 6 cells/500μL（90％ウシ胎児serum/10％DMSO）のアリコートにおける液体窒素で保存することができる。解凍した主CD4 + T細胞はIL - 2の10単位/ mLで添加したRPMI、10％FBSで培養される。 </li></ol> （2日目） 3。 HIVギャグiGFPと蛍光色素で標的細胞の染色でトランスフェクションJurkatsから生細胞の回収<ol><li> Jurkat細胞は、一晩トランスフェクションから回復することができます。その後、フィコールHypaque密度勾配の材料を介して遠心分離により細胞破片を除去。 15 mLコニカルチューブの底までをFicoll - Paqueの1.5 mLを分注する。優しくRPMI 5 mLの量で、トランスフェクションJurkatsでこの傾斜材料を重ねます。ブレーキをオフにし、室温で20分間400 xgで細胞を遠心分離します。慎重にピペットを使用してメディア/フィコールインターフェイスからセルを削除する。新しい15 mLコニカルチューブに移す。 10分間、300 xgで15 mLの遠心分離との合計量にRMPIで細胞を希釈する。ウェル2 cmのジャー培養培地3mLの（6ウェルプレート）でペレットを再懸濁し、組織培養インキュベーターにセルを返します。 </li><li>細胞間の伝達実験でドナー細胞から標的細胞を区別するために我々は、蛍光色素でCD4 +標的細胞をprelabel。主なCD4 + T細胞であってもラベルが付いています使用前に優先します。我々は、CellTrackerとCellTrace染料（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）の両方でT細胞を標識する優秀な成功を収めている。色素濃度とインキュベーション時間が使用される特定の色素と細胞の種類に応じて最適化する必要がありますが、代表的なプロトコルは以下の通り。ペレット4 × 10 6主なCD4 + T細胞を10分間、400 × gで回転させて。 PBS 2ml中のPBSに懸濁する5 mLで細胞を洗浄。 1.5μMの最終濃度にCellTrackerオレンジを（CMTMR、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を加え、37℃で20分間℃でインキュベートする。完全なジャーメディアの8 mLを加え、10分間、400 × gで遠心。 IL - 2および組織培養一晩培養器内の場所の10単位/ mLを補充した完全培地3mLに細胞を再懸濁します。 </li></ol> （3日目） 4。生細胞イメージングを用いてHIVの監視の細胞間の転送ギャグiGFP 我々は日常的に48時間トランスフェクション後のHIVギャグiGFPトランスフェクトしたJurkat細胞を使用してください。しかし、我々は成功し、24時間には早くもセルを使用している、と72時間トランスフェクション後のように遅い。 <ol><li>約48時間トランスフェクション後、HIVギャグiGFP Jurkatsを発現する（CO 2の独立したメディア、10％ウシ胎児血清、、数えCO 2 -独立系メディア（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、生細胞イメージングメディアに再懸濁している1〜3 × 10 7細胞/ mLの濃度で100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン、10単位/ mLのIL - 2）。 </li><li>同様の方法で、洗浄および生細胞イメージングメディアの1-3 × 10 7細胞/ mLの濃度で主要なCD4 + T細胞を標識し懸濁します。 </li><li>主なCD4 +扱わ組織培養に1:2または1時03分比と負荷時のT細胞は、ガス透過性、マイクロチャンバー（Ibidi、ベローナ、ウィスコンシン州）との混合感染は、Gag - iGFPトランスフェJurkats。例えば、標識一次CD4 + T細胞の40μLでHIVギャグiGFPトランスフェJurkatsの20μLを混合する。 Ibidi室にこの混合物50μLをロードし、プラグが付いているチャンバーをシール。パラフィルムでプラグ/ Ibidi室のインタフェースをラップしてプラグを固定します。 </li></ol> 5。顕微鏡プラットフォームに関する考慮事項：回転するディスク共焦点イメージング細胞とIbidiイメージングチャンバーをロードした後、我々はすぐに倒立型光学顕微鏡（iX71オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア州）の上にデバイスをマウントします。 Ibidi室は、適切な安全衣服を着てBL2 +訓練された実験室の担当者が顕微鏡に転送する必要があります。生きた細胞のイメージングは​​、一般的に安定した37℃の環境を維持するために高価なインキュベーションチャンバーを使用していますが、これはT型熱電対の先端と一緒に簡単で経済的な恒温器を（ASI 400、Nevtek、ウィリムズヴィル、バージニア州）を用いて達成されたの隣に取り付けられて適切な温度フィードバックのためのサンプル。我々はCO 2 -独立系メディアを使用して発見したCO 2チャンバーの使用を回避しながら、私たちは、高い細胞生存率を維持することができます。部屋の温度の変動に対してプラットフォームをバッファリングすると、背景の部屋の光を遮断するために、大きな黒のシュラウドは、システム周りの断熱エアポケットを作成する全体顕微鏡/ヒーターの設定を介して掛けている。これにより、温度変化とそれに関連する温度に関連するサンプルのドリフトを減少しますが、前にサンプルをマウントするまで30分間予熱を必要とします。 6。データ収集、転送、画像処理画像は、高開口数（NA）非常に解像度を向上させると60倍1.42 NA油浸対物レンズ（UPlanApo N、オリンパス）を用いて撮影されています。 3D共焦点画像を作成するには、スキャンが同時に飛躍的にスキャン速度を向上させる&gt; 800共焦点スポットを使用して、回転するディスク共焦点ユニット（CSU - 10、Yokagawa、日本）によって実行されます。お世辞、その速度をするために、CSU - 10は、光退色や光毒性の両方を削減する、高速、低光のイメージングを可能にする高感度電子乗じ電荷結合素子（EMCCD、IXON + 897、アンドールテクノロジーズ、アイルランド）カメラと対になっています。蛍光光源は、によって選択される所望の波長（488 nm）とレーザーのパワーは右の顕微鏡対物レンズ（&lt;1 mW）の前に測定された多波長ArKrイオンガスレーザー（イノーバ70C、コヒーレント、サンタクララ）は、音響光学波長可変フィルタ（AOTF）、（アンドールテクノロジーズ）。新たに取得した画像をCCD（15-30ミリ秒露光）から配信されている間、さらに退色を軽減し、全体の撮像時間を延長するには、急速にAOTF（マイクロ秒）は、レーザービームからカメラが非アクティブになるたびに（10〜20ミリ秒）をシャットダウンしますコンピュータに。レーザー光は405/488/568/647クワッドバンドダイクロイックミラーを（Semrock、ロチェスター、NY）を使用して回転するディスクのシステムに結合されている。蛍光発光は、フィルターホイール（Ludl電子製品、ホーソーン、ニューヨーク州）の内部に50分の525バンドパスフィルタ（Semrock）を使用してフィルタリングされるマウントBEMCCDカメラと共焦点回転するディスクユニットをetween。 Zステージ（マッドシティ研究所、マディソン、WI）を​​含むすべてのハードウェアと買収は、、アンドールiQのV1.8ソフトウェアによって制御されます。 1.2から1.9秒程度の3D画像スタックでの買収の速度を最大化するために、我々は細胞ペアのすぐ近くにEMCCDのカメラの記録領域をトリミング。さらに、Zの一部の情報を犠牲にして、0.45から0.75μmの間に大きなz -ステップは、買収をスピードアップするために使用することができます。これらの条件下でのイメージングは​​6時間まで持続することができます - 連続20〜60分のセグメントを使用して - 最小限の退色と。画像の数万は取られると完全に、各データセグメントは通常、スペースの5〜20 Gbを占めている。大規模なデータファイルの転送や分析を容易にするために、それぞれ買収セットは、分解し、アンドールiQのV1.8ソフトウェアを使用して1GbのTIFFイメージファイルのセグメントとしてエクスポートする必要があります。ここから、多くの優秀なソフトウェアパッケージは、Metamorph、Volocityすると、ImageJなどの画像解析、（我々はその変化フィジーをお勧めします）をご用意しています。 つの蛍光マーカーが追跡されなければならない時に、我々は、同時に使用することで買収を落とすことなく、それらの両方を記録&quot;分割画面モードを。&quot;両方のマーカーを一度に二つの異なるArKrのレーザライン（多くの場合、488と568 nmの）によって励起される。 EMCCDカメラは、2つの異なるイメージが分離画像スプリッタ（OptoSplit II、ケアン、ケント、イギリス）になる前に直接挿入。各画像は、その後独立して一度、&quot;分割画面&quot;効果を作成することで、カメラで蛍光フィルター（Semrock）と予測される横並びを用いて濾過する。これは、手動トリミングし、後で画像処理で画像の位置合わせが必要になります。 7。画像処理とデータ解析のための考慮事項我々は、通常、Macintoshコンピュータ上でVolocity（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）（アップル社）で画像解析を行う。回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡画像は、最初のVolocityでデコンボリューションし、退色を補正するために彼らの強さに調整されます。ギャグ涙点の強度の測定とトラッキングがVolocity定量化モジュールで実行されます。予め形成されたシナプスの相対運動を計算する必要が画像セットの場合、自動追跡アルゴリズムは、シーケンス全体を通してシナプスボタンを追跡するため採用されている。オートトラッキングソフトウェアで定義された関心領域の手動検査は、ソフトウェアが正しく、目的のオブジェクトを追跡していることを確認するために実行する必要があります。周囲の物体とのコントラストが弱すぎるのオブジェクトの場合は、手動での追跡は、フレームごとに実行することができる。 Volocityソフトウェアパッケージは、XYZの位置、ボリュームと目的のオブジェクト内で統合された信号の輸出が可能になります。追跡対象オブジェクトのシナプスと速度からの距離は、シナプスボタンの中心に動きを正規化することによって計算されます。 8。代表的な結果つを混合10〜15分以内に主要なCD4 + T細胞に接着したJurkat細胞を発現するHIVギャグiGFPを可視化することができるはずです。イメージングこれらの複合体、一synaspe後に感染した細胞でだけでなく、標的細胞のギャグの涙点の動きを評価することができます。一つは、シナプスが形成されている直後に標的細胞にギャグiGFP涙点の動きを観察することがあります。

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、細胞 - 細胞からのHIVの伝達を可視化するための簡単​​な方法を説明します。我々の研究室と他者からの最近の研究では、これがT細胞の間に広がるHIVの主要なモードであることを示唆している。ここで説明する方法は、コア構造タンパク質、ギャグで遺伝的に符号化された緑色蛍光タンパク質タグを運ぶHIVのGag - iGFPと呼ばれるHIVの組換え形態を、採用しています。ために各ウイルス粒子の生産GFPの高いレベルから、HIVのこの複製コンピテントクローンは、リアルタイムで個々のウイルス粒子を追跡する研究が可能になります。このウイルスは、HIVのアセンブリと、細胞間伝達に関する研究で特に有用であると考えられる。 細胞間の転送によるHIVの転送は非常に効率的です。 3時間共培養時には、我々のルーチンは、フローサイトメトリーによって評価されるウイルスは一次T細胞の20〜30％に転送してください。同様の効率は質的に生細胞イメージングの間に見られている。ウイルスに感染したT細胞は、ほぼすぐに共培養開始後感染していない一次T細胞とシナプスを形成し始める。興味深い、すべての主要なT細胞は、レーザーピンセット（未発表の観察、GM）との強制相互作用にもかかわらず、HIV感染Jurkat細胞と対話する機能があります。 HIVギャグiGFPは間違いなく、in vitroおよび in vivo の両方で細胞間の伝達、に最も影響を受けやすいT細胞サブセットを決定するために有用であろう。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

融合することにより自分の好きなタンパク質に緑色蛍光タンパク質は、生物学者は、現在蛍光ビデオ顕微鏡を用いて生きている複雑な細胞プロセスを研究する能力を持っている。ヒト免疫不全ウイルスの細胞間の送信中にヒト免疫不全ウイルスのコアタンパク質の動きを追跡するために、我々はHIVの感染性分子クローンのコンテキストでGagタンパク質をGFP -タグ付きて、HIVのGag - iGFPと呼ばれる。我々は、ビデオ共焦点顕微鏡を使用してこのウイルスのクローンを研究する。以下の可視化実験では、我々はHIVギャグiGFPとヒトT細胞株をトランスフェクトし、我々は、蛍光標識した非感染CD4 + T細胞ウイルスの標的細胞として機能するを使用してください。我々は容易にウイルス学的シナプスと呼ばれる細胞間の構造を介してウイルスの生産と輸送を追うことができる異なる蛍光標識を使用する。シンプルなガス透過イメージング室は、私たちは数分から数日にライブ共焦点顕微鏡でシナプスを観察することができます。これらのアプローチは、彼らは一つの細胞から次へに移動するとウイルスタンパク質を追跡するために使用することができます。

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

この可視化実験では、ライブ共焦点イメージングの実験のためにHIVの蛍光分子クローンを利用するためのガイドです。

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K ビュー.  Mount Sinai School of Medicine. この可視化実験では、ライブ共焦点イメージングの実験のためにHIVの蛍光分子クローンを利用するためのガイドです。

ビデオ: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...